Name: virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest var et forskningsprosjekt finansiert av HIF (humanitære Innovasjons fond) program for ELHRA (styrking læring & forskning for humanitær bistand). Forfatterne erkjenner WASH lagene som vennlig samarbeidet i denne studien. Analysen av prøvene i Ecuador ble finansiert av Oxfam Ecuador og Dirección de Investigaciones de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas er en Serra-Hunter stipendiat ved Universitetet i Barcelona.

1. forberedelse og pakking
Merk: materialene/utstyret som skal pakkes er listet opp i tabell 1. Bruk hansker til å håndtere reagensene som kreves for prosesskontrollen, konsentrasjons reagensene, nukleinsyre og reagens reagensene. Bruk vernebriller for å håndtere reagensene som kreves for nukleinsyre yre ekstraksjon.
<ol><li>Behandle kontroll
	<ol>
<li>Forbered MS2 bakteriofag aksje kultur (American type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) som inneholder...

<ol>
	<li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).</li><li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).</li><li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques.">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li><li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants,+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water.">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li><li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification.">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li><li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterically+infecting+viruses:+Pathogenicity,+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection.">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li><li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage.">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator.">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li><li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li><li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat,+UV-B+radiation,+and+singlet+oxygen:+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results.">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li><li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay.">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).</li><li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses,+bacteria+and+protozoa.">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li></ol>

Den VirWaTest metoden gjør konsentrasjonen av virus og nukleinsyre syre utvinning fra vann prøver på det punktet av bruk av ikke-erfarne brukere. Det er en rimelig, rask og enkel protokoll. Konsentrasjonen er basert på prinsippet om organiske flokk ule Rings med skummet melk, der den lave pH og høy ledningsevne forhold gjør skummet melkeproteiner samlet inn flocs virusene adsorbere til. Når flocs sediment, er det lett å samle dem, noe som gjør det mulig å konsentrere 10 L vann, mens tradisjonelle ultracentrifug...

I løpet av de første fasene av en humanitær nødssituasjon er tilgang til rent vannforsyninger, sanitær og hygiene avgjørende for overlevelse av de berørte. Derfor er overvåking av vannkvaliteten en prioritet for å hindre vannbaserte utbrudd. Det er velkjent at forurenset vann er ofte opprinnelsen til sykdommer, men det er ofte vanskelig å fastslå kildene til viral utbrudd som hepatitt E-virus (HEV), selv med tilgjengeligheten av konvensjonelle laboratorie metoder. Kontroll av vannkvaliteten er basert på kvantifisering av løgn1,2,3,4. Imidlertid har det vært omfattende dokumentert at det er ingen sammenheng mellom fraværet av liten løgn og tilstedeværelsen av viral vannbaserte patogener som rotavirus (RoV), Norovirus (NoV), eller Hev5,6. Således, ved hjelp av vannkvalitet kriterier basert på LØGN kan resultere i en undervurdering av risiko forbundet med tilstedeværelsen av vannbaserte virale patogener. Overvåking av indikator virus, slik som Human adenoviruses (HAdV), eller bestemte patogener vil være nyttig i å definere eksponering for virale patogener og identifisere den potensielle kilden til menneskelig infeksjon7,8, 9,10 og i å validere effekten av sanitær tiltak11.
Inntil nå, var påvisning av virus i disse scenariene avhengig av dyktige medarbeidere og komplekse logistikk. VirWaTest (virwatest.org) er rettet mot utvikling av en enkel, rimelig og bærbar metode for konsentrasjon og påfølgende deteksjon av virus fra vann prøver på bruksstedet.
Viruset konsentrasjonen er basert på prinsippet om organiske flokk ule Rings av 10 L vann prøver, der virus utvinnes i mindre volumer12,13. Flocs samles og legges til en buffer som analyser virusene og hindrer at nukleinsyre syrer forringes når de oppbevares ved romtemperatur i ikke mer enn 2 uker.
Den nukleinsyre syre utvinnings metoden er basert på bruk av magnetiske partikler som nukleinsyre syrer får adsorberes. De kan overføres fra en vaskebuffer til en annen og til slutt inn i eluering buffer ved hjelp av en magnetisk pipette som partiklene feste. Viral nukleinsyre syre suspensjoner innhentet kan sendes til et referanse laboratorium der påvisning kan utføres ved hjelp av molekylære metoder basert på PCR. For hver nukleinsyre syre ekstraksjon testes to forskjellige mengder for å utelukke enzymatisk hemming av prøven. Med minimum utstyrs tilgjengelighet kan også PCR-tester kjøres på bruksstedet. Hele prosessen er utformet for å utføres uavhengig av en strømforsyning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analyse for å oppdage HAdV, utskilles av mennesker og funnet i avløpsvann prøver i høye konsentrasjoner, har blitt tilpasset for å kjøres på bruksstedet. HAdV brukes som menneskelige avføring viral indikatorer. En PCR for kvantifisering av MS2 bakteriofag er også tilpasset siden MS2 brukes i VirWaTest som prosesskontroll. Metoden kan tilpasses for påvisning av virus av interesse.
Etter utviklingen har VirWaTest-metoden blitt brukt av brukerne i to forskjellige innstillinger i Republikken Sentral-Afrika (RCA) og Ecuador, og gir tilbakemelding om anvendelsen av protokollen i virkelige situasjoner.
Til vår kunnskap, er dette den første fremgangsmåten som gjør at konsentrasjonen og påvisning av virus på bruksstedet, uavhengig av strømforsyning, stort utstyr, og frysing/kjøling forhold. Det anbefales å samle to replikerer av hver vannprøve for å oppnå robuste resultater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1677px;" width="1677">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-14-00001</td>
			<td style="width:989px;">Includes Solis Biodyne&#39;s 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">8-Microtube Strips with Caps</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">840637</td>
			<td>Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Aquagenx CBT E. coli Kit</td>
			<td style="width:195px;">Aquagenx, LLC</td>
			<td style="width:123px;">ECCBT10</td>
			<td>10 Tests per Kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011674</td>
			<td>Includes 12V car power adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket Support</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011648</td>
			<td>Aluminium support</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket, 10 L</td>
			<td style="width:195px;">Cater4You</td>
			<td style="width:123px;">10LTR</td>
			<td>Polypropilene, Tamperproof, Clear color</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Centrifuge Tube, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">CTSP-E50-050</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">1410181211</td>
			<td>Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Clear PET Bottle</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FPET-500-088</td>
			<td style="width:989px;">Clear Color, PET, Cap Not Included</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Difco Skim Milk, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">232100</td>
			<td>Dehydrated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">DNA/RNA Shield, 250 mL</td>
			<td style="width:195px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">R1100-250</td>
			<td>DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Easy9 Pipette Controller</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">EAS9-001-001</td>
			<td>0.3 &#956;m filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030121023</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030120094</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 5 mL</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">999542</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Ethanol 96% V/V, 1 L</td>
			<td style="width:195px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">361085-1611</td>
			<td>For UV, IR&#160; and HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Laboratory Tweezers</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FORS-007-002</td>
			<td>Thin, Curved End, L= 120 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900017000</td>
			<td>Battery-powered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Marker</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">929203</td>
			<td style="width:989px;">Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Micro Rota-Rack for Microtubes</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">37782</td>
			<td>4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Mini8 Real-Time PCR Cycler</td>
			<td style="width:195px;">Coyote Biosciences, China</td>
			<td style="width:123px;">Mini-8</td>
			<td>Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">NucliSens Lysis Buffer</td>
			<td style="width:195px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:123px;">200292</td>
			<td>Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900136N</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">PE Screw Cap PP28</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">TP28-004-020</td>
			<td style="width:989px;">For PET Bottles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">pH Indicator Strip</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">WSPH-001-001</td>
			<td>Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Plastic Test Tube</td>
			<td style="width:195px;">Quimikals</td>
			<td style="width:123px;">300913</td>
			<td>Includes Cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">PIPP-003-500</td>
			<td>Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409726</td>
			<td>Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409526G</td>
			<td>Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Powder Powder Detergent</td>
			<td style="width:195px;">-</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>Regular Powder Soap for washing clothes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Power Cables for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011692</td>
			<td>Connection between batteries and magnetic stirrers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Magnetic Tool</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24001</td>
			<td>Hand-held tool for magnetic particles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Tips in Box</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24296</td>
			<td>RNase-Free, Autoclaved, 96 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">SN51100</td>
			<td>3.2 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sea Salts</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S9883-500G</td>
			<td>An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Silicone Tubing</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">SILT-006-005</td>
			<td>Roll of 5 Meters, Inner&#160; &#248; x Outer&#160; &#248;= 6 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td>
			<td style="width:195px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">28244295</td>
			<td>Pellets, 1 Kg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Solar Rotary Platform</td>
			<td style="width:195px;">SOL-EXPERT Group</td>
			<td style="width:123px;">70020</td>
			<td>Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SOLIScript 1-step Probe Kit</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-57-00250</td>
			<td>Includes Solis Biodyne&#39;s 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">21.141-4197</td>
			<td>Includes BioTools&#39;s BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">045926</td>
			<td>Pivot Ring, L x&#160; &#248; = 38 x 8 mm, Blue</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">PN10E1</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900043</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">22001-4291</td>
			<td>Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Water Molecular Biology Reagent, 1L</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">W4502-1L</td>
			<td>Nuclease and Protease Free, 0.1 &#956;m Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Whirl-Pak Bag, 540 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">200361</td>
			<td>Stable bottom</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Zip Lock Plain Bag</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">BZIP-080-100</td>
			<td>Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples

Virus som skilles ut av mennesker og dyr kan forurense vannkilder og utgjøre en risiko for menneskers helse når dette vannet brukes til drikking, mat vanning, vasking, etc. Den klassiske avføring bakterier indikatoren ikke alltid se etter tilstedeværelsen av virale patogener så påvisning av virale patogener og viral indikatorer er relevant for å vedta tiltak for risikoreduksjon, spesielt i humanitære scenarier og i områder virus utbrudd er hyppige.
I dag, flere kommersielle tester slik at kvantifisering av avføring indikator bakterier (LØGN) er tilgjengelig for testing på det punktet av bruk. Men slike kommersielle tester er ikke tilgjengelig for påvisning av virus. Påvisning av virus i miljøet vann prøver krever konsentrere flere liter i mindre volumer. Videre, når konsentrert, er påvisning av virus avhengig av metoder som nukleinsyre syre utvinning og molekylær deteksjon (f. eks, polymerase kjedere reaksjon [PCR]-baserte analyser) av viral genomer.
Metoden beskrevet her tillater konsentrasjonen av virus fra 10 L vann prøver, samt utvinning av viral nukleinsyre syrer på bruksstedet, med enkelt og bærbart utstyr. Dette gjør at testing av vann prøver på bruksstedet for flere virus og er nyttig i humanitære scenarier, samt i enhver sammenheng der et utstyrt laboratorium ikke er tilgjengelig. Alternativt kan metoden konsentrere virus som finnes i vann prøver og frakt av konsentrat til et laboratorium ved romtemperatur for videre analyse.

Metodeutvikling
Denne prosedyren er utviklet i laboratoriet av virus forurensninger av vann og mat med samarbeid av GenIUL og Oxfam Intermón. Det består av tre ulike trinn. Den første, viral partikkel konsentrasjon, er en tilpasning av en skummet melk flokk ule Rings metode som tidligere er beskrevet12,17,18. Den opp...

Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Her presenterer vi VirWaTest, som er en enkel, rimelig og bærbar metode for konsentrasjon og påvisning av virus fra vann prøver på bruks punktet.

VirWaTest, et punkt-av-bruk metode for påvisning av virus i vann prøver

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Enteriske virus finnes for det meste i forskjellige akvatiske reservoarer, inkludert grunnvann, stillevann, bekker, elver og r vann. De er forbundet med helserisiko og er ansvarlige for infeksjoner hos mennesker. Enteriske virus forårsaker vanligvis gastroenteritt og overføres for det meste gjennom fekal-oral rute.Andre vannbårne sykdommer forårsaker akutt hepatitt ved hepatitt A-virus og hepatitt E-virus, med betydelig forbundet dødelighet spesielt når det gjelder hepatitt E hos gravide kvinner. Faktiske protokoller for overvåking av vannkvalitet foreslått for humanitære sammenhenger er utformet for å holde bakterier som E.Coli som en indikator på fekal forurensning. Men det er allerede kjent at det ikke er noen sammenheng med andre mikroorganismer som virus som er mer motstandsdyktige mot mange aktiveringsprosesser.Til nå har påvisning av virus i humanitære krisesituasjoner blitt utført ved å tilpasse eksisterende protokoller til forholdene i disse sammenhengene, og sende prøver til referanselaboratorier for molekylær påvisning av virus. Det er behov for metoder for å oppdage viruspatogener og virusindikatorer i synspunktene for å redusere folkehelserisikoen, forhindre utbrudd og øke effektiviteten av humanitære intervensjoner. Vi foreslår en metode for påvisning av virus i 10 liters vannprøver som er delt inn i tre trinn: Viral konsentrasjon, nukleinsyreekstraksjon og viral deteksjon.Alle disse trinnene er tilpasset fra metoder som for tiden er i bruk i vårt laboratorium, og kan utføres i synspunktene ved hjelp av bærbare reagenser og utstyr, som produserer avhengige av strømforsyning og frysere. Det er også lagt til en konserveringsmiddelløsning for å garantere stabiliteten av nukleinsyrer for forsendelse for å referere til laboratorier om nødvendig. Metoden vi foreslår kalles VirWaTest og er utviklet med samarbeid mellom GenIUL og Intermon Oxfam.Før du starter, bør antall prøver som skal testes vurderes for fremstilling av reagenser og materiale. Det anbefales å samle to repliker av hver vannprøve for å oppnå representative resultater. Flere prøver kan testes samtidig hvis riktig mengde materiale er tilgjengelig.Reagenser og materialer skal tilberedes og pakkes før de flyttes eller sendes til stedet der metoden er nødvendig. Listen over materialer og lite utstyr som skal pakkes er beskrevet i tabell én. Forbered en bakteriofag MS2-lager som skal legges til hver vannprøve som en prosesskontroll ved å følge den tilsvarende ISO-metoden.Fordel deretter 10 mikroliter av en suspensjon som inneholder 10 til 10 plattformenheter som er forhåndsinnskåret i 10 ml rør og la vannet tørke. Ett rør per vannprøve vil være nødvendig. I tillegg forberede ett rør som inneholder 10 mLs av sterilt destillert vann per samlet prøve.For den forhåndsflokkulerte skummede melkeoppløsningen, lag et rør som inneholder skummet melk, en glidelåsplastpose som inneholder havsaltet og en plastflaske som inneholder det destillerte vannet. For pH-justering, lag et rør som inneholder sitronsyre, et rør som inneholder natriumhydroksiden og to plastbeholdere med 25 og 50 mLs destillert vann. For hver vannprøve som skal testes, lag en kondisjoneringspose ved å tilsette havsaltene og sitronsyren til en glidelåsplastpose, og en konserveringsløsning ved å legge til lysisbufferen og nukleinsyrekonserveringsmiddelet, til et 5 ml rør.Til slutt, forberede fire nøytraliserende poser, legge strøm vaskemiddel til fire glidelås plastposer. For hver vannprøve som skal ekstraheres, klargjør du ett fem ml rør som inneholder magnetiske partikler og etanol, og tre 2 ml rør som inneholder henholdsvis 500, 600 og 200 mikroliter vaskebuffere henholdsvis en, to og tre, og ett rør som inneholder elutionbuffer. To forskjellige nukleinsyreekstraksjoner kan analyseres samtidig i hver PCR-analyse hvis en Newell termocycler brukes.For alle PCR-analyser, lag molekylærbiologivann. Forbered blandinger som inneholder to primere og ett bevis som er spesifikt for hvert målvirus i henhold til volumene og konsentrasjonene som er beskrevet i protokollen. For hvert virus, legg de angitte volumene i rørene en til åtte av et rørbrett.Klipp stripen, dele den i to strimler. Rør en til fem og rør seks til åtte. For hvert virus, lufttørre DNA suspensjoner som inneholder 10 til 5, 10 til 7, og 10 til 9 og kjente kopier pre-laget i rør seks, syv og åtte.Denne konsentrasjonsprotokollen er basert på prinsippet om organisk flocculation som den lave pH- og høyledningsevnetilstanden driver skummet melkeproteiner til å organisere seg i floker virusene absorberer til. Når flokene er avgjort, kan de lett samles inn. Samle en 10 liters vannprøve i en flatbunnsbøtte utstyrt med et lokk.Hvis du samler opp fra et rør, la vannet renne i noen sekunder før du samler vannet. Det er viktig å bruke klare bøtter for å visualisere pellets. Se etter et flatt rom på et friskt sted langt fra direkte sollys Sett en magnetisk rører koblet til et batteri under bøttestøtten og plasser bøtten som inneholder vannprøven på hver støtte.Revurdere sitronsyre og natriumhydroksid og rist til de er helt oppløst. Hell 500 mLs destillert vann i en stand-up bag og legg posen på en magnetisk rører. Tilsett innholdet i en havsaltpose og innholdet i ett skummet melkerør og rør i fem minutter med middels hastighet.Juster pH-en til den flokulerte skummet melk ved hjelp av sitronsyre og natriumhydroksid til en pH mellom 3,4 og 3,6. Slå av den magnetiske røreren og kontroller at flytene er synlige. En lommelykt kan bidra til å visualisere flytene.Slipp en røremagnet i vannet. Still inn den magnetiske røreren med maksimal hastighet og slå den på. Tilsett 10 mLs destillert vann til et prosessstyrt rør.Inverter den noen ganger og hell løsningen i vannet. Hell innholdet i en prøvekondisjoneringspose i vannet og rør i fem minutter. Kontroller at pH-en til vannprøven, som skal være mellom 3,4 og 3,6.Juster pH om nødvendig. Tilsett 100 ml forhåndsflokkulert skummet melkeløsning, forsegle bøtte med lokket og la vannet røre i åtte timer ved minimumshastighet. Etter åtte timer, slå av den magnetiske røreren og la flytene til å bosette seg i minst fem ekstra timer.Med et system basert på bruk av en pipettekontroller, et plastrør og et par pipetter, kast det overnaturlige, vær forsiktig så du ikke forstyrrer flokene på bøttebunnen. Når vannstanden er i ferd med å nå røremagneten, klem plastrøret for å stoppe vannstrømmen og flytte bort pipetten fra bøtten. Rist bøtta for å bruke flokene på nytt og hell dem i en stand-up plastpose.La flokene bosette seg i en ekstra time. Aspirer forsiktig vannet supernatant ved hjelp av en pipette unngå å forstyrre flokene. Aspirer flokene ved hjelp av en pipette og overfør dem til et konisk rør.Legg merke til det endelige volumet av prøvekonsentrat og overfør 1 ml til et rør som inneholder konserveringsmiddelløsningen. Suspensjonen kan enten brukes til å utføre nukleinsyreekstraksjon i feltet, eller sende til et referanselaboratorium for videre analyse. Vannet som kastes under oppsamling av flytene må behandles før deponering.Tilsett innholdet i en nøytraliserende middelpose i bøtta som inneholder det kasserte vannet. Bland vannet og la det stå stille i tretti minutter. Kast deretter det behandlede vannet som generelt avfall.De magnetiske partiklene kan overføres fra ett rør til et annet ved hjelp av en magnetisk pipette. Bli vant til driften av en magnetisk pipette før du utfører ekstraksjonen. Ordne rørene som inneholder reagensen som kreves for ekstraksjon i et stativ.Det vil si fra venstre til høyre: bindingsbuffer, vaskebuffere og elutionbuffer. Overfør 1 ml prøvekonsentrat til røret som inneholder bindingsbufferen ved hjelp av en engangs plastpipette. Inverter røret ti ganger for å optimalisere løsningen.Inkuber oppløsningen ved romtemperatur i ti minutter mens du kontinuerlig blander enten ved hjelp av en solo orbital eller manuelt. Samle de magnetiske partiklene ved hjelp av en magnetisk pipette og en ren spiss som kan brukes om igjen for de tre vaskebufferne og slipp de magnetiske partiklene inn i røret som inneholder vaskebuffer en. Vask dem ved å riste oppløsningen forsiktig med spissen i tretti sekunder og samle dem.Gjenta denne vaskeprosedyren for å vaske buffere to og tre. Samle de magnetiske partiklene i vaskebuffer tre og slipp dem ut i røret som inneholder elutionbufferen. Kast deretter spissen.Inkuber løsningen ved romtemperatur i fem minutter mens du kontinuerlig blander ved hjelp av solo orbital. Bytt spissen på den magnetiske pipetten med en og samle alle magnetiske partikler fra elutionbufferen. Kast spissen med partiklene festet.Nukleinsyren forblir i elutionbufferen, som skal lagres for videre analyse eller forsendelse. Bruk en fem-rørs og en tre-rørs stripe forberedt på å oppdage menneskelige adenovirus. Tilsett vann, PCR-blanding og nukleinsyreavsnedsement til rørene en til fem i henhold til protokollen.Etterpå legger du til vann- og PCR-miks til rørene seks til åtte. Sett begge stripene i termocycleren og velg riktig kjøring. Når kjøringen er fullført, samle resultatene og analysere innhentede data.Bare når virustester har resultert i negativ, bør MS2-deteksjon utføres. Bruk rørlister klargjort for MS2-deteksjon og velg riktig termisk profil for PCR. Den VirWaTest magnetiske nukleinsyre ekstraksjon ble sammenlignet med QIAgen viral RNA, etterlignet det ved å teste vannprøver pigget med menneskelige adenovirus og MS2.Reduksjonstest p-verdi viser betydelig høyere virale gjenopprettinger ved hjelp av VirWaTest enn QiAgen som en ekstraksjonsmetode for begge virusene som er testet. Den utviklede metoden for viral konsentrasjon ble testet i feltet med samarbeid mellom Oxfam vasketeam lokalisert i Bangui, Den sentralafrikanske republikk og i Pedernales, Ecuador, som samlet vannprøver, konsentrerte dem ved å bruke den utviklede konsentrasjonsmetoden, og sendte dem til laboratoriet i Barcelona for nukleinsyreutvinning og viral kvantifisering. I Ecuador ble humane adenovirus oppdaget i alle prøver testet, mens en av fem prøver samlet inn og konsentrert i Bangui testet positivt for menneskelige adenovirus.Den utviklede metoden har vist seg å være nyttig da den ble evaluert av vasketeamene til Oxfam Intermon i Bangui, Den sentralafrikanske republikk og av et annet team i Pedernales, Ecuador. VirWaTest kan være en del av et tidlig varslingssystem eller kan brukes i utbruddsundersøkelse av organisasjoner som er involvert i vannseritering. Dette utstyret forenkler analysen av viruspatogener i vann og forbedring av vannsikkerhetshåndtering med mål om å redusere hendelser av virussykdommer i humanitære krisesammenhenger.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Kostnadseffektiv metode for mikrobiell kilde Tracking med bestemte mennesker og dyr virus

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Glass Ull Filtre for å konsentrere Vanntynnbare Virus og landbruksprodukter zoonotiske patogener

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

En modifisert EPA Method 1623 som bruker tangentiell Flow Hollow-fiber ultrafiltrasjon og Heat dissosiasjon Fremgangsmåte for å oppdage vannfortynnbar<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Og<em&gt; Giardia spp..</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Etablering av en flytende dekket Culture of Polarized Menneskelig Airway Epiteliale Calu-3 Cells å studere Host Cell Response til luftveispatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitative og kvantitative analyser for påvisning og karakterisering av Protein antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Rapid Molecular Detection og Differensiering av influensavirus A og B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinne Prøvetaking metode for påvisning av humant Norovirus på overflater

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetisk rører metode for påvisning av<em&gt; trikiner</em&gt; Larver i Muscle Samples

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...