Name: analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis at JoVE.com

No se declaran conflictos de interés.

1. miR-143 y miR-506 transfección
PRECAUCIÓN: Use guantes de látex, gafas protectoras y una capa de laboratorio al realizar los experimentos descritos. Cuando sea necesario, utilizar el gabinete de seguridad de la biotecnología con el ventilador gabinete, sin bloqueo de las vías respiratorias o perturbar el flujo laminar. Siempre ponga la ventana protección de cristal a la altura adecuada, según lo descrito por el fabricante.
<ol><li>Las células A549 NSCLC de semilla un T25 cm2 ...

<ol>
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miRNAs pueden operar como terapias dirigidas para el tratamiento del cáncer, reconociendo la desregulación de los niveles de expresión en enfermos vs los tejidos normales. Este estudio pretende determinar miRNAs que potencialmente detener la progresión del ciclo celular en varias etapas. Se identificó que el miR-143 y miR-506 detener el ciclo celular de las células cancerosas y los protocolos presentados se pretende comprender la actividad de este tratamiento de miRNA combinatoria.
Las m...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
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George Matthaiolampakis
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George Mattheolabakis

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Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

El ciclo celular es una combinación de varios eventos regulatorios que permiten la duplicación del ADN y proliferación celular mediante el proceso mitótico1. Quinasas Ciclina-Dependientes (CDKs) regularan y promoción el ciclo celular2. Entre ellos, el CDK mitótica (CDK1) y la interfase CDKs (CDK2, CDK4 y CDK6) tienen un papel fundamental en el ciclo celular avance3. Proteína del retinoblastoma (Rb) es fosforilada por la CDK4/CDK6 complejos para permitir de la progresión del ciclo celular4y activación de CDK1 es esencial para la exitosa División de la célula5. Numerosos inhibidores de CDK se han desarrollado y evaluado en ensayos clínicos durante las últimas décadas, indicando el potencial de dirigirse las CDKs en tratamiento contra el cáncer. De hecho, tres inhibidores de CDK han sido aprobados para el tratamiento del cáncer de mama recientemente6,7,8,9,10. Así, las CDKs, y en particular, CDK1 y CDK4/6, son de gran interés en la regulación de la progresión del cáncer de la célula.
miRNAs (miRs) son pequeños, no-codificación RNAs y reguladores postranscripcional de la expresión génica, regulación de aproximadamente 30% de todos los genes humanos11. Su actividad se basa en la represión de translación o degradación del mensajero RNAs (mRNAs)12. Ilustrativo de su significación biológica, se han identificado más de 5.000 miRNAs y una molécula de miRNA solo puede regular múltiples genes11,13. Lo más importante, expresión de miRNA se ha asociado con diferentes enfermedades y Estados de enfermedad, incluyendo cáncer13. De hecho, miRNAs se han caracterizado como oncogénicos o supresores de tumor, siendo capaz de promover o suprimir el tumor y14,15. La expresión relativa de miRNAs en los tejidos enfermos puede regular progresión de la enfermedad; así, el suministro exógeno de miRNAs tiene potencial terapéutico.
Cáncer de pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer y más de 60% de todas las malignidades pulmonares son pequeñas células de pulmón cáncer16,17, con una tasa de supervivencia a 5 años de menos del 20%18. El uso de miR-143-3 p y p de miR-506-3 fue evaluado recientemente para apuntar los ciclos celulares de las células de cáncer de pulmón11. miR-143 y miR-506 tienen secuencias complementariedad CDK1 y CDK4/CDK6, y se analizaron los efectos de estos dos miRs en células A549. Los datos experimentales se presentan y discuten en este documento. Expresión génica, la progresión del ciclo celular y la apoptosis fueron evaluadas utilizando diferentes diseños experimentales y los puntos de tiempo después de transfección. Se utilizaron los métodos PCR (RT-qPCR) cuantitativos en tiempo real junto con el análisis de microarrays para medir la expresión de genes específicos, y secuenciación de próxima generación RNA se utilizó para determinar gen global dysregulation11. El último método identifica la abundancia relativa de transcripción de cada gen con alta sensibilidad y reproducibilidad, mientras que miles de genes pueden ser analizadas desde un único análisis experimental. Además, análisis de apoptosis por miRNA tratamiento fue realizada y se describen aquí. Bioinformática complementa el análisis de la vía. Presentados aquí son protocolos utilizados para análisis del terapéutico potencial de la combinatoria de miR-143 y miR-506.
El objetivo principal de este protocolo es identificar los efectos de los miRNAs en células, con un enfoque en el ciclo celular. La variedad de técnicas presentadas aquí útil de análisis de expresión génica novela y traducción antes (usando qPCR) para la elaboración de técnicas para el análisis del gene en el nivel de proteína, tales como análisis de microarrays. Se espera que este informe es útil para los investigadores interesados en trabajar con miRNAs. Además, se presenta una metodología para el análisis cytometric del flujo del ciclo celular y apoptosis de las células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2067px;" width="2066">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">-80 &#176;C Freezer</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">VWR40086A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96 well plate</td>
			<td style="width:210px;">CELLTREAT Scientific&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">50-607-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96-well Microwell Plates&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells</td>
			<td style="width:210px;">ATCC</td>
			<td style="width:1167px;">ATCC&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agarose</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">0710-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:210px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:1167px;">G2938c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA</td>
			<td style="width:210px;">Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:210px;">Gibco</td>
			<td style="width:1167px;">15240-062&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">KAS02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Microscoptics&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">IV-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">New Star Environment LLC</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">ACC058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td>
			<td style="width:210px;">Labconco</td>
			<td style="width:1167px;">342391100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cellquest Pro</td>
			<td style="width:210px;">BD bioscience</td>
			<td style="width:1167px;">Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle&#160; phase and for&#160; calculating the population distribution for the analysis of apoptosis&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CFX96 Real Time System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">CFX96 Optics Module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:210px;">Trevigen</td>
			<td style="width:1167px;">3433-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">FMA050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>VWRL0100-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">DNAse I</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:210px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:1167px;">356006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">05-403-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:210px;">Alfa acar</td>
			<td style="width:1167px;">L07462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">F-12K Nutrient Mixture (Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine, Corning</td>
			<td style="width:210px;">Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">FACS Calibur Flowcytometer</td>
			<td style="width:210px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps</td>
			<td style="width:210px;">Fisherbrand Basix</td>
			<td style="width:1167px;">02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Forma Series II water Jacket CO2 incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Heparin Solution (5000 U/mL)</td>
			<td style="width:210px;">Hospira</td>
			<td style="width:1167px;">NDC#63739-920-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Horixontal Electrophoresis system</td>
			<td style="width:210px;">Benchtop lab system</td>
			<td style="width:1167px;">BT102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-143-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH01315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-506-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH02824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PHC9394&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:210px;">Individual donors</td>
			<td style="width:1167px;">IRB# A15-3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td style="width:210px;">Qiagen</td>
			<td style="width:1167px;">Results: Used for bioinformatics pathway analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td>10-977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">11-668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Loading dye 10X</td>
			<td style="width:210px;">ward&#39;s science+</td>
			<td style="width:1167px;">470024-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Medium M199 (with Earle&#8242;s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td style="width:210px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:1167px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">MU130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Modfit LT</td>
			<td style="width:210px;">Verity Software</td>
			<td style="width:1167px;">Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">NanoDrop one C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:210px;">Gibco by life technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin 10/10</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>B21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power UP sybr green master mix</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:210px;">MP Biochemicals LLC</td>
			<td>IC19545825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Proscanarray HT Microarray scanner</td>
			<td style="width:210px;">Perkin elmer</td>
			<td style="width:1167px;">ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">q PCR optical adhesive cover</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;">4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Quick-RNA Kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribonuclease A from Bovine pancreas</td>
			<td style="width:210px;">Sigma</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">ScanArray Express</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td style="width:1167px;">Step 7.33: Microarray analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Shaker</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470224-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470225-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBS Buffer, 20x liquid</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>10791-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled&#160; centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled micro centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PI23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">AB0800WL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ultra Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">VWR standard solid door laboratory refrigerator</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis

Cáncer de pulmón (LC) es la causa principal de muertes relacionadas con cáncer en todo el mundo. Similares a otras células de cáncer, una característica fundamental de las células del LC es la proliferación no regulada y la división celular. Inhibición de la proliferación por detener la progresión del ciclo celular ha demostrado ser un enfoque prometedor para el tratamiento de cáncer, incluyendo LC.
terapéutica de miRNA se han convertido en reguladores del gen postranscripcional importante y cada vez más están siendo estudiados para su uso en el tratamiento del cáncer. En trabajos recientes, se utilizaron dos miRNAs, miR-143 y miR-506, para regular la progresión del ciclo celular. Células de cáncer (CPCNP) de pulmón de células no pequeñas A549 fueron transfectadas, alteraciones de expresión del gene fueron analizados y finalmente se analizó la actividad apoptótica debido al tratamiento. Downregulation de las quinasas dependientes de ciclina (CDKs) fueron detectados (CDK1, CDK4 y CDK6), y ciclo celular se detiene en las transiciones de fase G1/S y G2/M. Análisis de la vía indican potencial actividad angiogénica del tratamiento, que dota el enfoque de actividad multifacética. Aquí se describe son las metodologías utilizadas para identificar la actividad del miRNA con respecto a la inhibición del ciclo celular, inducción de apoptosis y efectos del tratamiento sobre las células endoteliales por la inhibición de la angiogénesis. Se espera que los métodos presentados aquí apoyará investigaciones futuras sobre terapéutica de miRNA y la actividad correspondiente y que los datos representativos guiará a otros investigadores en análisis experimentales.

Análisis de expresión génica utilizando RT-qPCR y gel electroforesis
Análisis de expresión génica diferencial utilizando RT-qPCR demostraron significativa desregulación de los genes específicos CDK1, CDK4 y CDK6. CDK1 y CDK4/6 fueron demostrados para ser instrumental para la G2/M y las transiciones de G1/S, respectivamente. El análisis realizado permitió comparación directa entre la actividad combinat...

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Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Este método ayudará a entender y realizar las técnicas de laboratorio necesarias para identificar la actividad de dos microARN en las células de cáncer de pulmón in vitro. El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Aquí, presentamos técnicas que abarcan desde metodologías básicas de laboratorio hasta protocolos más complejos, como el análisis de expresión génica y el microARN de proteínas de anticuerpos, específicamente utilizadas para identificar el efecto de las acciones del microRNA.Los siguientes métodos nos ayudarán a responder preguntas clave sobre el efecto de dos microRNAs, microRNA 143 y microRNA 506, en la regulación del ciclo celular en las células de cáncer de pulmón. Presentamos diferentes técnicas de laboratorio, como la transfección celular, la extracción de ARN, la PCR cuantitativa en tiempo real y el análisis de microRNA. Esperamos que nuestra presentación contribuya a completar con éxito estos análisis.En primer lugar, colocar las células cultivadas en un matraz adecuado suficiente para la extracción de ARN y proteínas, para realizar la expresión génica mediante el análisis de qPCR o micro array. Luego incubar durante la noche con medios complementados con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de estreptomicina de penicilina. Al día siguiente, preparar la muestra de microRNA para la transfección diluyendo microRNA 143 y microRNA 506 en medios a una concentración de 100 nanomolares cada uno.Saque el matraz de la incubadora y retire el soporte. Lavar con 1x PBS. Todos los controles no tratados contendrán sólo medios incompletos con células.Incubar las células con medios de transfección durante seis horas en una incubadora. Después de seis horas, retire el soporte y sustitúyalo por cuatro mililitros de medios frescos y completos. Cosecha las células después de 24 horas y 48 horas por tripsinación.A continuación, lavar dos veces con 1x PBS en cada tubo y quitar el sobrenadante. Para realizar la extracción de ARN en un momento posterior, congele las células a menos 80 grados centígrados. La extracción de ARN se realizó utilizando un kit de ARN, siguiendo las instrucciones del fabricante.En primer lugar, retire los tubos de menos 80 grados Centígrados y deje descongelar. Agregue 300 microlitros de tampón de lelisis y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper la membrana celular. Añadir el mismo volumen de etanol 100 por ciento ultrapura.A continuación, mezcle bien y colóquelo en una columna separada. Centrifugar y quitar el flujo a través. Agregue 400 microlitros de lavado y tampón y centrífuga para retirar el tampón.Añadir 5 microlitros de DNAse 1 con 75 microlitros Tampón de digestión VNA en cada muestra, e incubar durante 15 minutos. A continuación, lave la muestra con un tampón de preparación de ARN de 400 microlitrotros. A continuación, lave dos veces con el tampón de lavado de ARN.Ahora, agregue agua sin nucleasas a la columna, centrífuga y luego recoja el ARN. Mida la concentración de ARN. En esta etapa, se pueden enviar dos microgramos de muestra de ARN para la secuenciación de ARN.Preparar el ADNc de acuerdo con el protocolo descrito en la sección de texto, utilizando termociclador. Prepare soluciones de imprimación hacia delante y hacia atrás con agua libre de DNAse RNAse a una concentración de 10 micromolares. Preparar una mezcla maestra para cada gen que se detecte de acuerdo con el número de muestras.Para cada muestra de ADNc, la cantidad de reacción es de acuerdo con la tabla descrita en el texto. Coloque cada muestra en sus respectivos pozos. Para qPCR, siempre es bueno preparar un documento de Excel con 96 diseño de placa de pozo, con el fin de realizar un seguimiento de las muestras.Para cada muestra y gen analizado, realizar su reacción en triplicados, o al menos duplicados. Selle la placa de plástico con sellador de plástico transparente y ópticamente transparente. Evite tocar la fina capa de plástico con los dedos, ya que esto puede producir señal falsa.Gire rápidamente la placa para mezclar todos los reactivos en la parte inferior de sus pozos. A continuación, ejecute la placa de muestra utilizando una máquina de PCR cuantitativa en tiempo real. Obtenga los valores de TC generados por la máquina qPCR y analice la expresión génica relativa.Transfectar las células como se describe en la sección anterior de este video. Cosecha las células de cada muestra en tubos estériles separados de 15 mililitros para la trippsinación. A continuación, lave las células dos veces con 1x PBS, por centrifugación a 751G durante cinco minutos, y luego retire el sobrenadante.Vuelva a suspender y romper la paleta añadiendo 200 microlitros fríos 1x PBS a través de una pipeta. Agregue dos mililitros de etanol helado al 70 por ciento, en el tubo, mientras que vórtice el tubo suavemente para fijar las células. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente y colocarlos en cuatro grados centígrados durante una hora.Retire los tubos de cuatro grados centígrados y centrifugar. Añadir 2ml de PBS helado y vórtice, y luego quitar el sobrenadante por centrifugación. Añadir 500 microlitros de 1x PBS que contengan yoduro propidium y ribonucleasa A con concentración de 50 y 200 microgramos por mililitro, respectivamente, en cada muestra, e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Transfiera las muestras a los tubos apropiados, protegiendo de la luz, y funcione en el citómetro de flujo. Este experimento consiste en identificar todas las proteínas de la vía del ciclo celular que las proteínas cambiaron por el tratamiento del microRNA. Recoger muestras de proteínas de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección de transfección, y cuantificar con el ensayo de BCA.Retire los portaobjetos de menos cuatro grados centígrados una hora antes del experimento para llevar a temperatura ambiente y eliminar la humedad. Tome 70 microgramos de muestras de proteínas y prepare diapositivas de muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que también se describe paso a paso en la sección de texto. Aquí hay que tener en cuenta que el lavado adecuado de los toboganes con agua desionizada ultrapura es otro paso importante, ya que esto ayudará a reducir el fondo de los portaobjetos.Además, es muy crítico en este experimento no secar las diapositivas de muestra hasta el paso final. Por último, escanee la diapositiva utilizando la máquina de micro-array y analice los datos. El análisis qPCR de las muestras tratadas con microARN tuvo lugar para determinar la expresión génica de CDK1, CDK4 y CDK6.Estos genes regulan el ciclo celular de las células normales y cancerosas, y han sido dirigidos como un medio para inhibir la progresión tumoral. Los datos demostraron el efecto a la baja de estos genes debido al tratamiento con microRNA 143 y 506. Los datos de distribución del ciclo celular de la citometría de flujo demostraron un aumento de la población en la fase G0 y G1, y una disminución de la población en la fase S debido al efecto del tratamiento combinatoria de microRNA 143 y 506.El análisis específico de micro-array del ciclo celular detectó cambios en la expresión de proteínas de aproximadamente 60 genes. El mapa de calor representado indicaba la regulación descendente a nivel proteico de múltiples genes necesarios para la progresión del ciclo celular y la proliferación, como CDK2, Helen 1 y 3, RE2F1. Por el contrario, las proteínas comúnmente reconocidas por su efecto inhibitorio cultivado fueron reguladas.Aunque los resultados son semicuantitativos y se requiere un análisis adicional, el análisis de micro-array proporciona una visión general rápida de la actividad de la vía. Creemos que, después de ver este video, usted será capaz de realizar experimentos de laboratorio fundamentales, así como complejos, que le ayudarán en la identificación de la actividad de microARN en las células.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroARN basado biopsia líquida: La experiencia de lo miRNA de Plasma firma clasificador (MSC) para la detección de cáncer de pulmón

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generación y el aislamiento de células de ciclo celular detenido con los Karyotypes complejos

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometría de flujo fosfo con códigos de barra fluorescente de la célula para célula de señalización análisis y descubrimiento de biomarcadores

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

Optimización, diseño y evitamiento de trampas en la inmunohistoquímica fluorescente multiplexación manual

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Medición específica del ciclo celular de la éH2AX y la apoptosis después del estrés genotóxico por citometría de flujo

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Evaluación de la muerte celular utilizando sobrenadante libre de células de probióticos en cultivos esferoides tridimensionales de células de cáncer colorrectal

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...