Name: virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest var et forskningsprojekt finansieret af HIF (humanitært innovationsfond) program for ELHRA (styrkelse af lærings & forskning for humanitær bistand). Forfatterne anerkender de vaske hold, der venligt samarbejdede i denne undersøgelse. Analysen af prøverne i Ecuador blev finansieret af Oxfam Ecuador og Dirección de Investigaciones de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas er en Serra-Hunter-stipendiat ved universitetet i Barcelona.

1. klargøring og emballering
Bemærk: de materialer/det udstyr, der skal pakkes, er anført i tabel 1. Brug handsker til at håndtere de reagenser, der kræves til proceskontrol, koncentrations reagenser, nukleinsyre ekstraktions reagenser og detektionsreagenser. Bær beskyttelsesbriller til at håndtere de reagenser, der kræves til nukleinsyre ekstraktion.
<ol><li>Proceskontrol
	<ol>
<li>Forbered MS2 bakteriophage bestand kultur (American type Culture Col...

<ol>
	<li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).</li><li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).</li><li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques.">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li><li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants,+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water.">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li><li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification.">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li><li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterically+infecting+viruses:+Pathogenicity,+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection.">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li><li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage.">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator.">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li><li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li><li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat,+UV-B+radiation,+and+singlet+oxygen:+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results.">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li><li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay.">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).</li><li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses,+bacteria+and+protozoa.">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li></ol>

Den VirWaTest metode gør det muligt at koncentrationen af vira og nukleinsyre ekstraktion fra vandprøver på det tidspunkt, hvor de ikke-erfarne brugere bruger. Det er en overkommelig, hurtig og enkel protokol. Koncentrationen er baseret på princippet om organisk flokkulering ved hjælp af skummetmælk, hvormed de lave pH-og høje ledningsevneforhold gør skummetmælks proteiner samlet i partikler, hvor virusser adsorberer til. Når partikler sediment, er det let at samle dem, hvilket gør det muligt at koncentrere 10...

I de første faser af en humanitær nødsituation er adgang til rent vandforsyning, sanitet og hygiejne afgørende for de berørte. Derfor er overvågning af vandkvaliteten en prioritet for at forebygge vandbårne udbrud. Det er velkendt, at forurenet vand ofte er oprindelsen af sygdomme, men det er ofte vanskeligt at bestemme kilderne til virus udbrud såsom hepatitis E virus (HEV), selv med tilgængeligheden af konventionelle laboratoriemetoder. Kontrollen af vandkvaliteten er baseret på kvantificeringen af FIB1,2,3,4. Det er imidlertid blevet udførligt dokumenteret, at der ikke er nogen sammenhæng mellem fraværet af FIB og tilstedeværelsen af virale vandbårne patogener som rotavirus (RoV), norovirus (NoV), eller HEV5,6. Anvendelse af vandkvalitets kriterierne baseret på FIB kan således resultere i en undervurdering af risiciene i forbindelse med tilstedeværelsen af vandbårne virale patogener. Overvågning af indikator vira, såsom humane adenoviruser (hadv), eller specifikke patogener ville være nyttigt til at definere eksponeringen for virale patogener og identificere den potentielle kilde til infektion med mennesker7,8, 9,10 og validering af effektiviteten af sanitets foranstaltninger11.
Indtil nu har påvisning af vira i disse scenarier været baseret på faglært personale og kompleks logistik. VirWaTest (virwatest.org) har til formål at udvikle en enkel, overkommelig og bærbar metode til koncentration og efterfølgende påvisning af vira fra vandprøver på brugsstedet.
Virus koncentrationen er baseret på princippet om organisk flokkulering af 10 L vandprøver, hvormed vira genvindes i mindre volumener12,13. Partikler er indsamlet og føjet til en buffer, der af virus og forhindrer nukleinsyre syrer fra nedbrydning, når de opbevares ved stuetemperatur i ikke mere end 2 uger.
Nukleinsyre ekstraktionsmetoden er baseret på brugen af magnetiske partikler, som nukleinsyrer får adsorbet. De kan overføres fra en vaskebuffer til en anden og endelig ind i elueringsbufferen ved hjælp af en magnetisk pipette, som partiklerne binder til. De opnåede virale nukleinsyre-suspensioner kan sendes til et referencelaboratorium, hvor detektionsmetoden kan udføres ved hjælp af molekylære metoder baseret på PCR. For hver nukleinsyre ekstraktion testes to forskellige mængder for at udelukke enzymatisk hæmning, der stammer fra prøven. Alternativt kan PCR-tests med minimal udstyrs tilgængelighed køres på brugsstedet. Hele processen er konstrueret til at blive udført uafhængigt af en strømforsyning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analyse til påvisning af HAdV, der udskilles af mennesker og findes i spildevands prøver i høje koncentrationer, er blevet tilpasset til at blive kørt på anvendelsesstedet. HAdV anvendes som humane fækale virale indikatorer. En PCR til kvantificering af MS2 bakteriophage er også blevet tilpasset, da MS2 anvendes i VirWaTest som proceskontrol. Metoden kan tilpasses til påvisning af eventuelle virus af interesse.
Efter udvikling, den VirWaTest metode er blevet anvendt af brugerne i to forskellige indstillinger i Republikken central Afrika (RCA) og Ecuador, giver feedback om anvendelsen af protokollen i reelle situationer.
Til vores viden, dette er den første procedure, der giver mulighed for koncentration og påvisning af virus på tidspunktet for brug, uafhængigt af enhver strømforsyning, stort udstyr, og frysning/køling betingelser. Det anbefales at indsamle to replikater af hver vandprøve for at opnå solide resultater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1677px;" width="1677">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-14-00001</td>
			<td style="width:989px;">Includes Solis Biodyne&#39;s 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">8-Microtube Strips with Caps</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">840637</td>
			<td>Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Aquagenx CBT E. coli Kit</td>
			<td style="width:195px;">Aquagenx, LLC</td>
			<td style="width:123px;">ECCBT10</td>
			<td>10 Tests per Kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011674</td>
			<td>Includes 12V car power adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket Support</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011648</td>
			<td>Aluminium support</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket, 10 L</td>
			<td style="width:195px;">Cater4You</td>
			<td style="width:123px;">10LTR</td>
			<td>Polypropilene, Tamperproof, Clear color</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Centrifuge Tube, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">CTSP-E50-050</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">1410181211</td>
			<td>Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Clear PET Bottle</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FPET-500-088</td>
			<td style="width:989px;">Clear Color, PET, Cap Not Included</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Difco Skim Milk, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">232100</td>
			<td>Dehydrated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">DNA/RNA Shield, 250 mL</td>
			<td style="width:195px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">R1100-250</td>
			<td>DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Easy9 Pipette Controller</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">EAS9-001-001</td>
			<td>0.3 &#956;m filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030121023</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030120094</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 5 mL</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">999542</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Ethanol 96% V/V, 1 L</td>
			<td style="width:195px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">361085-1611</td>
			<td>For UV, IR&#160; and HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Laboratory Tweezers</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FORS-007-002</td>
			<td>Thin, Curved End, L= 120 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900017000</td>
			<td>Battery-powered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Marker</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">929203</td>
			<td style="width:989px;">Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Micro Rota-Rack for Microtubes</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">37782</td>
			<td>4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Mini8 Real-Time PCR Cycler</td>
			<td style="width:195px;">Coyote Biosciences, China</td>
			<td style="width:123px;">Mini-8</td>
			<td>Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">NucliSens Lysis Buffer</td>
			<td style="width:195px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:123px;">200292</td>
			<td>Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900136N</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">PE Screw Cap PP28</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">TP28-004-020</td>
			<td style="width:989px;">For PET Bottles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">pH Indicator Strip</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">WSPH-001-001</td>
			<td>Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Plastic Test Tube</td>
			<td style="width:195px;">Quimikals</td>
			<td style="width:123px;">300913</td>
			<td>Includes Cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">PIPP-003-500</td>
			<td>Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409726</td>
			<td>Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409526G</td>
			<td>Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Powder Powder Detergent</td>
			<td style="width:195px;">-</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>Regular Powder Soap for washing clothes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Power Cables for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011692</td>
			<td>Connection between batteries and magnetic stirrers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Magnetic Tool</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24001</td>
			<td>Hand-held tool for magnetic particles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Tips in Box</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24296</td>
			<td>RNase-Free, Autoclaved, 96 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">SN51100</td>
			<td>3.2 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sea Salts</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S9883-500G</td>
			<td>An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Silicone Tubing</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">SILT-006-005</td>
			<td>Roll of 5 Meters, Inner&#160; &#248; x Outer&#160; &#248;= 6 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td>
			<td style="width:195px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">28244295</td>
			<td>Pellets, 1 Kg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Solar Rotary Platform</td>
			<td style="width:195px;">SOL-EXPERT Group</td>
			<td style="width:123px;">70020</td>
			<td>Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SOLIScript 1-step Probe Kit</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-57-00250</td>
			<td>Includes Solis Biodyne&#39;s 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">21.141-4197</td>
			<td>Includes BioTools&#39;s BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">045926</td>
			<td>Pivot Ring, L x&#160; &#248; = 38 x 8 mm, Blue</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">PN10E1</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900043</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">22001-4291</td>
			<td>Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Water Molecular Biology Reagent, 1L</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">W4502-1L</td>
			<td>Nuclease and Protease Free, 0.1 &#956;m Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Whirl-Pak Bag, 540 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">200361</td>
			<td>Stable bottom</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Zip Lock Plain Bag</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">BZIP-080-100</td>
			<td>Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples

Vira, der udskilles af mennesker og dyr, kan forurene vandkilder og udgøre en risiko for menneskers sundhed, når dette vand bruges til drikke, vanding af fødevarer, vask osv. Den klassiske fækale bakterie indikator kontrollerer ikke altid for tilstedeværelsen af virale patogener, så påvisning af virale patogener og virale indikatorer er relevant for at vedtage foranstaltninger til risikoreduktion, især i humanitære scenarier og i områder hvor der hyppigt anvendes vandbårne virus udbrud.
På nuværende tidspunkt er flere kommercielle tests, der gør det muligt at kvantificere fækale indikatorbakterier (FIB), tilgængelige til testning på brugsstedet. Sådanne kommercielle tests er dog ikke tilgængelige til påvisning af vira. Påvisning af vira i miljømæssige vandprøver kræver at koncentrere flere liter i mindre mængder. Når det er koncentreret, er påvisning af vira desuden afhængig af metoder som nukleinsyre ekstraktion og molekylær detektion (f. eks. polymerasekæde reaktion [PCR]-baserede assays) af de virale genomer.
Den beskrevne metode gør det muligt at koncentrationen af vira fra 10 L vandprøver, samt udvinding af virale nukleinsyre på tidspunktet for brug, med enkle og bærbare udstyr. Dette gør det muligt at afprøve vandprøver på anvendelsesstedet for flere vira og er nyttige i humanitære scenarier, samt i enhver sammenhæng, hvor et udstyret laboratorium ikke er til rådighed. Alternativt, metoden tillader koncentrering vira til stede i vandprøver og forsendelse af koncentrat til et laboratorium ved stuetemperatur til yderligere analyse.

Metodeudvikling
Denne procedure er blevet udviklet i laboratoriet af vira forurenende stoffer af vand og mad med samarbejde med GenIUL og Oxfam Intermón. Det består af tre forskellige trin. Den første, viral partikelkoncentration, er en tilpasning af en skummetmælk flokkulering metode tidligere beskrevet12,17,18. De...

Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Her præsenterer vi VirWaTest, som er en enkel, overkommelig og bærbar metode til koncentration og påvisning af vira fra vandprøver på tidspunktet for brug.

VirWaTest, en punkt-for-anvendelse metode til påvisning af virus i vandprøver

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Enteriske vira findes for det meste i forskellige vandreservoirer, herunder grundvand, stillvand, vandløb, floder og r vand. De er forbundet med sundhedsrisici og er ansvarlige for infektioner hos mennesker. Enteriske vira forårsager almindeligvis gastroenteritis og overføres for det meste via den fækale-orale rute.Andre vandbårne sygdomme forårsager akut hepatitis ved hepatitis A-virus og hepatitis E-vira, med betydelig forbundet dødelighed, især med hensyn til hepatitis E hos gravide kvinder. Faktiske protokoller til overvågning af vandkvalitet foreslået for humanitære sammenhænge er designet til at holde bakterier som E.Coli som en indikator for fækal forurening. Men det er allerede kendt, at der ikke er nogen sammenhæng med andre mikroorganismer såsom virus, der er mere modstandsdygtige over for mange aktiveringsprocesser.Indtil nu er detektion af virus i humanitære krisemiljøer blevet udført ved at tilpasse eksisterende protokoller til betingelserne i disse sammenhænge og sende prøver til referencelaboratorier til molekylær detektion af virus. Der er behov for metoder til påvisning af virale patogener og virusindikatorer i synspunkterne for at mindske risikoen for folkesundheden, forebygge udbrud og øge effektiviteten af humanitære interventioner. Vi foreslår en metode til påvisning af virus i 10 liter vandprøver, som er opdelt i tre trin: Viral koncentration, nukleinsyre ekstraktion, og viral påvisning.Alle disse trin er blevet tilpasset fra metoder, der i øjeblikket anvendes i vores laboratorium, og kan udføres i synspunktet ved hjælp af bærbare reagenser og udstyr, der producerer de afhængige af strømforsyning og frysere. Der er også tilføjet en konserveringsmiddelopløsning til metoden for at sikre stabiliteten af nukleinsyrer til forsendelse til referencelaboratorier, hvis det er nødvendigt. Den metode, vi foreslår, kaldes VirWaTest og er udviklet i samarbejde med GenIUL og Intermon Oxfam.Inden påbegyndes, bør antallet af prøver, der skal testes, tages i betragtning ved fremstilling af reagenser og materiale. Det anbefales at indsamle to replikater af hver vandprøve for at opnå repræsentative resultater. Flere prøver kan testes på samme tid, hvis den passende mængde materiale er til rådighed.Reagenser og materialer skal tilberedes og pakkes, inden de flyttes eller sendes til det sted, hvor metoden er nødvendig. Listen over materialer og mindre udstyr, der skal pakkes, er beskrevet i tabel et. Der tilbereds et bakteriofage MS2-lager, der skal tilsættes hver vandprøve, som en proceskontrol ved at følge den tilsvarende ISO-metode.Derefter distribueres 10 mikroliter af en suspension, der indeholder 10 til 10 platformenheder, der er fremstillet i 10 ml rør, og lad vandet tørre. Der vil være behov for et rør pr. vandprøve. Derudover forberedes et rør, der indeholder 10 mL sterilt destilleret vand pr. opsamlet prøve.For den forkullede skummetmælksopløsning skal der tilberedes et rør med skummetmælk, en lynlåsplastpose indeholdende havsalt og en plastflaske med destilleret vand. Til pH-justering skal der forberedes et rør, der indeholder citronsyren, et rør, der indeholder natriumhydroxiden, og to plastbeholdere med 25 og 50 mL destilleret vand. For hver vandprøve, der skal testes, forberedes et konditioneringspose ved at tilsætte havsalte og citronsyre til en lynlåsplastpose og en konserveringsopløsning ved at tilsætte lysisbufferen og nukleinsyrekonserveringsan faktisk til et 5 ml rør.Endelig forberede fire neutraliserende breve, tilføje magt vaskemiddel til fire lynlås plastposer. For hver vandprøve, der skal ekstraheres, tilberedes et fem ml rør, der indeholder henholdsvis magnetiske partikler og ethanol, og tre 2 ml rør indeholdende henholdsvis 500, 600 og 200 mikroliter vaskebuffere på henholdsvis et, to og tre og et rør, der indeholder elutionbuffer. To forskellige nukleinsyre ekstraktioner kan analyseres samtidigt i hver PCR-analyse, hvis en Newell termocykator anvendes.For alle PCR-analyser skal du forberede molekylærbiologisk vand. Forbered blandinger, der indeholder to primere, og et bevis, der er specifikt for hver målvirus i henhold til de mængder og koncentrationer, der er beskrevet i protokollen. For hver virus tilsættes de angivne mængder i rør et til otte af en rørbakke.Skær strimlen, divider den i to strimler. Rør et til fem og rør seks til otte. For hver virus, lufttørre DNA suspensioner indeholdende 10 til 5, 10 til 7, og 10 til 9 og kendte kopier pre-lavet i rør seks, syv og otte.Denne koncentrationsprotokol er baseret på princippet om organisk flokkulering, hvorefter den lave pH- og højledningsevnetilstand driver skummetmælksproteinerne til at organisere sig i flocs, som viraene absorberer. Når flocs er afgjort, kan de nemt indsamles. Saml en 10 liters vandprøve i en flad bund spand forsynet med et låg.Hvis der indsamles fra et rør, skal du lade vandet løbe i et par sekunder, før vandet opsamler. Det er vigtigt at bruge klare spande til at visualisere pellets. Kig efter et fladt rum på et friskt sted langt fra direkte sollys Sæt en magnetisk omrører tilsluttet et batteri under spanden støtte og placere spanden indeholder vandprøven på hver støtte.Genoverveje citronsyre og natriumhydroxid og ryste, indtil de er helt opløst. Hæld 500 mL destilleret vand i en stand-up taske og læg posen på en magnetisk omrører. Der tilsættes indholdet af et havsaltpose og indholdet af et skummetmælksrør, og der omrøres i fem minutter ved middel hastighed.PH-chlormos i den flokerede skummetmælk justeres med citronsyre og natriumhydroxid til en pH-pH mellem 3,4 og 3,6. Sluk for den magnetiske omrører, og sørg for, at flocs er synlige. En lommelygte kan hjælpe med at visualisere flocs.Smid en omrøringsmagnet i vandet. Indstil magnetomrøreren ved maksimal hastighed og tænd den. Tilsæt 10 mL destilleret vand til et processtyret rør.Inverter det et par gange og hæld opløsningen i vandet. Hæld indholdet af en prøve konditionering brev i vandet og rør i fem minutter. Sørg for, at vandprøvens pH-pH,som skal være mellem 3,4 og 3,6.Juster pH-3, hvis det er nødvendigt. Der tilsættes 100 mL præ-flokeret skummetmælksopløsning, skovlen forsegles med låget og lad vandet gå i omrøring i otte timer med mindst hastighed. Efter otte timer slukkes den magnetiske omrører, og flocs kan nøjes med mindst fem ekstra timer.Med et system baseret på brug af en pipette controller, et plastrør, og et par pipetter, kassér supernatant, passe på ikke at forstyrre flocs på spanden bunden. Når vandstanden er ved at nå omrøring magnet, klemme plastrøret for at stoppe vandstrømmen og flytte væk pipetten fra spanden. Ryst spanden for at opslænke flocs og hæld dem i en stand-up plastikpose.Lad flocs at nøjes med en ekstra time. Inspirer forsigtigt vandsupernatanten ved hjælp af en pipette, der undgår at forstyrre flokationerne. Inspirer flocs ved hjælp af en pipette og overføre dem til et konisk rør.Det endelige volumen af prøvekoncentratet anbringes, og der overføres 1 ml til et rør, der indeholder konserveringsopløsningen. Suspensionen kan enten bruges til at udføre nukleinsyreekstraktionen i marken eller sendes til et referencelaboratorium til yderligere analyse. Det vand, der kasseres under opsamling af flokationerne, skal behandles inden bortskaffelse.Tilsæt indholdet af et neutraliserende middel pose til spanden indeholder det kasserede vand. Bland vandet og lad det stille i tredive minutter. Derefter bortskaffes det behandlede vand som almindeligt affald.De magnetiske partikler kan overføres fra et rør til et andet ved hjælp af en magnetisk pipette. Vænne sig til driften af en magnetisk pipette, før du udfører ekstraktionen. De rør, der indeholder reagenset, der er nødvendigt for ekstraktion i et stativ.Det vil sige fra venstre mod højre:bindingsbuffer, vaskebuffere og elutionbuffer. Prøvekoncentratet overføres 1 ml prøvekoncentrat til det rør, der indeholder bindingsbufferen, ved hjælp af en engangsplastpipette. Inverter røret ti gange for at optimere opløsningen.Inkuber opløsningen ved stuetemperatur i ti minutter, mens du kontinuerligt blander enten ved hjælp af en solo orbital eller manuelt. Opsaml de magnetiske partikler ved hjælp af en magnetisk pipette og en ren spids, der kan genbruges til de tre vaskepuffere, og slip de magnetiske partikler ind i det rør, der indeholder en vaskebuffer. Vask dem ved forsigtigt at ryste opløsningen med spidsen i 30 sekunder og opsaml dem.Gentag denne vaskeprocedure for vask buffere to og tre. Opsaml de magnetiske partikler i vaskebuffer tre, og slip dem ind i det rør, der indeholder elueringsbufferen. Kassér derefter spidsen.Inkuber opløsningen ved stuetemperatur i fem minutter, mens den blandes kontinuerligt ved hjælp af solo orbitalen. Udskift spidsen på magnetpipetten med en hvilken som helst, og opsaml alle de magnetiske partikler fra elueringsbufferen. Kassér spidsen med partiklerne påsat.Nukleinsyren forbliver i elutionbufferen, som skal opbevares til yderligere analyse eller forsendelse. Brug en fem-rørs og en tre-rørstrimmel parat til at detektere humane adenovirus. Tilsæt vand, PCR mix, og nukleinsyre ekstration til rør en til fem i henhold til protokollen.Bagefter tilsættes vand og PCR mix til rør seks til otte. Sæt begge strimler i termocyleren, og vælg det rigtige løb. Når løbet er færdig, indsamle resultaterne og analysere indhentede data.Først når virustest har resulteret i negativ, ms2-påvisning bør udføres. Brug rørstrimler, der er forberedt til MS2-detektering, og vælg den relevante termiske profil til PCR. Den VirWaTest magnetiske nukleinsyre ekstraktion blev sammenlignet med QIAgen viral RNA, efterlignede det ved at teste vandprøver tilsat humane adenovirus og MS2.Reduktion test p-værdi viser betydeligt højere virale inddrivelser ved hjælp af VirWaTest end QiAgen som en ekstraktionsmetode for begge vira testet. Den udviklede metode til viral koncentration blev afprøvet i marken i samarbejde med Oxfam vaskehold beliggende i Bangui, Den Centralafrikanske Republik og i Pedernales, Ecuador, der indsamlede vandprøver, koncentrerede dem ved at anvende den udviklede koncentrationsmetode, og sendte dem til laboratoriet i Barcelona for nukleinsyre ekstraktion og viral kvantificering. I Ecuador blev humane adenovirus påvist i alle testede prøver, mens en ud af fem prøver, der blev indsamlet og koncentreret i Bangui, blev testet positiv for humane adenovirus.Den udviklede metode har vist sig at være nyttig, da den blev evalueret af vaskehold af Oxfam Intermon i Bangui, Den Centralafrikanske Republik og af et andet hold i Pedernales, Ecuador. VirWaTest kan være en del af et tidligt varslingssystem eller kan anvendes i udbrudsundersøgelse af organisationer, der er involveret i vand sanitet. Dette udstyr letter analysen af virale patogener i vand og forbedring af forvaltningen af vandsikkerheden med det formål at reducere tilfælde af virussygdomme i humanitære krisesituationer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Cost-effektiv metode til Microbial Source Tracking bruge specifikke menneskers og dyrs Vira

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Glas Uld Filtre til at koncentrere Vandbårne Virus og landbrugsskoler zoonotiske patogener

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

En opdateret EPA metode 1623, der bruger Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltrering og Heat dissociationshastigheder trin til Detect Vandbaseret<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Og<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering af en Liquid-dækket kultur Polarized humane luftveje Epitelial Calu-3-celler til at studere Host celle respons på luftvejspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative Analyser for påvisning og karakterisering af Protein Antimikrobielle stoffer

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Hurtig Molekylær Detection og Differentiering af Influenza Virus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling metode til påvisning af menneskelige Norovirus på overflader

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetisk omrører metode til påvisning af<em&gt; trikiner</em&gt; Larver i Muscle Prøver

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...