Name: virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest était un projet de recherche financé par le programme HIF (Fonds humanitaire d'innovation) de l'ELHRA (Améliorer l'apprentissage et la recherche pour l'aide humanitaire). Les auteurs reconnaissent les équipes wash qui ont gentiment collaboré à cette étude. L'analyse des échantillons en Equateur a été financée par Oxfam Equateur et Direccion de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas est boursier Serra-Hunter à l'Université de Barcelone.

1. Préparation et emballage
REMARQUE : Les matériaux/équipements à emballés figurent dans le tableau 1. Utilisez des gants pour manipuler les réactifs nécessaires au contrôle des processus, les réactifs de concentration, les réactifs d'extraction d'acide nucléique et les réactifs de détection. Portez des lunettes de protection pour manipuler les réactifs requis pour l'extraction d'acide nucléique.
<ol><li>Contrôle du processus
	<ol>
<li>Prép...

<ol>
	<li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).</li><li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).</li><li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques.">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li><li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants,+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water.">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li><li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification.">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li><li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterically+infecting+viruses:+Pathogenicity,+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection.">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li><li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage.">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator.">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li><li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li><li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat,+UV-B+radiation,+and+singlet+oxygen:+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results.">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li><li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay.">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).</li><li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses,+bacteria+and+protozoa.">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li></ol>

La méthode VirWaTest permet la concentration de virus et l'extraction d'acide nucléique à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation par des utilisateurs non expérimentés. Il s'agit d'un protocole abordable, rapide et simple. La concentration est basée sur le principe de la flocculation organique à l'aide de lait écrémé, par lequel le pH faible et les conditions de conductivité élevée font des protéines de lait écrémés agréger en flocs les virus adsorb à. Lorsque les flocs se sédimentent, il ...

Pendant les premières phases de toute urgence humanitaire, l'accès à l'approvisionnement en eau potable, à l'assainissement et à l'hygiène est essentiel à la survie des personnes touchées. Par conséquent, la surveillance de la qualité de l'eau est une priorité pour prévenir les flambées d'origine hydrique. Il est bien connu que l'eau contaminée est souvent à l'origine de maladies, mais il est souvent difficile de déterminer les sources d'éclosions virales telles que le virus de l'hépatite E (VHE), même avec la disponibilité de méthodes de laboratoire conventionnelles. Le contrôle de la qualité de l'eau est basé sur la quantification de FIB1,2,3,4. Cependant, il a été largement documenté qu'il n'y a aucune corrélation entre l'absence de FIB et la présence d'agents pathogènes d'origine hydrique virale tels que le rotavirus (RoV), le norovirus (NoV), ou le VHE5,6. Ainsi, l'utilisation des critères de qualité de l'eau basés sur la FIB pourrait entraîner une sous-estimation des risques associés à la présence d'agents pathogènes viraux d'origine hydrique. La surveillance de virus indicateurs, tels que les adénovirus humains (HAdV), ou d'agents pathogènes spécifiques serait utile pour définir l'exposition aux agents pathogènes viraux et identifier la source potentielle de l'infection humaine7,8, 9,10 et en validant l'efficacité des mesures d'assainissement11.
Jusqu'à présent, la détection des virus dans ces scénarios reposait sur un personnel qualifié et une logistique complexe. VirWaTest (virwatest.org) vise le développement d'une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection subséquente des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.
La concentration du virus est basée sur le principe de la flocculation organique de 10 Échantillons d'eau L, par lequel les virus sont récupérés en plus petits volumes12,13. Les flocs sont recueillis et ajoutés à un tampon qui lyse les virus et empêche les acides nucléiques de se dégrader lorsqu'ils sont stockés à température ambiante pendant au plus 2 semaines.
La méthode d'extraction de l'acide nucléique est basée sur l'utilisation de particules magnétiques auxquelles les acides nucléiques obtiennent adsorbed. Ils peuvent être transférés d'un tampon de lavage à un autre et enfin dans le tampon d'élution à l'aide d'une pipette magnétique à laquelle les particules se fixent. Les suspensions d'acide nucléique viral obtenues peuvent être expédiées à un laboratoire de référence où la détection peut être effectuée à l'aide de méthodes moléculaires basées sur pcR. Pour chaque extraction d'acide nucléique, deux quantités différentes sont testées pour exclure l'inhibition enzymatique provenant de l'échantillon. Alternativement, avec une disponibilité minimale de l'équipement, les tests PCR peuvent être exécutés au point d'utilisation. L'ensemble du processus est conçu pour être exécuté indépendamment d'une alimentation électrique (figure 1).
Un essai quantitatif de PCR pour détecter le HAdV, excrété par l'homme et trouvé dans des échantillons d'eaux usées en concentrations élevées, a été adapté pour être exécuté au point d'utilisation. Le VHA est utilisé comme indicateur viral fécal humain. Un PCR pour la quantification du bactériophage MS2 a également été adapté puisque MS2 est utilisé dans VirWaTest comme contrôle des processus. La méthode peut être personnalisée pour la détection de tout virus d'intérêt.
Après le développement, la méthode VirWaTest a été appliquée par les utilisateurs dans deux contextes différents en République d'Afrique centrale (RCA) et en Equateur, fournissant des commentaires sur l'application du protocole dans des situations réelles.
À notre connaissance, il s'agit de la première procédure qui permet la concentration et la détection des virus au point d'utilisation, indépendamment de toute alimentation électrique, de gros équipements et de conditions de congélation/refroidissement. Il est recommandé de prélever deux répliques de chaque échantillon d'eau afin d'obtenir des résultats robustes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1677px;" width="1677">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-14-00001</td>
			<td style="width:989px;">Includes Solis Biodyne&#39;s 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">8-Microtube Strips with Caps</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">840637</td>
			<td>Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Aquagenx CBT E. coli Kit</td>
			<td style="width:195px;">Aquagenx, LLC</td>
			<td style="width:123px;">ECCBT10</td>
			<td>10 Tests per Kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011674</td>
			<td>Includes 12V car power adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket Support</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011648</td>
			<td>Aluminium support</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket, 10 L</td>
			<td style="width:195px;">Cater4You</td>
			<td style="width:123px;">10LTR</td>
			<td>Polypropilene, Tamperproof, Clear color</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Centrifuge Tube, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">CTSP-E50-050</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">1410181211</td>
			<td>Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Clear PET Bottle</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FPET-500-088</td>
			<td style="width:989px;">Clear Color, PET, Cap Not Included</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Difco Skim Milk, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">232100</td>
			<td>Dehydrated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">DNA/RNA Shield, 250 mL</td>
			<td style="width:195px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">R1100-250</td>
			<td>DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Easy9 Pipette Controller</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">EAS9-001-001</td>
			<td>0.3 &#956;m filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030121023</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030120094</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 5 mL</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">999542</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Ethanol 96% V/V, 1 L</td>
			<td style="width:195px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">361085-1611</td>
			<td>For UV, IR&#160; and HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Laboratory Tweezers</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FORS-007-002</td>
			<td>Thin, Curved End, L= 120 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900017000</td>
			<td>Battery-powered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Marker</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">929203</td>
			<td style="width:989px;">Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Micro Rota-Rack for Microtubes</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">37782</td>
			<td>4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Mini8 Real-Time PCR Cycler</td>
			<td style="width:195px;">Coyote Biosciences, China</td>
			<td style="width:123px;">Mini-8</td>
			<td>Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">NucliSens Lysis Buffer</td>
			<td style="width:195px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:123px;">200292</td>
			<td>Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900136N</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">PE Screw Cap PP28</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">TP28-004-020</td>
			<td style="width:989px;">For PET Bottles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">pH Indicator Strip</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">WSPH-001-001</td>
			<td>Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Plastic Test Tube</td>
			<td style="width:195px;">Quimikals</td>
			<td style="width:123px;">300913</td>
			<td>Includes Cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">PIPP-003-500</td>
			<td>Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409726</td>
			<td>Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409526G</td>
			<td>Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Powder Powder Detergent</td>
			<td style="width:195px;">-</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>Regular Powder Soap for washing clothes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Power Cables for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011692</td>
			<td>Connection between batteries and magnetic stirrers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Magnetic Tool</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24001</td>
			<td>Hand-held tool for magnetic particles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Tips in Box</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24296</td>
			<td>RNase-Free, Autoclaved, 96 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">SN51100</td>
			<td>3.2 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sea Salts</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S9883-500G</td>
			<td>An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Silicone Tubing</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">SILT-006-005</td>
			<td>Roll of 5 Meters, Inner&#160; &#248; x Outer&#160; &#248;= 6 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td>
			<td style="width:195px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">28244295</td>
			<td>Pellets, 1 Kg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Solar Rotary Platform</td>
			<td style="width:195px;">SOL-EXPERT Group</td>
			<td style="width:123px;">70020</td>
			<td>Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SOLIScript 1-step Probe Kit</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-57-00250</td>
			<td>Includes Solis Biodyne&#39;s 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">21.141-4197</td>
			<td>Includes BioTools&#39;s BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">045926</td>
			<td>Pivot Ring, L x&#160; &#248; = 38 x 8 mm, Blue</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">PN10E1</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900043</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">22001-4291</td>
			<td>Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Water Molecular Biology Reagent, 1L</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">W4502-1L</td>
			<td>Nuclease and Protease Free, 0.1 &#956;m Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Whirl-Pak Bag, 540 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">200361</td>
			<td>Stable bottom</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Zip Lock Plain Bag</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">BZIP-080-100</td>
			<td>Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples

Les virus excrétés par les humains et les animaux peuvent contaminer les sources d'eau et présenter un risque pour la santé humaine lorsque cette eau est utilisée pour boire, irriguer, laver, etc. L'indicateur classique des bactéries fécales ne vérifie pas toujours la présence d'agents pathogènes viraux, de sorte que la détection des agents pathogènes viraux et des indicateurs viraux est pertinente afin d'adopter des mesures d'atténuation des risques, en particulier dans les scénarios humanitaires et dans les zones où les flambées virales d'origine hydrique sont fréquentes.
À l'heure actuelle, plusieurs tests commerciaux permettant la quantification des bactéries indicateurs fécales (FIB) sont disponibles pour des tests au point d'utilisation. Cependant, de tels tests commerciaux ne sont pas disponibles pour la détection des virus. La détection des virus dans les échantillons d'eau de l'environnement nécessite de concentrer plusieurs litres en plus petits volumes. De plus, une fois concentrés, la détection des virus repose sur des méthodes telles que l'extraction de l'acide nucléique et la détection moléculaire (p. ex., les essais en chaîne de polymérase (PCR] des génomes viraux).
La méthode décrite ici permet la concentration de virus à partir d'échantillons d'eau de 10 L, ainsi que l'extraction d'acides nucléiques viraux au point d'utilisation, avec un équipement simple et portable. Cela permet de tester des échantillons d'eau au point d'utilisation de plusieurs virus et est utile dans les scénarios humanitaires, ainsi que dans n'importe quel contexte où un laboratoire équipé n'est pas disponible. Alternativement, la méthode permet de concentrer les virus présents dans les échantillons d'eau et l'expédition du concentré à un laboratoire à température ambiante pour une analyse plus approfondie.

Développement de méthodes
Cette procédure a été développée dans le Laboratoire des virus contaminants de l'eau et de l'alimentation avec la collaboration de GenIUL et d'Oxfam Intermon. Il se compose de trois étapes différentes. La première, la concentration virale de particules, est une adaptation d'une méthode de flocculation du lait écrémé précédemment décrite12,</...

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VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Nous présentons ici VirWaTest, qui est une méthode simple, abordable et portable pour la concentration et la détection des virus à partir d'échantillons d'eau au point d'utilisation.

VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Les virus en entéroïques se trouvent principalement dans différents réservoirs aquatiques, y compris les eaux souterraines, l’eau potable, les ruisseaux, les rivières et l’eau r. Ils sont associés à des risques pour la santé et sont responsables des infections chez l’homme. Les virus entériques causent généralement une gastro-entérite et se transmettent principalement par voie fécale-orale.D’autres maladies d’origine hydrique causent l’hépatite aiguë par le virus de l’hépatite A et les virus de l’hépatite E, avec une mortalité associée importante, en particulier en ce qui concerne l’hépatite E chez les femmes enceintes. Les protocoles réels de surveillance de la qualité de l’eau proposés dans des contextes humanitaires ont été conçus pour garder les bactéries comme E.Coli comme indicateur de contamination fécale. Mais il est déjà connu qu’il n’y a pas de corrélation avec d’autres micro-organismes tels que les virus qui sont plus résistants à de nombreux processus d’activation.Jusqu’à présent, la détection des virus dans les contextes de crise humanitaire a été effectuée en adaptant les protocoles existants aux conditions de ces contextes, et en expédiant des échantillons aux laboratoires de référence pour la détection moléculaire des virus. Il est nécessaire de trouver des méthodes pour détecter les agents pathogènes viraux et les indicateurs viraux dans le point de vue de réduire les risques pour la santé publique, de prévenir les flambées et d’accroître l’efficacité des interventions humanitaires. Nous proposons une méthode pour la détection des virus dans des échantillons d’eau de 10 litres qui est divisé en trois étapes: concentration virale, extraction d’acide nucléique, et la détection virale.Toutes ces étapes ont été adaptées à partir des méthodes actuellement utilisées dans notre laboratoire, et peuvent être effectuées dans le point de vue en utilisant des réapprovisionnements portables et de l’équipement, produisant les personnes à charge de l’alimentation électrique et des congélateurs. En outre, une solution de conservation a été ajoutée à la méthode pour justifier la stabilité des acides nucléiques pour l’expédition aux laboratoires de référence si nécessaire. La méthode que nous proposons s’appelle VirWaTest et a été développée avec la collaboration de GenIUL et d’Intermon Oxfam.Avant de commencer, le nombre d’échantillons à tester doit être pris en considération pour la préparation des reagents et des matériaux. Il est recommandé de recueillir deux répliques de chaque échantillon d’eau afin d’obtenir des résultats représentatifs. Plusieurs échantillons peuvent être testés en même temps si la quantité appropriée de matériel est disponible.Les reagents et les matériaux doivent être préparés et emballés avant d’être déplacés ou expédiés à l’endroit où la méthode est nécessaire. La liste des matériaux et des petits équipements qui devraient être emballés est décrite dans le premier tableau. Préparer un stock de BACtériophage MS2 à ajouter à chaque échantillon d’eau comme contrôle des processus en suivant la méthode ISO correspondante.Ensuite, distribuez 10 microlitres d’une suspension contenant de 10 à 10 unités de plate-forme pré-fabriquées en tubes de 10 mL et laissez sécher l’eau. Un tube par échantillon d’eau sera nécessaire. De plus, préparez un tube contenant 10 mL d’eau distillée stérile par échantillon recueilli.Pour la solution de lait écrémé pré-flocculated, préparez un tube contenant le lait écrémé, un sac en plastique de fermeture éclair contenant le sel de mer, et une bouteille en plastique contenant l’eau distillée. Pour l’ajustement du pH, préparer un tube contenant l’acide citrique, un tube contenant l’hydroxyde de sodium et deux contenants en plastique contenant 25 et 50 mL d’eau distillée. Pour que chaque échantillon d’eau soit testé, préparez un sachet de conditionnement en ajoutant les sels de mer et l’acide citrique à un sac en plastique à fermeture éclair, et une solution de conservation en ajoutant le tampon de lyse et l’agent de conservation de l’acide nucléique à un tube de 5 mL.Enfin, préparez quatre sachets neutralisants, ajoutant du détergent électrique à quatre sacs en plastique à fermeture éclair. Pour extraire chaque échantillon d’eau, préparez un tube de cinq mL contenant des particules magnétiques et de l’éthanol, et trois tubes de 2 mL contenant respectivement 500, 600 et 200 microlitres de tampons de lavage un, deux et trois, et un tube contenant un tampon d’élitution. Deux extractions différentes d’acide nucléique peuvent être analysées simultanément dans chaque analyse PCR si un thermocycleur Newell est utilisé.Pour tous les tests PCR, préparez l’eau de biologie moléculaire. Préparez des mélanges contenant deux amorces et une preuve spécifique pour chaque virus cible selon les volumes et concentrations décrits dans le protocole. Pour chaque virus, ajouter les volumes indiqués dans les tubes un à huit d’un plateau de tubes.Couper la bande, en la divisant en deux bandes. Tubes un à cinq et tubes six à huit. Pour chaque virus, suspensions d’ADN sèches à l’air contenant 10 à 5, 10 à 7, et 10 à 9 exemplaires et des copies connues pré-faites en tubes six, sept et huit.Ce protocole de concentration est basé sur le principe de la flocculation organique par lequel le faible pH et l’état de haute conductivité pousse les protéines de lait écrémé à s’organiser en flocs que les virus absorbent. Une fois que les flocs sont réglés, ils peuvent être facilement collectés. Recueillir un échantillon d’eau de 10 litres dans un seau à fond plat fourni avec un couvercle.Si vous collectez à partir d’un tuyau, laissez l’eau fonctionner pendant quelques secondes avant de recueillir l’eau. Il est important d’utiliser des seaux clairs pour visualiser les granulés. Recherchez un espace plat dans un endroit frais loin de la lumière directe du soleil Mettez un agitateur magnétique relié à une batterie sous le support du seau et placez le seau contenant l’échantillon d’eau sur chaque support.Reconsidérer l’acide citrique et l’hydroxyde de sodium et secouer jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous. Verser 500 mL d’eau distillée dans un sac de stand-up et placer le sac sur un agitateur magnétique. Ajouter le contenu d’un sachet de sel de mer et le contenu d’un tube de lait écrémé et remuer pendant cinq minutes à vitesse moyenne.Ajuster le pH du lait écrémé flocculé à l’aide d’acide citrique et d’hydroxyde de sodium à un pH compris entre 3,4 et 3,6. Éteignez l’agitateur magnétique et assurez-vous que les flocs sont visibles. Une lampe de poche peut aider à visualiser les flocs.Laissez tomber un aimant en remuant dans l’eau. Réglez l’agitateur magnétique à vitesse maximale et allumez-le. Ajouter 10 mL d’eau distillée à un tube contrôlé par procédé.Inversez-le plusieurs fois et versez la solution dans l’eau. Verser le contenu d’un sachet de conditionnement d’échantillon dans l’eau et remuer pendant cinq minutes. Assurez-vous que le pH de l’échantillon d’eau, qui doit être compris entre 3,4 et 3,6.Ajustez le pH si nécessaire. Ajouter 100 mL de solution de lait écrémé préchauplé, sceller le seau avec le couvercle et laisser l’eau en remuant pendant huit heures à vitesse minimale. Après huit heures, éteignez l’agitateur magnétique et laissez les flocs se contenter d’au moins cinq heures supplémentaires.Avec un système basé sur l’utilisation d’un contrôleur pipette, un tube en plastique, et un couple de pipettes, jeter le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger les flocs sur le fond du seau. Lorsque le niveau d’eau est sur le point d’atteindre l’aimant en remuant, presser le tube en plastique pour arrêter le débit d’eau et éloigner la pipette du seau. Secouez le seau pour réutiliser les flocs et versez-les dans un sac en plastique stand-up.Laissez les flocs se contenter d’une heure supplémentaire. Aspirez soigneusement le surnatant d’eau à l’aide d’une pipette en évitant de déranger les flocs. Aspirer les flocs à l’aide d’une pipette et les transférer dans un tube conique.Notez le volume final du concentré d’échantillon et transférez 1 mL dans un tube contenant la solution de conservation. La suspension peut être utilisée soit pour effectuer l’extraction d’acide nucléique sur le terrain, soit expédier à un laboratoire de référence pour une analyse plus approfondie. L’eau jetée lors de la collecte des flocs doit être traitée avant l’élimination.Ajouter le contenu d’un sachet d’agent neutralisant au seau contenant l’eau jetée. Mélanger l’eau et la laisser immobile pendant trente minutes. Puis éliminer l’eau traitée comme déchets généraux.Les particules magnétiques peuvent être transférées d’un tube à l’autre à l’aide d’une pipette magnétique. Habitez-vous au fonctionnement d’une pipette magnétique avant d’effectuer l’extraction. Disposer les tubes contenant le reagent nécessaire à l’extraction dans une grille.C’est-à-dire, de gauche à droite: tampon contraignant, tampons de lavage, et tampon d’élitution. Transférer 1 mL de concentré d’échantillon dans le tube contenant le tampon de liaison à l’aide d’une pipette en plastique jetable. Inversez le tube dix fois pour optimiser la solution.Incuber la solution à température ambiante pendant dix minutes tout en mélangeant continuellement soit à l’aide d’une orbitale solo ou manuellement. Recueillir les particules magnétiques à l’aide d’une pipette magnétique et d’une pointe propre qui peut être réutilisée pour les trois tampons de lavage et libérer les particules magnétiques dans le tube contenant un tampon de lavage. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant trente secondes et recueillez-les.Répétez cette procédure de lavage pour laver les tampons deux et trois. Recueillir les particules magnétiques dans le tampon de lavage trois et les libérer dans le tube contenant le tampon d’élitution. Puis jetez la pointe.Incuber la solution à température ambiante pendant cinq minutes tout en mélangeant continuellement à l’aide de l’orbitale solo. Remplacez la pointe sur la pipette magnétique par n’importe qui et recueillez toutes les particules magnétiques du tampon d’élitution. Jetez la pointe avec les particules attachées.L’acide nucléique reste dans le tampon d’élitution, qui doit être stocké pour une analyse plus approfondie ou l’expédition. Utilisez une bande à cinq tubes et une bande à trois tubes prêtes à détecter les adénovirus humains. Ajoutez de l’eau, du mélange PCR et de l’extration d’acide nucléique aux tubes un à cinq selon le protocole.Ensuite, ajouter l’eau et le mélange PCR aux tubes de six à huit. Mettez les deux bandes dans le thermocycleur et sélectionnez la course appropriée. Une fois la course terminée, recueillez les résultats et analysez les données obtenues.Ce n’est que lorsque des tests viraux ont donné lieu à des tests négatifs que la détection du MS2 devrait être effectuée. Utilisez des bandes de tube préparées pour la détection ms2 et sélectionnez le profil thermique approprié pour le PCR. L’extraction magnétique d’acide nucléique VirWaTest a été comparée à l’ARN viral QIAgen, l’imitant en testant des échantillons d’eau piqués avec des adénovirus humains et des MS2.La valeur p du test de réduction montre des récupérations virales significativement plus élevées en utilisant VirWaTest que QiAgen comme méthode d’extraction pour les deux virus testés. La méthode développée pour la concentration virale a été testée sur le terrain avec la collaboration d’équipes de lavage d’Oxfam situées à Bangui, en République centrafricaine et à Pedernales, en Équateur, qui ont prélevé des échantillons d’eau, les ont concentrés en appliquant la méthode de concentration développée, et les ont envoyées au laboratoire de Barcelone pour l’extraction de l’acide nucléique et la quantification virale. En Équateur, des adénovirus humains ont été détectés dans tous les échantillons testés, tandis qu’un échantillon sur cinq prélevé et concentré à Bangui a donné des résultats positifs pour les adénovirus humains.La méthode développée s’est avérée utile lorsqu’elle a été évaluée par les équipes de lavage d’Oxfam Intermon à Bangui, en République centrafricaine, et par une autre équipe à Pedernales, en Équateur. VirWaTest peut faire partie d’un système d’alerte précoce ou peut être utilisé dans les enquêtes sur les flambées par les organisations impliquées dans l’assainissement de l’eau. Cet équipement facilite l’analyse des pathogènes viraux dans l’eau et l’amélioration de la gestion de la sécurité de l’eau dans le but de réduire les incidents de maladies virales dans les contextes de crise humanitaire.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Utilisez des fluorescents Immuno-Chimie pour la détection de Edwardsiella ictaluri Dans la barbue de rivière ( I. punctatus) Des échantillons

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Recherche

Immunologie et infection

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Rentable méthode de suivi des sources microbiennes spécifiques utilisant des virus humains et animaux

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Filtres laine de verre pour concentration des virus d&#39;origine hydrique et agricole des agents pathogènes zoonotiques

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Une méthode mise à jour EPA 1623 qui utilise tangentielle débit à fibres creuses d&#39;ultrafiltration et de chaleur étapes de dissociation pour la détection de voie d&#39;eau<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Et<em&gt; Giardia spp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

L&#39;établissement d&#39;une culture liquide recouvert de Airway humaines épithéliales polarisées cellules Calu-3 pour étudier la réponse cellulaire aux agents pathogènes respiratoires hôte<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Méthode Agitateur magnétique pour la détection des<em&gt; Trichinella</em&gt; Larves dans les échantillons de muscle

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...