Name: virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest was een onderzoeksproject gefinancierd door het HIF (humanitair innovatiefonds) programma van ELHRA (het verbeteren van leren & onderzoek voor humanitaire hulp). De auteurs erkennen de WASTEAMS die vriendelijk in deze studie hebben samengewerkt. De analyse van samples in Ecuador werd gefinancierd door Oxfam Ecuador en Dirección de Recheran de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas is een Serra-Hunter Fellow aan de Universiteit van Barcelona.

1. voorbereiding en verpakking
Opmerking: de te verpakken materialen/apparatuur staat in tabel 1. Gebruik handschoenen om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de procesbeheersing, de concentratie reagentia, de nucleïnezuurextractie reagentia en de detectie reagentia. Draag een beschermende bril om de reagentia te hanteren die nodig zijn voor de extractie van nucleïnezuur.
<ol><li>Procescontrole
	<ol>
<li>Bereid ms2 bacteriofaag Stock Culture (Ameri...

<ol>
	<li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).</li><li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).</li><li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques.">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li><li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants,+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water.">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li><li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification.">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li><li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterically+infecting+viruses:+Pathogenicity,+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection.">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li><li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage.">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator.">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li><li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li><li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat,+UV-B+radiation,+and+singlet+oxygen:+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results.">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li><li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay.">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).</li><li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses,+bacteria+and+protozoa.">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li></ol>

De VirWaTest methode maakt de concentratie van virussen en nucleïnezuur extractie van watermonsters op het punt van gebruik door niet-ervaren gebruikers. Het is een betaalbaar, snel en eenvoudig protocol. De concentratie is gebaseerd op het principe van organische flocculatie met behulp van magere melk, waarbij de lage pH-en hoge geleidbaarheids condities het gebruik van magere melkeiwitten in vlokken tot de virussen maken. Wanneer de vlokken sediment, het is gemakkelijk om ze te verzamelen, waardoor het mogelijk om te ...

In de eerste fasen van humanitaire noodsituaties zijn de toegang tot schoon water, sanitaire voorzieningen en hygiëne van cruciaal belang voor het voortbestaan van de betrokkenen. Daarom is het bewaken van de waterkwaliteit een prioriteit om uitbraken van water te voorkomen. Het is bekend dat verontreinigd water vaak de oorsprong van ziekten is, maar het is vaak moeilijk om de bronnen van virale uitbraken zoals het hepatitis E-virus (HEV) te bepalen, zelfs met de beschikbaarheid van conventionele laboratoriummethoden. De controle van de waterkwaliteit is gebaseerd op de kwantificering van FIB1,2,3,4. Er is echter uitgebreid gedocumenteerd dat er geen correlatie is tussen de afwezigheid van FIB en de aanwezigheid van virale watergedragen pathogenen zoals Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) of HEV5,6. Het gebruik van de water kwaliteitscriteria op basis van FIB kan dus leiden tot een onderschatting van de Risico's die verbonden zijn aan de aanwezigheid van watergedragen virale pathogenen. De surveillance van indicator virussen, zoals humane adenovirussen (hadv), of specifieke pathogenen zou nuttig zijn bij het bepalen van de blootstelling aan virale pathogenen en het identificeren van de potentiële bron van menselijke infectie7,8, 9,10 en bij de validering van de werkzaamheid van sanitaire maatregelen11.
Tot nu toe waren de opsporing van virussen in deze scenario's gebaseerd op vakkundig personeel en complexe logistiek. VirWaTest (virwatest.org) is gericht op de ontwikkeling van een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode voor de concentratie en de daaropvolgende opsporing van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.
De virusconcentratie is gebaseerd op het principe van biologische flocculatie van 10 L watermonsters, waardoor virussen worden teruggewonnen in kleinere volumes12,13. De vlokken worden verzameld en toegevoegd aan een buffer die de virussen lyseert en voorkomt de nucleïnezuren van afbraak wanneer ze bewaard bij kamertemperatuur gedurende niet meer dan 2 weken.
De nucleïnezuur extractiemethode is gebaseerd op het gebruik van magnetische deeltjes waaraan de nucleïnezuren worden geadsorreven. Ze kunnen worden overgebracht van de ene spoel buffer naar de andere en uiteindelijk in de elutie buffer met behulp van een magnetische pipet waaraan de deeltjes hechten. Viraal nucleïnezuur suspensies verkregen kunnen worden verzonden naar een referentielaboratorium waar de detectie kan worden uitgevoerd met behulp van moleculaire methoden op basis van PCR. Voor elke extractie van nucleïnezuur worden twee verschillende hoeveelheden getest om enzymatische remming uit te voeren, ontstaan door het monster. Als alternatief, met minimale beschikbaarheid van apparatuur, kunnen PCR-tests worden uitgevoerd op het punt van gebruik. Het gehele proces is ontworpen om onafhankelijk van een stroomtoevoer te worden uitgevoerd (Figuur 1).
Een kwantitatieve PCR-test voor het opsporen van HAdV, uitgescheiden door de mens en gevonden in afvalwater monsters in hoge concentraties, is aangepast om te worden uitgevoerd op het punt van gebruik. HAdV worden gebruikt als menselijke fecale virale indicatoren. Een PCR voor de kwantificering van ms2 bacteriofaag is ook aangepast sinds ms2 wordt gebruikt in virwatest als procesbeheersing. De methode kan worden aangepast voor de opsporing van een virus van belang.
Na de ontwikkeling, de VirWaTest methode is toegepast door de gebruikers in twee verschillende instellingen in de Republiek van Centraal-Afrika (RCA) en Ecuador, het verstrekken van feedback over de toepassing van het protocol in reële situaties.
Voor onze kennis is dit de eerste procedure die de concentratie en opsporing van virussen op het punt van gebruik mogelijk maakt, onafhankelijk van elke voeding, grote apparatuur en Vries-/koelingcondities. Het wordt aanbevolen om twee replicaten van elk watermonster te verzamelen om robuuste resultaten te verkrijgen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1677px;" width="1677">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-14-00001</td>
			<td style="width:989px;">Includes Solis Biodyne&#39;s 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">8-Microtube Strips with Caps</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">840637</td>
			<td>Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Aquagenx CBT E. coli Kit</td>
			<td style="width:195px;">Aquagenx, LLC</td>
			<td style="width:123px;">ECCBT10</td>
			<td>10 Tests per Kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011674</td>
			<td>Includes 12V car power adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket Support</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011648</td>
			<td>Aluminium support</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket, 10 L</td>
			<td style="width:195px;">Cater4You</td>
			<td style="width:123px;">10LTR</td>
			<td>Polypropilene, Tamperproof, Clear color</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Centrifuge Tube, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">CTSP-E50-050</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">1410181211</td>
			<td>Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Clear PET Bottle</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FPET-500-088</td>
			<td style="width:989px;">Clear Color, PET, Cap Not Included</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Difco Skim Milk, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">232100</td>
			<td>Dehydrated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">DNA/RNA Shield, 250 mL</td>
			<td style="width:195px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">R1100-250</td>
			<td>DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Easy9 Pipette Controller</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">EAS9-001-001</td>
			<td>0.3 &#956;m filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030121023</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030120094</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 5 mL</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">999542</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Ethanol 96% V/V, 1 L</td>
			<td style="width:195px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">361085-1611</td>
			<td>For UV, IR&#160; and HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Laboratory Tweezers</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FORS-007-002</td>
			<td>Thin, Curved End, L= 120 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900017000</td>
			<td>Battery-powered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Marker</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">929203</td>
			<td style="width:989px;">Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Micro Rota-Rack for Microtubes</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">37782</td>
			<td>4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Mini8 Real-Time PCR Cycler</td>
			<td style="width:195px;">Coyote Biosciences, China</td>
			<td style="width:123px;">Mini-8</td>
			<td>Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">NucliSens Lysis Buffer</td>
			<td style="width:195px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:123px;">200292</td>
			<td>Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900136N</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">PE Screw Cap PP28</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">TP28-004-020</td>
			<td style="width:989px;">For PET Bottles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">pH Indicator Strip</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">WSPH-001-001</td>
			<td>Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Plastic Test Tube</td>
			<td style="width:195px;">Quimikals</td>
			<td style="width:123px;">300913</td>
			<td>Includes Cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">PIPP-003-500</td>
			<td>Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409726</td>
			<td>Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409526G</td>
			<td>Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Powder Powder Detergent</td>
			<td style="width:195px;">-</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>Regular Powder Soap for washing clothes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Power Cables for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011692</td>
			<td>Connection between batteries and magnetic stirrers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Magnetic Tool</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24001</td>
			<td>Hand-held tool for magnetic particles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Tips in Box</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24296</td>
			<td>RNase-Free, Autoclaved, 96 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">SN51100</td>
			<td>3.2 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sea Salts</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S9883-500G</td>
			<td>An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Silicone Tubing</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">SILT-006-005</td>
			<td>Roll of 5 Meters, Inner&#160; &#248; x Outer&#160; &#248;= 6 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td>
			<td style="width:195px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">28244295</td>
			<td>Pellets, 1 Kg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Solar Rotary Platform</td>
			<td style="width:195px;">SOL-EXPERT Group</td>
			<td style="width:123px;">70020</td>
			<td>Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SOLIScript 1-step Probe Kit</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-57-00250</td>
			<td>Includes Solis Biodyne&#39;s 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">21.141-4197</td>
			<td>Includes BioTools&#39;s BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">045926</td>
			<td>Pivot Ring, L x&#160; &#248; = 38 x 8 mm, Blue</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">PN10E1</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900043</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">22001-4291</td>
			<td>Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Water Molecular Biology Reagent, 1L</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">W4502-1L</td>
			<td>Nuclease and Protease Free, 0.1 &#956;m Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Whirl-Pak Bag, 540 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">200361</td>
			<td>Stable bottom</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Zip Lock Plain Bag</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">BZIP-080-100</td>
			<td>Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples

Virussen die door mensen en dieren worden uitgescheiden, kunnen waterbronnen besmetten en een risico vormen voor de menselijke gezondheid wanneer dit water wordt gebruikt voor het drinken, voedsel irrigatie, wassen, enz. De klassieke fecale bacterie indicator controleert niet altijd op de aanwezigheid van virale pathogenen, dus de opsporing van virale pathogenen en virale indicatoren is relevant om maatregelen van risicobeperking vast te stellen, met name in humanitaire scenario's en in gebieden waar door water overgedragen virale uitbraken frequent zijn.
Op dit moment zijn er verschillende commerciële tests beschikbaar die de kwantificering van fecale indicator bacteriën (FIB) mogelijk maken om te testen op het punt van gebruik. Dergelijke commerciële tests zijn echter niet beschikbaar voor de opsporing van virussen. Voor de opsporing van virussen in milieuwater monsters moet een aantal liters in kleinere volumes worden geconcentreerd. Bovendien vertrouwt de opsporing van virussen eenmaal geconcentreerd op methoden zoals nucleïnezuur extractie en moleculaire detectie (bijv. polymerase-kettingreactie [PCR]-gebaseerde assays) van de virale Genomes.
De hier beschreven methode maakt de concentratie van virussen uit 10 L watermonsters, evenals de extractie van virale nucleïnezuren op het punt van gebruik, met eenvoudige en draagbare apparatuur. Dit maakt het testen van watermonsters op het punt van gebruik voor verschillende virussen mogelijk en is nuttig in humanitaire scenario's, evenals in elke context waarin een uitgerust laboratorium niet beschikbaar is. Als alternatief kan de methode het concentreren van virussen aanwezig zijn in watermonsters en de verzending van het concentraat naar een laboratorium bij kamertemperatuur voor verdere analyse.

Methodeontwikkeling
Deze procedure is ontwikkeld in het laboratorium van virussen verontreinigingen van water en voedsel met de samenwerking van GenIUL en Oxfam Intermón. Het bestaat uit drie verschillende stappen. De eerste, de virale DEELTJESCONCENTRATIE, is een aanpassing van een mageremelkflocculatie methode die eerder werd beschreven12,17,</su...

Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Hier presenteren we VirWaTest, wat een eenvoudige, betaalbare en draagbare methode is voor de concentratie en detectie van virussen uit watermonsters op het punt van gebruik.

VirWaTest, een gebruiksmethode voor het opsporen van virussen in water monsters

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Enterische virussen zijn meestal te vinden in verschillende aquatische reservoirs, waaronder grondwater, stilstaand water, beken, rivieren en r water. Ze worden geassocieerd met gezondheidsrisico's en zijn verantwoordelijk voor infecties bij de mens. Enterische virussen veroorzaken vaak gastro-enteritis en worden meestal overgedragen via de fecaale-orale route.Andere door water overgedragen ziekten veroorzaken acute hepatitis door hepatitis A-virus en hepatitis E-virussen, met aanzienlijke bijbehorende sterfte, vooral met betrekking tot hepatitis E bij zwangere vrouwen. De feitelijke protocollen voor het toezicht op de waterkwaliteit die zijn voorgesteld voor humanitaire contexten zijn ontworpen om bacteriën zoals E.Coli te houden als een indicator van fecale verontreiniging. Maar het is al bekend dat er geen correlatie is met andere micro-organismen zoals virussen die beter bestand zijn tegen veel activeringsprocessen.Tot nu toe werden virussen in humanitaire crisissituaties opgespoord door bestaande protocollen aan te passen aan de omstandigheden van die contexten en monsters te verzenden naar referentielaboratoria voor moleculaire detectie van virussen. Er zijn behoefte aan methoden om virale ziekteverwekkers en virale indicatoren op te sporen in het oogpunt van het verminderen van de risico's voor de volksgezondheid, het voorkomen van uitbraken en het verhogen van de efficiëntie van humanitaire interventies. Wij stellen een methode voor de detectie van virussen in 10 liter watermonsters die is verdeeld in drie stappen: Virale concentratie, nucleïnezuur extractie, en virale detectie.Al deze stappen zijn aangepast aan de methoden die momenteel in ons laboratorium worden gebruikt, en kunnen worden uitgevoerd in het oogpunt met behulp van draagbare reagentia en apparatuur, het produceren van de afhankelijken van de voeding en vriezers. Ook is een conserveermiddeloplossing toegevoegd aan de methode om de stabiliteit van nucleïnezuren te rechtvaardigen voor verzending naar referentielaboratoria indien nodig. De methode die wij voorstellen heet VirWaTest en is ontwikkeld in samenwerking met GenIUL en Intermon Oxfam.Voordat met de proef wordt begonnen, moet het aantal te testen monsters in aanmerking worden genomen voor de bereiding van reagentia en materiaal. Het wordt aanbevolen om twee replica's van elk watermonster te verzamelen om representatieve resultaten te verkrijgen. Meerdere monsters kunnen tegelijkertijd worden getest als de juiste hoeveelheid materiaal beschikbaar is.Reagentia en materialen moeten worden bereid en verpakt voordat ze worden verplaatst of verzonden naar de plaats waar de methode nodig is. De lijst van materialen en kleine apparatuur die moeten worden verpakt wordt beschreven in tabel een. Bereid een bacteriofaag MS2-bestand voor dat aan elk watermonster moet worden toegevoegd als procescontrole door de bijbehorende ISO-methode te volgen.Verdeel vervolgens 10 microliter van een suspensie met 10 tot 10 platformunits die vooraf in buizen van 10 mL zijn gemaakt en laat het water drogen. Er is één buis per watermonster nodig. Bereid bovendien één buis met 10 mLs steriel gedestilleerd water per verzameld monster.Voor de voorgevlobbele magere melkoplossing moet u een buis met de magere melk, een plastic zak met rits met het zeezout en een plastic fles met het gedestilleerde water bereiden. Voor pH-aanpassing moet u een buis met citroenzuur, een buis met natriumhydroxide en twee plastic recipiënten met 25 en 50 mLs gedestilleerd water bereiden. Voor elk te testen watermonster moet u een conditioneringszakje maken door de zeezouten en het citroenzuur toe te voegen aan een plastic zak met rits, en een conserveringsoplossing door de lysebuffer en nucleïnezuurconserveringsmiddel toe te voegen aan een buis van 5 mL.Tot slot, bereid vier neutraliserende zakjes, het toevoegen van macht wasmiddel aan vier rits plastic zakken. Voor elk te extra watermonster moet u één buis van vijf mL met magnetische deeltjes en ethanol en drie buizen van 2 mL met 500, 600 en 200 microliter wasbuffers één, twee en drie en één buis met elutiebuffers voorbereiden. Twee verschillende nucleïnezuurextracties kunnen gelijktijdig worden geanalyseerd in elke PCR-test als een Newell-thermocycler wordt gebruikt.Voor alle PCR-tests, bereid moleculaire biologie water. Bereid mengsels voor die twee primers en één specifiek bewijs voor elk doelvirus bevatten volgens de in het protocol beschreven volumes en concentraties. Voeg voor elk virus de aangegeven volumes toe in buizen één tot acht van een buizenlade.Snijd de strip, verdelen in twee strips. Buizen één tot vijf en buizen zes tot acht. Voor elk virus, luchtdroge DNA-suspensies met 10 tot 5, 10 tot 7, en 10 tot 9 en bekende kopieën vooraf gemaakt in buizen zes, zeven en acht.Dit concentratieprotocol is gebaseerd op het principe van organische flocculatie waarmee de lage pH en de hoge geleidbaarheidsconditie de magere melkeiwitten aandrijft om zich te organiseren in flocs waar de virussen op absorberen. Zodra de flocs zijn geregeld, kunnen ze gemakkelijk worden verzameld. Verzamel een 10 liter watermonster in een platte emmer voorzien van een deksel.Als het verzamelen van een pijp, laat het water lopen voor een paar seconden voor het verzamelen van het water. Het is belangrijk om duidelijke emmers te gebruiken om pellets te visualiseren. Zoek naar een vlakke ruimte in een frisse plaats ver van direct zonlicht Plaats een magnetische roerder aangesloten op een batterij onder de emmer ondersteuning en plaats de emmer met het watermonster op elke steun.Heroverweeg het citroenzuur en de natriumhydroxide en schud totdat ze volledig zijn opgelost. Giet 500 mLs gedestilleerd water in een stand-up zak en plaats de zak op een magnetische roerder. Voeg de inhoud van een zeezout zakje en de inhoud van een magere melkbuis en roer gedurende vijf minuten op gemiddelde snelheid.Pas de pH van de flocculated magere melk met citroenzuur en natriumhydroxide aan op een pH tussen 3,4 en 3,6. Schakel de magneetroerder uit en zorg ervoor dat de flocs zichtbaar zijn. Een zaklamp kan helpen bij het visualiseren van de flocs.Laat een roerende magneet in het water vallen. Zet de magnetische roerder op maximale snelheid en zet hem aan. Voeg 10 mLs gedestilleerd water toe aan een procesgestuurde buis.Omkeren het een paar keer en giet de oplossing in het water. Giet de inhoud van een monster conditionering zakje in het water en roer gedurende vijf minuten. Zorg ervoor dat de pH van het watermonster, dat tussen 3,4 en 3,6 moet liggen.Pas indien nodig de pH aan. Voeg 100 mLs voorgevloekte magere melkoplossing toe, sluit de emmer af met het deksel en laat het water acht uur roeren bij minimale snelheid. Zet na acht uur de magneetroerder uit en laat de flocs minstens vijf uur langer wachten.Met een systeem op basis van het gebruik van een pipet controller, een plastic buis, en een paar pipetten, gooi de supernatant, oppassen niet te verstoren de flocs op de emmer bodem. Wanneer het waterniveau op het punt staat de roermagneet te bereiken, knijpt u in de plastic buis om de waterstroom te stoppen en de pipet uit de emmer te verplaatsen. Schud de emmer om de flocs opnieuw op te zetten en giet ze in een stand-up plastic zak.Laat de flocs genoegen nemen met een extra uur. Voorzichtig aanzuigen het water supernatant met behulp van een pipet vermijden om de flocs verstoren. Aspirate de flocs met behulp van een pipet en breng ze in een conische buis.Noteer het uiteindelijke volume van het monsterconcentraat en breng 1 mL over naar een buis met de conserveermiddeloplossing. De suspensie kan worden gebruikt om de nucleïnezuurextractie in het veld uit te voeren, of naar een referentielaboratorium worden verzonden voor verdere analyse. Het water dat tijdens het verzamelen van de flocs wordt weggegooid, moet vóór verwijdering worden behandeld.Voeg de inhoud van een neutraliserend middelzakje toe aan de emmer met het afgedankte water. Meng het water en laat het nog dertig minuten staan. Gooi vervolgens het behandelde water weg als algemeen afval.De magnetische deeltjes kunnen met behulp van een magnetische pipet van de ene buis naar de andere worden overgebracht. Wen aan de werking van een magnetische pipet voordat u de extractie uitvoert. Schik de buizen met het reagens dat nodig is voor extractie in een rek.Dat wil zeggen, van links naar rechts:bindende buffer, wasbuffers en elutiebuffer. Breng 1 mL monsterconcentraat over aan de buis met de bindingsbuffer met behulp van een plastic wegwerppipet. Keer de buis tien keer om om de oplossing te optimaliseren.Broed de oplossing tien minuten lang op kamertemperatuur uit terwijl u continu mengt met behulp van een solo orbitale of handmatig. Verzamel de magnetische deeltjes met behulp van een magnetische pipet en een schone punt die kan worden hergebruikt voor de drie wasbuffers en laat de magnetische deeltjes in de buis met wasbuffer een. Was ze door zachtjes schudden van de oplossing met de tip voor dertig seconden en verzamel ze.Herhaal deze wasprocedure voor het wassen van buffers twee en drie. Verzamel de magnetische deeltjes in wasbuffer drie en laat ze los in de buis met de elutiebuffer. Gooi vervolgens de tip weg.Broed de oplossing vijf minuten lang op kamertemperatuur terwijl u continu mengt met behulp van de solo orbitale. Vervang de punt op de magnetische pipet door een en verzamel alle magnetische deeltjes uit de elutiebuffer. Gooi de punt weg met de deeltjes eraan.Het nucleïnezuur blijft in de elutiebuffer, die moet worden opgeslagen voor verdere analyse of verzending. Gebruik een vijf-buis en een drie-buis strip bereid om menselijke adenovirussen te detecteren. Voeg water, PCR mix, en nucleïnezuur extratie aan buizen een tot en met vijf volgens het protocol.Voeg daarna water en PCR mix toe aan buizen zes tot en met acht. Plaats beide strips in de thermocycler en selecteer de juiste run. Zodra de run is voltooid, verzamelt u de resultaten en analyseert u verkregen gegevens.Alleen wanneer virale tests negatief hebben geresulteerd, moet MS2-detectie worden uitgevoerd. Gebruik buisstrips die zijn voorbereid voor MS2-detectie en selecteer het juiste thermische profiel voor de PCR. De VirWaTest magnetische nucleïnezuur extractie werd vergeleken met QIAgen virale RNA, nagebootst door het testen van watermonsters verrijkt met menselijke adenovirussen en MS2.Reductie test p-waarde toont aanzienlijk hogere virale terugvorderingen met behulp van VirWaTest dan QiAgen als een extractie methode voor beide virussen getest. De ontwikkelde methode voor virale concentratie werd in het veld getest met de medewerking van Oxfam-wasteams in Bangui, Centraal-Afrikaanse Republiek en in Pedernales, Ecuador, die watermonsters verzamelden, geconcentreerd door de ontwikkelde concentratiemethode toe te passen, en stuurde ze naar het laboratorium in Barcelona voor nucleïnezuurextractie en virale kwantificering. In Ecuador werden menselijke adenovirussen aangetroffen in alle geteste monsters, terwijl één op de vijf monsters die in Bangui werden verzameld en geconcentreerd positief op menselijke adenovirussen testte.De ontwikkelde methode is nuttig gebleken toen het werd geëvalueerd door wasteams van Oxfam Intermon in Bangui, Centraal-Afrikaanse Republiek en door een ander team in Pedernales, Ecuador. VirWaTest kan deel uitmaken van een systeem voor vroegtijdige waarschuwing of kan worden gebruikt bij het onderzoek naar uitbraken door organisaties die betrokken zijn bij watersanering. Deze apparatuur vergemakkelijkt de analyse van virale ziekteverwekkers in water en de verbetering van het beheer van de waterveiligheid met als doel het verminderen van incidenten van virale ziekten in humanitaire crisiscontexten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Het gebruik van TL-Immuno-Chemie voor de detectie van Edwardsiella ictaluri In kanaal meerval ( I. punctatus) Monsters

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Kosteneffectieve methode voor Microbiële Source Tracking Met behulp van specifieke menselijke en dierlijke virussen

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Glaswol Filters voor Concentreren op waterbasis Virussen en Landbouw zoönotische pathogenen

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Een aangepaste EPA-methode 1623, dat tangentiële Flow holle-vezel ultrafiltratie en warmte Dissociatie stappen gebruikt om te detecteren op waterbasis<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; En<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasale toediening van recombinante Influenza Vaccines in Chimerisch muismodellen om mucosale immuniteit bestuderen

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Snelle Moleculaire detectie en differentiatie influenzavirussen A en B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magneetroerder werkwijze voor de detectie van<em&gt; Trichinella</em&gt; Larven in Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...