Name: virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest fue un proyecto de investigación financiado por el programa HIF (Humanitarian Innovation Funds) de ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Los autores reconocen a los equipos de WASH que amablemente colaboraron en este estudio. El análisis de muestras en Ecuador fue financiado por Oxfam Ecuador y Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Américas (AMB). BRT.17.01). S. Bofill-Mas es serra-hunter becarios en la Universidad de Barcelona.

1. Preparación y envasado
NOTA: Los materiales/equipos que se van a embalar se enumeran en la Tabla1. Utilice guantes para manipular los reactivos necesarios para el control del proceso, los reactivos de concentración, los reactivos de extracción de ácido nucleico y los reactivos de detección. Use gafas protectoras para manipular los reactivos necesarios para la extracción de ácido nucleico.
<ol><li>Control de procesos
	<ol>
<li>Preparar el cultivo de...

<ol>
	<li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).</li><li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).</li><li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques.">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li><li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants,+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water.">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li><li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification.">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li><li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterically+infecting+viruses:+Pathogenicity,+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection.">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li><li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage.">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator.">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li><li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li><li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat,+UV-B+radiation,+and+singlet+oxygen:+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results.">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li><li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay.">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).</li><li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses,+bacteria+and+protozoa.">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li></ol>

El método VirWaTest permite la concentración de virus y la extracción de ácido nucleico de muestras de agua en el punto de uso por usuarios no experimentados. Es un protocolo asequible, rápido y simple. La concentración se basa en el principio de la floculación orgánica utilizando leche desnatada, por el cual el bajo pH y las condiciones de alta conductividad hacen que las proteínas de leche desnatadas se acumulen en flocs los virus adsorbe. Cuando el sedimento flocs, es fácil de recoger, lo que permite concent...

Durante las primeras fases de cualquier emergencia humanitaria, el acceso a suministros de agua potable, saneamiento e higiene es fundamental para la supervivencia de los afectados. Por lo tanto, el control de la calidad del agua es una prioridad para prevenir brotes transmitidos por el agua. Es bien sabido que el agua contaminada es con frecuencia el origen de las enfermedades, pero a menudo es difícil determinar las fuentes de brotes virales como el virus de la hepatitis E (HEV), incluso con la disponibilidad de métodos de laboratorio convencionales. El control de la calidad del agua se basa en la cuantificación de FIB1,2,3,4. Sin embargo, se ha documentado ampliamente que no existe correlación entre la ausencia de FIB y la presencia de patógenosvirales transmitidos por el agua como rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV 5,6. Por lo tanto, el uso de los criterios de calidad del agua basados en la FIB podría dar lugar a una subestimación de los riesgos asociados con la presencia de patógenos virales transmitidos por el agua. La vigilancia de los virus indicadores, como los adenovirus humanos (HAdV), o patógenos específicos sería útil para definir la exposición a patógenos víricas e identificar la fuente potencial de infección humana7,8, 9,10 y en la validación de la eficacia de las medidas de saneamiento11.
Hasta ahora, la detección de virus en estos escenarios dependía de personal cualificado y logística compleja. VirWaTest (virwatest.org) está dirigido al desarrollo de un método simple, asequible y portátil para la concentración y posterior detección de virus a partir de muestras de agua en el punto de uso.
La concentración del virus se basa en el principio de floculación orgánica de muestras de agua de 10 L, mediante la cual los virus se recuperan en volúmenes más pequeños12,13. Los flocs se recogen y se añaden a un tampón que lyses los virus y evita que los ácidos nucleicos de degradación cuando se almacenaron a temperatura ambiente durante no más de 2 semanas.
El método de extracción de ácido nucleico se basa en el uso de partículas magnéticas a las que los ácidos nucleicos se absorben. Se pueden transferir de un tampón de lavado a otro y finalmente al tampón de elución mediante el uso de una pipeta magnética a la que se adhieren las partículas. Las suspensiones de ácido nucleico viral obtenidas se pueden enviar a un laboratorio de referencia donde la detección se puede realizar utilizando métodos moleculares basados en PCR. Para cada extracción de ácido nucleico, se prueban dos cantidades diferentes para descartar la inhibición enzimática originada por la muestra. Alternativamente, con una disponibilidad mínima del equipo, las pruebas de PCR se pueden ejecutar en el punto de uso. Todo el proceso está diseñado para realizarse independientemente de una fuente de alimentación (Figura1).
Un ensayo cuantitativo de PCR para detectar el Vhv, excretado por los seres humanos y encontrado en muestras de aguas residuales en altas concentraciones, se ha adaptado para ser ejecutado en el punto de uso. HAdV se utilizan como indicadores virales fecales humanos. También se ha adaptado un PCR para la cuantificación del bacteriófago MS2 desde que MS2 se utiliza en VirWaTest como control de procesos. El método se puede personalizar para la detección de cualquier virus de interés.
Después del desarrollo, el método VirWaTest ha sido aplicado por los usuarios en dos configuraciones diferentes en la República de Frica Central (RCA) y Ecuador, proporcionando retroalimentación sobre la aplicación del protocolo en situaciones reales.
Hasta nuestro punto de conocimiento, este es el primer procedimiento que permite la concentración y detección de virus en el punto de uso, independientemente de cualquier fuente de alimentación, equipos de gran tamaño y condiciones de congelación/refrigeración. Se recomienda recoger dos réplicas de cada muestra de agua con el fin de obtener resultados robustos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1677px;" width="1677">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-14-00001</td>
			<td style="width:989px;">Includes Solis Biodyne&#39;s 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">8-Microtube Strips with Caps</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">840637</td>
			<td>Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Aquagenx CBT E. coli Kit</td>
			<td style="width:195px;">Aquagenx, LLC</td>
			<td style="width:123px;">ECCBT10</td>
			<td>10 Tests per Kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011674</td>
			<td>Includes 12V car power adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket Support</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011648</td>
			<td>Aluminium support</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket, 10 L</td>
			<td style="width:195px;">Cater4You</td>
			<td style="width:123px;">10LTR</td>
			<td>Polypropilene, Tamperproof, Clear color</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Centrifuge Tube, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">CTSP-E50-050</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">1410181211</td>
			<td>Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Clear PET Bottle</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FPET-500-088</td>
			<td style="width:989px;">Clear Color, PET, Cap Not Included</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Difco Skim Milk, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">232100</td>
			<td>Dehydrated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">DNA/RNA Shield, 250 mL</td>
			<td style="width:195px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">R1100-250</td>
			<td>DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Easy9 Pipette Controller</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">EAS9-001-001</td>
			<td>0.3 &#956;m filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030121023</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030120094</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 5 mL</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">999542</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Ethanol 96% V/V, 1 L</td>
			<td style="width:195px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">361085-1611</td>
			<td>For UV, IR&#160; and HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Laboratory Tweezers</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FORS-007-002</td>
			<td>Thin, Curved End, L= 120 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900017000</td>
			<td>Battery-powered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Marker</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">929203</td>
			<td style="width:989px;">Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Micro Rota-Rack for Microtubes</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">37782</td>
			<td>4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Mini8 Real-Time PCR Cycler</td>
			<td style="width:195px;">Coyote Biosciences, China</td>
			<td style="width:123px;">Mini-8</td>
			<td>Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">NucliSens Lysis Buffer</td>
			<td style="width:195px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:123px;">200292</td>
			<td>Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900136N</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">PE Screw Cap PP28</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">TP28-004-020</td>
			<td style="width:989px;">For PET Bottles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">pH Indicator Strip</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">WSPH-001-001</td>
			<td>Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Plastic Test Tube</td>
			<td style="width:195px;">Quimikals</td>
			<td style="width:123px;">300913</td>
			<td>Includes Cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">PIPP-003-500</td>
			<td>Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409726</td>
			<td>Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409526G</td>
			<td>Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Powder Powder Detergent</td>
			<td style="width:195px;">-</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>Regular Powder Soap for washing clothes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Power Cables for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011692</td>
			<td>Connection between batteries and magnetic stirrers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Magnetic Tool</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24001</td>
			<td>Hand-held tool for magnetic particles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Tips in Box</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24296</td>
			<td>RNase-Free, Autoclaved, 96 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">SN51100</td>
			<td>3.2 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sea Salts</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S9883-500G</td>
			<td>An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Silicone Tubing</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">SILT-006-005</td>
			<td>Roll of 5 Meters, Inner&#160; &#248; x Outer&#160; &#248;= 6 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td>
			<td style="width:195px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">28244295</td>
			<td>Pellets, 1 Kg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Solar Rotary Platform</td>
			<td style="width:195px;">SOL-EXPERT Group</td>
			<td style="width:123px;">70020</td>
			<td>Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SOLIScript 1-step Probe Kit</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-57-00250</td>
			<td>Includes Solis Biodyne&#39;s 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">21.141-4197</td>
			<td>Includes BioTools&#39;s BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">045926</td>
			<td>Pivot Ring, L x&#160; &#248; = 38 x 8 mm, Blue</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">PN10E1</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900043</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">22001-4291</td>
			<td>Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Water Molecular Biology Reagent, 1L</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">W4502-1L</td>
			<td>Nuclease and Protease Free, 0.1 &#956;m Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Whirl-Pak Bag, 540 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">200361</td>
			<td>Stable bottom</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Zip Lock Plain Bag</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">BZIP-080-100</td>
			<td>Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples

Los virus excretados por humanos y animales pueden contaminar las fuentes de agua y representar un riesgo para la salud humana cuando esta agua se utiliza para beber, irrigación de alimentos, lavado, etc. El indicador clásico de bacterias fecales no siempre comprueba la presencia de patógenos virales, por lo que la detección de patógenos vímicos e indicadores virales es relevante para adoptar medidas de mitigación del riesgo, especialmente en escenarios humanitarios y en zonas cuando los brotes virales transmitidos por el agua son frecuentes.
En la actualidad, varias pruebas comerciales que permiten la cuantificación de bacterias indicadoras fecales (FIB) están disponibles para su análisis en el punto de uso. Sin embargo, tales pruebas comerciales no están disponibles para la detección de virus. La detección de virus en muestras de agua ambiental requiere concentrar varios litros en volúmenes más pequeños. Además, una vez concentrado, la detección de virus se basa en métodos como la extracción de ácido nucleico y la detección molecular (por ejemplo, ensayos basados en la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]) de los genomas virales.
El método descrito aquí permite la concentración de virus a partir de muestras de agua de 10 L, así como la extracción de ácidos nucleicos virales en el punto de uso, con equipos simples y portátiles. Esto permite la prueba de muestras de agua en el punto de uso de varios virus y es útil en escenarios humanitarios, así como en cualquier contexto donde no se dispone de un laboratorio equipado. Alternativamente, el método permite concentrar los virus presentes en las muestras de agua y el envío del concentrado a un laboratorio a temperatura ambiente para su posterior análisis.

Desarrollo de métodos
Este procedimiento ha sido desarrollado en el Laboratorio de Virus Contaminantes del Agua y Alimentos con la colaboración de GenIUL y Oxfam Intermón. Consta de tres pasos diferentes. La primera, la concentración de partículas virales, es una adaptación de un método de floculación de leche desnatada descrito anteriormente12,17</sup...

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VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Aquí presentamos VirWaTest, que es un método simple, asequible y portátil para la concentración y detección de virus de muestras de agua en el punto de uso.

VirWaTest, un método de punto de uso para la detección de virus en muestras de agua

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Los virus entéricos se encuentran principalmente en diferentes embalses acuáticos, incluyendo aguas subterráneas, aguas quietas, arroyos, ríos y agua r. Están asociados con riesgos para la salud y son responsables de las infecciones en los seres humanos. Los virus entéricos suelen causar gastroenteritis y se transmiten principalmente por la vía fecal-oral.Otras enfermedades transmitidas por el agua causan hepatitis aguda por el virus de la hepatitis A y los virus de la hepatitis E, con una mortalidad asociada significativa, especialmente con respecto a la hepatitis E en mujeres embarazadas. Los protocolos reales para el seguimiento de la calidad del agua propuestos para contextos humanitarios han sido diseñados para mantener bacterias como E. coli como un indicador de contaminación fecal. Pero ya se sabe que no hay correlación con otros microorganismos como los virus que son más resistentes a muchos procesos de activación.Hasta ahora, la detección de virus en entornos humanitarios de crisis se ha realizado adaptando los protocolos existentes a las condiciones de esos contextos y enviando muestras a laboratorios de referencia para la detección molecular de virus. Es necesario establecer métodos para detectar patógenos virales e indicadores virales en el punto de vista para reducir los riesgos para la salud pública, prevenir brotes y aumentar la eficiencia de las intervenciones humanitarias. Proponemos un método para la detección de virus en muestras de agua de 10 litros que se divide en tres pasos: Concentración viral, extracción de ácido nucleico y detección viral.Todos estos pasos han sido adaptados a partir de los métodos actualmente en uso en nuestro laboratorio, y se pueden realizar en el punto de vista mediante el uso de reactivos y equipos portátiles, produciendo los dependientes de la fuente de alimentación y congeladores. Además, se ha añadido una solución conservante al método para garantizar la estabilidad de los ácidos nucleicos para su envío a laboratorios de referencia si es necesario. El método que proponemos se llama VirWaTest y ha sido desarrollado con la colaboración de GenIUL e Intermon Oxfam.Antes de empezar, se debe tener en cuenta el número de muestras a analizar para la preparación de reactivos y material. Se recomienda recoger dos réplicas de cada muestra de agua para obtener resultados representativos. Se pueden probar varias muestras al mismo tiempo si se dispone de la cantidad adecuada de material.Los reactivos y materiales deben prepararse y embalarse antes de moverse o enviarse al lugar donde se necesita el método. La lista de materiales y equipos pequeños que deben embalarse se describe en la tabla uno. Preparar un stock bacteriófago MS2 que se añadirá a cada muestra de agua como control del proceso siguiendo el método ISO correspondiente.A continuación, distribuya 10 microlitros de una suspensión que contenga de 10 a 10 unidades de plataforma pre-fabricadas en tubos de 10 ml y deje que el agua se seque. Se necesitará un tubo por muestra de agua. Además, prepare un tubo que contenga 10 ml de agua destilada estéril por muestra recolectada.Para la solución de leche desnatada pre floculada, prepare un tubo que contenga la leche desnatada, una bolsa de plástico con cremallera que contenga la sal marina y una botella de plástico que contenga el agua destilada. Para el ajuste del pH, prepare un tubo que contenga el ácido cítrico, un tubo que contenga el hidróxido de sodio y dos recipientes de plástico con 25 y 50 ml de agua destilada. Para cada muestra de agua a probar, preparar un sobre acondicionador añadiendo las sales marinas y el ácido cítrico a una bolsa de plástico de cremallera, y una solución de conservación mediante la adición del tampón de lisis, y conservante de ácido nucleico, a un tubo de 5 ml.Por último, prepare cuatro sobres neutralizantes, añadiendo detergente de potencia a cuatro bolsas de plástico con cremallera. Para cada muestra de agua que se extraiga, prepare un tubo de cinco ml que contenga partículas magnéticas y etanol, y tres tubos de 2 ml que contengan 500, 600 y 200 microlitros de tampones de lavado uno, dos y tres, respectivamente, y un tubo que contenga tamampón de elución. Se pueden analizar simultáneamente dos extracciones diferentes de ácido nucleico en cada ensayo de PCR si se utiliza un termociclador Newell.Para todos los ensayos de PCR, preparar el agua de biología molecular. Preparar mezclas que contengan dos imprimaciones y una prueba específica para cada virus objetivo de acuerdo con los volúmenes y concentraciones descritos en el protocolo. Para cada virus, agregue los volúmenes indicados en los tubos de uno a ocho de una bandeja de tubos.Corta la tira, dividiéndola en dos tiras. Tubos uno a cinco y tubos de seis a ocho. Para cada virus, suspensión de ADN seco al aire que contienen de 10 a 5, 10 a 7 y 10 a 9 y copias conocidas hechas previamente en tubos seis, siete y ocho.Este protocolo de concentración se basa en el principio de floculación orgánica por el cual el pH bajo y la condición de alta conductividad impulsan las proteínas de leche descremadas para organizar en flocs a los que absorben los virus. Una vez que los flocs están resueltos, se pueden recoger fácilmente. Recoger una muestra de agua de 10 litros en un cubo de fondo plano provisto con una tapa.Si se recoge de una tubería, deje que el agua corra durante unos segundos antes de recoger el agua. Es importante utilizar cubos transparentes para visualizar pellets. Busque un espacio plano en un lugar fresco lejos de la luz solar directa Coloque un agitador magnético conectado a una batería debajo del soporte del cucharón y coloque el cubo que contiene la muestra de agua en cada soporte.Reconsidere el ácido cítrico y el hidróxido de sodio y agite hasta que se disuelvan por completo. Vierta 500 ml de agua destilada en una bolsa de pie y coloque la bolsa en un agitador magnético. Agregue el contenido de un sobre de sal marina y el contenido de un tubo de leche descreado y revuelva durante cinco minutos a velocidad media.Ajuste el pH de la leche desnatada floculada utilizando ácido cítrico e hidróxido de sodio a un pH entre 3,4 y 3,6. Apague el agitador magnético y asegúrese de que los flocs estén visibles. Una linterna puede ayudar a visualizar los flocs.Suelte un imán de agitación en el agua. Ajuste el agitador magnético a la máxima velocidad y enciéndalo. Añadir 10 ml de agua destilada a un tubo controlado por proceso.Invertir un par de veces y verter la solución en el agua. Vierta el contenido de un sobre de acondicionamiento de muestra en el agua y revuelva durante cinco minutos. Asegúrese de que el pH de la muestra de agua, que debe estar entre 3,4 y 3,6.Ajuste el pH si es necesario. Añadir 100 ml de solución de leche desnatada pre-floculada, sellar el cubo con la tapa y dejar el agua revolviendo durante ocho horas a una velocidad mínima. Después de ocho horas, apague el agitador magnético y deje que los flocs se conformen durante al menos cinco horas adicionales.Con un sistema basado en el uso de un controlador de pipetas, un tubo de plástico y un par de pipetas, deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar a los flocs en el fondo del cucharón. Cuando el nivel de agua esté a punto de llegar al imán de agitación, apriete el tubo de plástico para detener el flujo de agua y aleje la pipeta del cubo. Agitar el cubo para resuspender los flocs y verterlos en una bolsa de plástico de pie.Permita que los flocs se conformen durante una hora extra. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de agua usando una pipeta evitando molestar a los flocs. Aspirar los flocs con una pipeta y transferirlos a un tubo cónico.Anote el volumen final del concentrado de muestra y transfiera 1 ml a un tubo que contenga la solución conservante. La suspensión se puede utilizar para realizar la extracción de ácido nucleico en el campo, o enviar a un laboratorio de referencia para su posterior análisis. El agua desechada durante la recogida de los flocs debe tratarse antes de su eliminación.Agregue el contenido de un sobre de agente neutralizante al cucharón que contiene el agua desechada. Mezcle el agua y déjela quieta durante treinta minutos. A continuación, deseche el agua tratada como residuo general.Las partículas magnéticas se pueden transferir de un tubo a otro utilizando una pipeta magnética. Acostumbrarse al funcionamiento de una pipeta magnética antes de realizar la extracción. Coloque los tubos que contienen el reactivo necesario para la extracción en un bastidor.Es decir, de izquierda a derecha: búfer de enlace, búferes de lavado y búfer de elución. Transfiera 1 ml de concentrado de muestra al tubo que contiene el tampón de unión utilizando una pipeta de plástico desechable. Invierta el tubo diez veces para optimizar la solución.Incubar la solución a temperatura ambiente durante diez minutos mientras se mezcla continuamente utilizando un orbital solo o manualmente. Recoger las partículas magnéticas utilizando una pipeta magnética y una punta limpia que se puede reutilizar para los tres tampones de lavado y liberar las partículas magnéticas en el tubo que contiene el búfer de lavado uno. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante treinta segundos y recógelos.Repita este procedimiento de lavado para lavar los tampones dos y tres. Recoger las partículas magnéticas en el tampón de lavado tres y liberarlos en el tubo que contiene el tampón de elución. A continuación, deseche la punta.Incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras se mezcla continuamente utilizando el orbital en solitario. Sustituya la punta de la pipeta magnética por cualquiera y recoja todas las partículas magnéticas del búfer de elución. Deseche la punta con las partículas conectadas.El ácido nucleico permanece en el tampón de elución, que debe almacenarse para su posterior análisis o envío. Use una tira de cinco tubos y una tira de tres tubos preparada para detectar adenovirus humanos. Agregue agua, mezcla de PCR y extracción de ácido nucleico a los tubos uno a cinco de acuerdo con el protocolo.Después, agregue agua y PCR a los tubos de seis a ocho. Coloque ambas tiras en el termociclador y seleccione la carrera adecuada. Una vez finalizada la ejecución, recopile los resultados y analice los datos obtenidos.Sólo cuando las pruebas virales han dado lugar a negativo, se debe realizar la detección de MS2. Utilice tiras de tubo preparadas para la detección de MS2 y seleccione el perfil térmico adecuado para la PCR. La extracción de ácido nucleico magnético VirWaTest se comparó con el ARN viral QIAgen, lo im imitaba probando muestras de agua espigadas con adenovirus humanos y MS2.El valor p de la prueba de reducción muestra recuperaciones virales significativamente más altas mediante el uso de VirWaTest que QiAgen como método de extracción para ambos virus probados. El método desarrollado para la concentración viral se probó en el campo con la colaboración de los equipos de lavado de Oxfam ubicados en Bangui, República Centroafricana y en Pedernales, Ecuador, que recogieron muestras de agua, las concentraron aplicando el método de concentración desarrollado, y las enviaron al laboratorio de Barcelona para la extracción de ácido nucleico y la cuantificación viral. En Ecuador, se detectaron adenovirus humanos en todas las muestras analizadas, mientras que una de cada cinco muestras recogidas y concentradas en Bangui dieron positivo para los adenovirus humanos.El método desarrollado ha demostrado ser útil cuando fue evaluado por los equipos de lavado de Oxfam Intermon en Bangui, República Centroafricana y por otro equipo en Pedernales, Ecuador. VirWaTest puede ser parte de un sistema de alerta temprana o puede ser utilizado en la investigación de brotes por organizaciones involucradas en el saneamiento del agua. Este equipo facilita el análisis de patógenos virales en el agua y la mejora de la gestión de la seguridad del agua con el objetivo de reducir los incidentes de enfermedades virales en contextos humanitarios de crisis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

El uso de fluorescentes inmunoquímica para la detección de Edwardsiella ictaluri En el bagre de canal ( I. punctatus) Muestras

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Investigación

Inmunología e Infección

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Método rentable para el Rastreo de uso microbiana específica virus humanos y animales

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Los filtros de lana de vidrio para la concentración de virus transmitidas por el agua y la agricultura patógenos zoonóticos

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

Una modificación de la EPA Método 1623 que utiliza el flujo tangencial de fibra hueca de ultrafiltración y la Plaza de calor de disociación para detectar a base de agua<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Y<em&gt; Esp.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Los ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección y caracterización de proteínas de antimicrobianos

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Método del agitador magnético para la detección de<em&gt; Trichinella</em&gt; Las larvas en muestras de músculo

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...