Name: virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest var ett forskningsprojekt finansierat av HIF (humanitärt innovationsfonder) program för ELHRA (förbättra lärandet & forskning för humanitärt bistånd). Författarna erkänner de tvätt team som vänligt samarbetade i denna studie. Analysen av prover i Ecuador finansierades av Oxfam Ecuador och Dirección de Investigaciones de La Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-Mas är en Serra-Hunter Fellow vid universitetet i Barcelona.

1. beredning och förpackning
Anm.: de material/den utrustning som ska packas anges i tabell 1. Använd handskar för att hantera de reagenser som krävs för processtyrningen, koncentrationsreagenser, reagens för nukleinsyreextraktion och detekterings reagenser. Använd skyddsglasögon för att hantera de reagens som krävs för nukleinsyrgasextraktion.
<ol><li>Processtyrning
	<ol>
<li>Förbered MS2 bakteriofage Stock kultur (American typ kultursamling [AT...

<ol>
	<li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , (2011).</li><li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , (2009).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Drinking-water Quality. , (2011).</li><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , (2015).</li><li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques.">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li><li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants,+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water.">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li><li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification.">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li><li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterically+infecting+viruses:+Pathogenicity,+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection.">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li><li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage.">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices.">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li><li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator.">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li><li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , (1995).</li><li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel,+Mytilus+edulis:+the+first+Scandinavian+report.">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li><li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat,+UV-B+radiation,+and+singlet+oxygen:+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results.">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li><li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay.">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li><li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses.">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).</li><li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses,+bacteria+and+protozoa.">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li></ol>

Metoden VirWaTest möjliggör koncentration av virus och nukleinsyreutvinning från vattenprover vid den tidpunkt då de används av icke-erfarna användare. Det är ett överkomligt, snabbt och enkelt protokoll. Koncentrationen bygger på principen om organisk flocympning med skummjölk, genom vilken lågt pH och hög konduktivitet gör skum mjölks proteiner samlade i flockar virusen adsorberas till. När flockar sediment är det lätt att samla in dem, vilket gör det möjligt att koncentrera 10 L vatten, medan tradit...

Under de första faserna av humanitära nödsituationer är tillgången till rent vatten, sanitet och hygien avgörande för de drabbade. Därför är övervakning av vattenkvaliteten en prioriterad fråga för att förhindra vattenburna utbrott. Det är välkänt att förorenat vatten ofta är ursprunget till sjukdomar, men det är ofta svårt att bestämma källorna till virusutbrott såsom hepatit E-virus (HEV), även med tillgången till konventionella laboratoriemetoder. Kontrollen av vattenkvaliteten baseras på kvantifieringen av FIB1,2,3,4. Det har dock dokumenterats utförligt att det inte finns något samband mellan avsaknaden av FIB och förekomsten av virala vattenburna patogener som rotavirus (RoV), norovirus (NoV) eller HEV5,6. Att använda de kriterier för vattenkvalitet som grundar sig på FIB kan således leda till en underskattning av de risker som är förknippade med förekomst av vattenburna virala patogener. Övervakningen av indikator virus, såsom humana adenovirus (hadv), eller specifika patogener skulle vara till hjälp vid fastställandet av exponeringen för virala patogener och identifiera den potentiella källan till infektion7,8, 9,10 och validering av effektiviteten av sanitära åtgärder11.
Fram till nu förlitade sig upptäckten av virus i dessa scenarier på kompetent personal och komplex logistik. VirWaTest (virwatest.org) syftar till att utveckla en enkel, prisvärd och bärbar metod för koncentrationen och efterföljande upptäckt av virus från vattenprover vid tidpunkten för användning.
Virus koncentrationen bygger på principen om organisk floculation av 10 L vattenprover, genom vilka virus återvinns i mindre volymer12,13. De flockar samlas in och läggs till en buffert som lyserar virusen och förhindrar att nukleinsyror från nedbrytning när de förvaras vid rumstemperatur i högst 2 veckor.
Den nukleinsyra extraktionsmetoden är baserad på användningen av magnetiska partiklar som nukleinsyror får adsorberat. De kan överföras från en tvättbuffert till en annan och slutligen in i elutionsbufferten med hjälp av en magnetisk pipett som partiklarna fäster. Virala nukleinsyra suspensioner erhålls kan transporteras till ett referenslaboratorium där upptäckten kan utföras med hjälp av molekylära metoder baserade på PCR. För varje nukleinsyrafutering testas två olika kvantiteter för att utesluta enzymatisk hämning som har sitt ursprung i provet. Alternativt kan PCR-test köras vid användnings punkten med minimal utrustnings tillgänglighet. Hela processen är konstruerad för att utföras oberoende av en strömförsörjning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analys för att påvisa HAdV, som utsöndras av människor och återfinns i vattenprover i höga koncentrationer, har anpassats för att köras vid användnings punkten. HAdV används som humana fekala virala indikatorer. En PCR för quantificationen av MS2 Bakteriofag har också anpassats, sedan MS2 används i virwatest som processaa kontroll. Metoden kan anpassas för detektion av alla virus av intresse.
Efter utvecklingen har den VirWaTest metoden tillämpats av användarna i två olika inställningar i Republiken Centralafrika (RCA) och Ecuador, ge återkoppling om tillämpningen av protokollet i verkliga situationer.
Till vår kännedom, detta är det första förfarandet som gör att koncentrationen och detektion av virus vid tidpunkten för användning, oberoende av någon strömförsörjning, stor utrustning, och frysning/kyla förhållanden. Det rekommenderas att samla in två replikat av varje vattenprov för att få robusta resultat.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1677px;" width="1677">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-14-00001</td>
			<td style="width:989px;">Includes Solis Biodyne&#39;s 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">8-Microtube Strips with Caps</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">840637</td>
			<td>Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Aquagenx CBT E. coli Kit</td>
			<td style="width:195px;">Aquagenx, LLC</td>
			<td style="width:123px;">ECCBT10</td>
			<td>10 Tests per Kit</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011674</td>
			<td>Includes 12V car power adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket Support</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011648</td>
			<td>Aluminium support</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Bucket, 10 L</td>
			<td style="width:195px;">Cater4You</td>
			<td style="width:123px;">10LTR</td>
			<td>Polypropilene, Tamperproof, Clear color</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Centrifuge Tube, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">CTSP-E50-050</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Citric Acid 1-Hydrate, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">1410181211</td>
			<td>Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Clear PET Bottle</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FPET-500-088</td>
			<td style="width:989px;">Clear Color, PET, Cap Not Included</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Difco Skim Milk, 500 g</td>
			<td style="width:195px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">232100</td>
			<td>Dehydrated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">DNA/RNA Shield, 250 mL</td>
			<td style="width:195px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">R1100-250</td>
			<td>DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Easy9 Pipette Controller</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">EAS9-001-001</td>
			<td>0.3 &#956;m filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 0.5 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030121023</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 2 mL</td>
			<td style="width:195px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030120094</td>
			<td>Polypropilene, Safe-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Eppendorf Tube, 5 mL</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">999542</td>
			<td>Polypropylene, Sterile, Graduated</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Ethanol 96% V/V, 1 L</td>
			<td style="width:195px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:123px;">361085-1611</td>
			<td>For UV, IR&#160; and HPLC</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Laboratory Tweezers</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">FORS-007-002</td>
			<td>Thin, Curved End, L= 120 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900017000</td>
			<td>Battery-powered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Marker</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">929203</td>
			<td style="width:989px;">Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Micro Rota-Rack for Microtubes</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">37782</td>
			<td>4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Mini8 Real-Time PCR Cycler</td>
			<td style="width:195px;">Coyote Biosciences, China</td>
			<td style="width:123px;">Mini-8</td>
			<td>Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">NucliSens Lysis Buffer</td>
			<td style="width:195px;">Biomerieux</td>
			<td style="width:123px;">200292</td>
			<td>Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Open Tip Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900136N</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">PE Screw Cap PP28</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">TP28-004-020</td>
			<td style="width:989px;">For PET Bottles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">pH Indicator Strip</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">WSPH-001-001</td>
			<td>Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Plastic Test Tube</td>
			<td style="width:195px;">Quimikals</td>
			<td style="width:123px;">300913</td>
			<td>Includes Cap</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polyethylene Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">PIPP-003-500</td>
			<td>Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409726</td>
			<td>Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">409526G</td>
			<td>Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Powder Powder Detergent</td>
			<td style="width:195px;">-</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td>Regular Powder Soap for washing clothes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Power Cables for Magnetic Stirrer</td>
			<td style="width:195px;">GenIUL</td>
			<td style="width:123px;">900011692</td>
			<td>Connection between batteries and magnetic stirrers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Magnetic Tool</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24001</td>
			<td>Hand-held tool for magnetic particles</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick Tips in Box</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">24296</td>
			<td>RNase-Free, Autoclaved, 96 Units</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">QuickPick XL gDNA Magnetic Particles</td>
			<td style="width:195px;">BioNobile</td>
			<td style="width:123px;">SN51100</td>
			<td>3.2 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sea Salts</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">S9883-500G</td>
			<td>An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Silicone Tubing</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">SILT-006-005</td>
			<td>Roll of 5 Meters, Inner&#160; &#248; x Outer&#160; &#248;= 6 x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5%</td>
			<td style="width:195px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:123px;">28244295</td>
			<td>Pellets, 1 Kg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Solar Rotary Platform</td>
			<td style="width:195px;">SOL-EXPERT Group</td>
			<td style="width:123px;">70020</td>
			<td>Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SOLIScript 1-step Probe Kit</td>
			<td style="width:195px;">Solis BioDyne</td>
			<td style="width:123px;">08-57-00250</td>
			<td>Includes Solis Biodyne&#39;s 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">21.141-4197</td>
			<td>Includes BioTools&#39;s BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td>
			<td style="width:195px;">dD Biolab</td>
			<td style="width:123px;">045926</td>
			<td>Pivot Ring, L x&#160; &#248; = 38 x 8 mm, Blue</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 10 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">PN10E1</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Tape-End Serological Pipette, 50 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">900043</td>
			<td>Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover</td>
			<td style="width:195px;">BioTools</td>
			<td style="width:123px;">22001-4291</td>
			<td>Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Water Molecular Biology Reagent, 1L</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">W4502-1L</td>
			<td>Nuclease and Protease Free, 0.1 &#956;m Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Whirl-Pak Bag, 540 mL</td>
			<td style="width:195px;">Deltalab</td>
			<td style="width:123px;">200361</td>
			<td>Stable bottom</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:371px;">Zip Lock Plain Bag</td>
			<td style="width:195px;">LabBox</td>
			<td style="width:123px;">BZIP-080-100</td>
			<td>Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virwatest, a point-of-use method for the detection of viruses in water samples

Virus som utsöndras av människor och djur kan förora vattenkällor och utgöra en risk för människors hälsa när detta vatten används för att dricka, mat bevattning, tvättning, etc. Den klassiska fekal bakterie indikatorn kontrollerar inte alltid förekomsten av virala patogener, så upptäckten av virala patogener och virus indikatorer är relevant för att vidta åtgärder för att minska riskerna, särskilt i humanitära scenarier och i områden där vattenburna virusutbrott ofta förekommer.
För närvarande finns flera kommersiella tester som möjliggör kvantifiering av fekal indikatorbakterier (FIB) tillgängliga för testning vid användningstillfället. Sådana kommersiella tester är dock inte tillgängliga för detektion av virus. Upptäckten av virus i miljö vatten prover kräver att koncentrera flera liter i mindre volymer. Dessutom, när koncentrerad, upptäckten av virus förlitar sig på metoder såsom nukleinsyra utvinning och molekylär detektion (t. ex., polymeras kedjereaktion [PCR]-baserade analyser) av virala Genomes.
Den metod som beskrivs här tillåter koncentrationen av virus från 10 L vattenprover, samt utvinning av virala nukleinsyror vid tidpunkten för användning, med enkel och portabel utrustning. Detta gör det möjligt att testa vattenprover vid användnings punkten för flera virus och är användbar i humanitära scenarier, samt i alla sammanhang där ett utrustat laboratorium inte finns tillgängligt. Alternativt tillåter metoden att koncentrera virus som finns i vattenprover och frakten av koncentratet till ett laboratorium vid rumstemperatur för vidare analys.

Metodutveckling
Detta förfarande har utvecklats i laboratoriet av virus föroreningar av vatten och mat med samarbete med GenIUL och Oxfam Intermón. Den består av tre olika steg. Den första, virus partikelkoncentrationen, är en anpassning av en skum mjölks metod som tidigare beskrivits12,17,18. Den ursprungliga me...

Watch this Scientific Journal Video about VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples at JoVE.com

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

Här presenterar vi VirWaTest, som är en enkel, prisvärd och portabel metod för koncentration och detektion av virus från vattenprover vid tidpunkten för användning.

VirWaTest, en Point-of-use metod för detektion av virus i vattenprover

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

Enteriska virus finns mestadels i olika vattenlevande reservoarer, inklusive grundvatten, stilla vatten, bäckar, floder och r vatten. De är förknippade med hälsorisker och är ansvariga för infektioner hos människor. Enteric virus orsakar vanligen gastroenterit och överförs mestadels genom fekal-orala vägen.Andra vattenburna sjukdomar orsakar akut hepatit genom hepatit A-virus och hepatit E-virus, med signifikant associerad dödlighet särskilt avseende hepatit E hos gravida kvinnor. Faktiska protokoll för övervakning av vattenkvalitet som föreslås för humanitära sammanhang har utformats för att hålla bakterier som E.Coli som en indikator på fekal kontaminering. Men det är redan känt att det inte finns något samband med andra mikroorganismer såsom virus som är mer resistenta mot många aktiveringsprocesser.Hittills har detektering av virus i humanitära krisinställningar utförts genom att befintliga protokoll har kunnat anpassas till förhållandena i dessa sammanhang och att de levererar prover till referenslaboratorier för molekylär påvisande av virus. Det finns ett behov av metoder för att upptäcka viruspatogener och virusindikatorer i synpunkter för att minska riskerna för folkhälsan, förebygga utbrott och öka effektiviteten i de humanitära insatserna. Vi föreslår en metod för detektion av virus i 10 liters vattenprover som är uppdelad i tre steg:Viral koncentration, nukleinsyra extraktion, och viral detektion.Alla dessa steg har anpassats från metoder som för närvarande används i vårt laboratorium, och kan utföras i synpunkten genom att använda bärbara reagenser och utrustning, producera beroende av strömförsörjning och frysar. Även en konserveringsmedel lösning har lagts till metoden för att motivera stabiliteten av nukleinsyror för transport till referenslaboratorier om det behövs. Metoden vi föreslår heter VirWaTest och har utvecklats med samarbete mellan GenIUL och Intermon Oxfam.Innan start bör antalet prov som skall testas övervägas för beredning av reagens och material. Det rekommenderas att samla in två replikat av varje vattenprov för att få representativa resultat. Flera prover kan testas samtidigt om lämplig mängd material finns tillgängligt.Reagenser och material bör beredas och packas innan de flyttas eller skickas till den plats där metoden behövs. Listan över material och liten utrustning som bör packas beskrivs i tabell ett. Bered ett bakteriofage MS2-bestånd som skall tillsättas varje vattenprov som processkontroll genom att följa motsvarande ISO-metod.Distribuera sedan 10 mikroliter av en suspension som innehåller 10 till 10 plattformsenheter förgjord i 10 mL rör och låt vattnet torka. Ett rör per vattenprov kommer att behövas. Dessutom, förbereda ett rör som innehåller 10 mLs sterilt destillerat vatten per samlat prov.För den förflutna skummjölkslösningen, bered ett rör som innehåller skummjölken, en plastpåse med dragkedja som innehåller havssaltet och en plastflaska som innehåller det destillerade vattnet. För pH-justering, preparera ett rör som innehåller citronsyran, ett rör som innehåller natriumhydroxiden, och två plastbehållare med 25 och 50 mLs destillerat vatten. För varje vattenprov som ska testas, förbereda en konditionering påse genom att tillsätta havssalter och citronsyra till en dragkedja plastpåse, och en konservering lösning genom att lägga till lysbuffert, och nukleinsyra konserveringsmedel, till en 5 mL rör.Slutligen, förbereda fyra neutraliserande påsar, lägga till makt rengöringsmedel till fyra dragkedja plastpåsar. För varje vattenprov som skall extraheras, bereda ett fem mL-rör innehållande magnetiska partiklar och etanol, och tre 2 mL-rör som innehåller 500, 600, och 200 mikroliter av tvättbuffertar ett, två, respektive tre, och ett rör som innehåller elueringsbuffert. Två olika nukleinsyraextraktioner får analyseras samtidigt i varje PCR-analys om en Newell termocyklare används.För alla PCR-analyser, preparera molekylärbiologiskt vatten. Bered blandningar som innehåller två grund- och primrar och ett bevis som är specifika för varje målvirus enligt de volymer och koncentrationer som beskrivs i protokollet. För varje virus, lägg de angivna volymerna i rören ett till åtta av ett rör fack.Skär remsan, dela upp den i två remsor. Rör ett till fem och rör sex till åtta. För varje virus, lufttorr DNA suspensioner som innehåller 10 till 5, 10 till 7, och 10 till 9 och kända kopior färdiga till rör sex, sju och åtta.Detta koncentrationsprotokoll bygger på principen om organisk flocculation genom vilken det låga pH- och högledningstillståndet driver skummjölksproteinerna att organisera sig i flocs som virusen absorberar till. När flocs är avgjorda, kan de lätt samlas in. Samla ett 10 liters vattenprov i en platt botten hink som medföljer ett lock.Om samla från ett rör, låt vattnet rinna i några sekunder innan du samlar vattnet. Det är viktigt att använda tydliga hinkar för att visualisera pellets. Leta efter ett plant utrymme på en fräsch plats långt ifrån direkt solljus Sätt en magnetisk omrörare ansluten till ett batteri under hinkstödet och placera skopan som innehåller vattenprovet på varje stöd.Ompröva citronsyran och natriumhydroxiden och skaka tills de är helt upplösta. Häll 500 mLs destillerat vatten i en stand-up påse och placera påsen på en magnetisk omrörare. Tillsätt innehållet i en havssaltspåse och innehållet i ett skummjölksrör och rör om i fem minuter med medelhög hastighet.Justera pH-värdet för den flocculerade skummjölken med hjälp av citronsyra och natriumhydroxid till ett pH mellan 3,4 och 3,6. Stäng av magnetomröraren och se till att flokerna syns. En ficklampa kan hjälpa till att visualisera flocs.Släpp en omrörning magnet i vattnet. Ställ in magnetomröraren i högsta hastighet och sätt på den. Tillsätt 10 mLs destillerat vatten till ett processstyrt rör.Invertera det några gånger och häll lösningen i vattnet. Häll innehållet i ett prov konditionering påse i vattnet och rör om i fem minuter. Se till att vattenprovets pH-värde, som ska vara mellan 3,4 och 3,6.Justera pH-värdet om det behövs. Tillsätt 100 mLs färdigflukulerad skummjölkslösning, försegla skopan med locket och låt vattnet röra om i åtta timmar vid lägsta hastighet. Efter åtta timmar, stäng av magnetomröraren och låt flocs nöja sig med minst fem extra timmar.Med ett system baserat på användning av en pipettregulator, ett plaströr, och ett par pipetter, kassera supernatanten, var noga med att inte störa flocs på hinken botten. När vattennivån är på väg att nå omrörningsmagneten, pressa plaströret för att stoppa vattenflödet och flytta bort pipetten från skopan. Skaka hinken för att återanvända flocs och häll dem i en stand-up plastpåse.Låt flocs nöja sig med en extra timme. Aspirera försiktigt vattnet supernatant med hjälp av en pipett undvika att störa flocs. Aspirera flocs med hjälp av en pipett och överföra dem till ett koniskt rör.Notera ned den slutliga volymen provkoncentrat och överför 1 mL till ett rör som innehåller konserveringslösningen. Suspensionen kan antingen användas för att utföra nukleinsyrautvinningen i fält, eller skicka till ett referenslaboratorium för vidare analys. Det vatten som kasseras medan flocsna samlas upp måste behandlas före bortskaffande.Tillsätt innehållet i en tosning med neutraliserande medel i skopan som innehåller det kasserade vattnet. Blanda vattnet och lämna det stilla i trettio minuter. Släng sedan det behandlade vattnet som allmänt avfall.De magnetiska partiklarna kan överföras från ett rör till ett annat med hjälp av en magnetisk pipett. Vän dig vid driften av en magnetisk pipett innan du utför extraktionen. Ordna de rör som innehåller reagensen som krävs för extraktion i ett rack.Det vill säga från vänster till höger:bindningsbuffert, tvättbuffertar och elueringsbuffert. Överför 1 mL provkoncentrat till röret som innehåller bindningsbufferten med hjälp av en engångspipett av plast. Invertera röret tio gånger för att optimera lösningen.Inkubera lösningen i rumstemperatur i tio minuter medan du kontinuerligt blandar antingen med hjälp av en solo orbital eller manuellt. Samla upp de magnetiska partiklarna med hjälp av en magnetisk pipett och en ren spets som kan återanvändas för de tre tvättbuffertarna och släpp ut de magnetiska partiklarna i röret som innehåller tvättbuffert ett. Tvätta dem genom att försiktigt skaka lösningen med spetsen i trettio sekunder och samla dem.Upprepa denna tvättprocedur för tvättbuffertar två och tre. Samla upp de magnetiska partiklarna i tvättbuffert tre och släpp ut dem i röret som innehåller elueringsbufferten. Kassera sedan spetsen.Inkubera lösningen i rumstemperatur i fem minuter medan du kontinuerligt blandar med hjälp av solo orbital. Byt ut spetsen på magnetpipetten med vilken som helst och samla alla magnetiska partiklar från elueringsbufferten. Kassera spetsen med de insatta partiklarna.Nukleinsyran finns kvar i elueringsbufferten, som bör förvaras för vidare analys eller transport. Använd en fem-rör och en tre-rörs remsa beredd att upptäcka mänskliga adenovirus. Tillsätt vatten, PCR mix, och nukleinsyra extration till rören ett till fem enligt protokollet.Efteråt, tillsätt vatten och PCR blanda till rör sex till åtta. Sätt båda remsorna i termocyklaren och välj lämplig körning. När körningen är klar, samla in resultaten och analysera erhållna data.Endast när virustester har resulterat i negativt, MS2 upptäckt bör utföras. Använd rörremsor som är förberedda för MS2-detektion och välj lämplig termisk profil för PCR. Den VirWaTest magnetiska nukleinsyra extraktion jämfördes med QIAgen viral RNA, härmade det genom att testa vattenprover spetsade med mänskliga adenoviruses och MS2.Reduktionstest p-värde visar signifikant högre virala återvinningar genom att använda VirWaTest än QiAgen som extraktionsmetod för båda virusen som testats. Den utvecklade metoden för viral koncentration testades på fältet med samarbete med Oxfam tvätta team belägna i Bangui, Centralafrikanska republiken och i Pedernales, Ecuador, som samlade vattenprover, koncentrerade dem genom att tillämpa den utvecklade koncentrationsmetoden, och skickade dem till laboratoriet i Barcelona för nukleinsyra extraktion och viral kvantifiering. I Ecuador upptäcktes mänskliga adenovirus i alla testade prover, medan ett av fem prover som samlats in och koncentrerats till Bangui testades positivt för humana adenovirus.Den utvecklade metoden har visat sig vara användbar när den utvärderades av tvätt team av Oxfam Intermon i Bangui, Centralafrikanska republiken och av ett annat team i Pedernales, Ecuador. VirWaTest kan vara en del av ett system för tidig varning eller kan användas i utbrott undersökning av organisationer som deltar i vatten sanitet. Denna utrustning underlättar analysen av viruspatogener i vatten och förbättringen av vattensäkerhetshanteringen med målet att minska incidenter med virussjukdomar i humanitära krissammanhang.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Användning av fluorescerande Immuno-kemi för upptäckt av Edwardsiella ictaluri I kanal havskatt ( I. punctatus) Prover

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Kostnadseffektiv metod för mikrobiell källa Spårning med specifika människors och djurs virus

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Glasullsprodukter Filter för att koncentrera Vattenburna Virus och lantbruksvetenskap zoonotiska patogener

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.

En modifierad EPA Method 1623 som använder tangentiellt flöde Ihåliga fibrer Ultrafiltrering och Heat dissociation åtgärder för att upptäcka Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Och<em&gt; Giardia SPP.</em

Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

Att upprätta en flytande täckt kultur av polariserad Human luftvägsepitelceller Calu-3 celler för att studera svar värdcellen för luftvägspatogener<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Snabb molekylär detektion och differentiering av influensavirus A och B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Pinnurvalsmetoden för påvisande av humana Norovirus på ytor

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetomrörare metod för detektion av<em&gt; Trichinella</em&gt; Larver i muskelprover

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...