Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

De auteurs bedanken de technische staf van de Nordic Bioscience voor laboratorium ondersteuning, evenals de Deense Research Foundation voor algemene ondersteuning van ons onderzoek.

1. weefsel isolatie
<ol><li>Weefsel sourcing<ol>
<li>Voer de gehele weefsel sourcingsectie buiten een laminaire stroom afzuigkap uit in een aseptische omgeving.</li>
		<li>Van de lokale slachterij, verkrijgen van een hele verse rundertibiofemorale kniegewricht van kalveren tussen 1,5 en 2 jaar oud.</li>
		<li>De kuit knie zachtjes ontleden door eerst het overtollige vlees te verwijderen, de condyles, meniscus, pezen en synoviale membraan te bedekken. Snijd de pezen en synoviale membraan, waardoor het gewricht Dismember...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Het protocol dat hier wordt gepresenteerd voor de profilering van de omzet van kraakbeenweefsel in runderkraakbeen explanten kan worden gebruikt voor het karakteriseren van behandelingseffecten van vele soorten geneesmiddelen, waaronder remmers van inflammatoire intracellulaire trajecten, remmers van Proteolytische enzymen, of anabole groeifactoren.
Twee verschillende opstellingen werden beschreven in dit Protocol: een anabole Setup waar explantaten werden gestimuleerd met insuline-achtige gro...

Chondrocyten produceren en onderhouden de kraakbeen matrix. Om de biologie van chondrocyten te bestuderen en hoe zij en de omringende ECM reageren op externe stimuli, is het cruciaal om ze te ondervragen in hun eigen omgeving1,2. Studie van kraakbeenweefsel omzet is belangrijk om het begrip van de onderliggende mechanismen in gewrichtsziekten zoals OA, een ziekte waarvoor momenteel geen ziekte modificerende behandeling te verbeteren. Bijgevolg is er een aanzienlijke behoefte aan betere Vertaal modellen2.
Ex vivo karakteriseren van cel-en weefsel effecten is essentieel voor het aanvullen van andere preklinische modellen, zowel in vitro, zoals chondrocyten monolaag culturen, als in vivo, zoals chirurgie-geïnduceerde OA modellen of het auto-immune collageen-geïnduceerde artritis model (CIA ). Talrijke studies hebben gewezen op de verschillen tussen hoe cellen zich gedragen in 2D monolaag culturen en 3D structuren of in hun eigen weefsel3,4. Veel cellen in 2D-lagen nemen onnatuurlijke morfologieën aan, waaronder verschillen in celpolariteit en weefsel hechting, wat resulteert in zowel visuele als functionele verschillen in cellen binnen native weefsels5. De verschillen zijn ook duidelijk in de functionaliteit van de cellen, die eiwit expressie kan verschuiven, wat leidt tot diep veranderde differentiatie patronen, regelgevende machines en celfunctionaliteit5,6,7 ,8.
De kraakbeen-ECM bestaat hoofdzakelijk uit type II collageen dat een matrix kader biedt, en aggrecan, een Proteoglycaan dat helpt vocht in het weefsel te behouden. Andere matrix moleculen zoals collageen type IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, kraakbeen oligomere eiwitten (COMP), biglycan, decorin en perlecan zijn ook aanwezig9.
Terwijl de etiologie van OA onduidelijk blijft10,11, het begin van de ziekte wordt verondersteld te worden veroorzaakt door onevenwichtigheden in weefsel omzet en reparatie processen12,13. De afbraak van het articulaire kraakbeen is een kenmerk van OA. Chondrocyten of cellen in de omringende weefsels in het kraakbeen verhogen hun vrijlating van cytokinen, waardoor verhoogde productie van proteïnasen wordt gestimuleerd, zoals matrix matrixmetalloproteïnases (mmps) en aggrecanases, die de afbraak van kraakbeen ECM verhogen 14. deze degradatie resulteert in het vrijkomen van kleine unieke eiwit fragmenten genaamd Neo-epitopen, die kunnen worden gekwantificeerd in serum, urine of cultuurmedium15. Bij de vorming en rijping van collageen, zogenaamde profragments worden ook vrijgelaten; Deze kunnen worden gekwantificeerd als een maat voor matrix productie16.
Het doel van dit protocol is om een ex-vivo kraakbeen model op te zetten om het effect van stimulatie en/of medicamenteuze behandeling op de omzet van ECM-weefsel te vergelijken. De omzet van kraakbeen wordt geprofileerd door het meten van matrix-afgeleide Neo-epitope biomarkers direct in het conditioneerde kweekmedium met ELISA: AGNx1 (reflecterend aggrecanase activiteit), C2M-(reflecterende matrix MMP-activiteit) en ProC2 (reflecterend type II collageen formatie). De bevindingen kunnen worden geverifieerd door histologische kleuring van de ECM, die ook de organisatie van chondrocyten in de individuele Explants visualiseert. Het beschreven protocol kan worden gebruikt om het effect van nieuwe behandelingen op de chondrocyten-functie en de omzet van het kraakbeen ECM te testen. Een aantal studies hebben gebruik gemaakt van kraakbeen explantaten om biologische processen of het effect van ingrijpen op cytokine-uitgedaagd explantaten te beschrijven met behulp van kwantitatieve histologische of immunohistochemische benaderingen, mRNA, eiwit expressie of proteomica2 ,17,18. Deze protocollen vallen echter buiten het bereik van het huidige manuscript.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Ex vivo cultuur systemen bestrijken een breed scala aan experimenten gewijd aan het bestuderen van weefsel en cellulaire functie in een inheemse setting. Kraakbeen is een uniek weefsel belangrijk voor de goede werking van het synoviale gewricht en wordt gevormd door een dichte extracellulaire matrix (ECM), rijk aan Proteoglycaan en type II collageen. Chondrocyten zijn het enige celtype aanwezig in kraakbeen en zijn wijdverbreid en relatief laag in aantal. Veranderde externe stimuli en cellulaire signalering kunnen leiden tot veranderingen in de samenstelling en verslechtering van de ECM, wat belangrijke pathologische kenmerken zijn bij ziekten zoals osteoartritis (OA) en reumatoïde artritis.
Ex vivo kraakbeen modellen toestaan 1) profilering van chondrocyten gemedieerde veranderingen van kraakbeenweefsel omzet, 2) visualiseren van de kraakbeen ECM samenstelling, en 3) chondrocyten omlegging rechtstreeks in het weefsel. Profilering van deze veranderingen in reactie op stimuli of behandelingen zijn van groot belang in verschillende aspecten van de biologie van het kraakbeen, en aanvulling in vitro experimenten in geïsoleerde chondrocyten, of complexere modellen in levende dieren waar experimentele omstandigheden moeilijker te beheersen zijn.
Kraakbeen explantaten presenteren een translationele en gemakkelijk toegankelijke methode voor het beoordelen van weefsel remodellering in de kraakbeen-ecm in regelbare instellingen. Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren en kweken van levende runderkraakbeen Explants. De methode maakt gebruik van weefsel van de boviene knie, die gemakkelijk toegankelijk is vanaf de lokale slagerij. Zowel de explantaten als het geconditioneerde kweekmedium kunnen geanalyseerd worden om de weefsel omzet, de ECM-compositie en de chondrocyten-functie te onderzoeken.

Runderen met volledige diepte werden geïsoleerd, gekweekt en gedurende 3 weken behandeld (Figuur 1). Het kweekmedium werd met de toevoeging van de behandeling 3 keer per week veranderd. Eenmaal per week werd de metabolische activiteit gemeten met de resazurin-assay. Biomarkers van de ECM-omzet werden gemeten in het supernatant dat 3 keer per week werd geoogst uit de kweek plaat. Explants werden onderverdeeld in 4 groepen voor behandeling: 1) Oncostatin M en TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 ...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Hier presenteren we een protocol dat isolatie en kweek van kraakbeen explanten van runderknieën beschrijft. Deze methode biedt een eenvoudig en toegankelijk hulpmiddel om weefselveranderingen te beschrijven in reactie op biologische stimuli of nieuwe therapieën gericht op het gewricht.

Een ex vivo weefselkweek model van kraakbeen remodellering in boviene knie Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Kraakbeenimplantaten vormen een translationele gemakkelijk toegankelijke methode voor het ondervragen van weefsel remodelleren in de kraakbeen matrix. De methode kan vroegtijdig inzicht geven in hoe potentiële nieuwe behandelingen de gewrichtsstructuur beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dat kraakbeen in een native 3D-omgeving blijft, waardoor profilering van de interactie tussen cellen en de omringende matrix met behulp van biomarkers mogelijk is.Het principe in de methode is niet uniek voor kraakbeen. Explants kunnen worden geëxtraheerd uit andere weefsels, zoals een ovium, lever, en longen en ondervraagd met behulp van matrix afgeleide biomarkers. Het aantonen van de procedure zal Amalie Engstrom, een grad student van ons laboratorium.Voer het gehele weefsel sourcing proces buiten een laminaire flow hood in een aseptische omgeving. Van een lokaal slachthuis, verkrijgen van een volledig vers runder scheenbeen knie gewricht van kalveren tussen 1,5 en twee jaar oud. Dan, zachte ontleden de kuitknie door eerst het verwijderen van de overtollige vlees, het blootleggen van de condyles, meniscus, pezen, en synoviale membraan.Snijd de pezen en synoviale membraan waardoor het gewricht te verminken. Verwijder de meniscus om de dijbeencondyles bloot te leggen. Gebruik een drie millimeter biopsie puncher om explants te isoleren van het dragende gebied van de femorale condyles en laat ze van het auriculaire oppervlak door te snijden met een scalpel parallel aan en zo dicht mogelijk bij het subchondrale bot mogelijk.Onmiddellijk opslaan en meng de explants in DMEM F12 glutimax cultuurmedium met 1%penicilline en streptomycine in een 50 milliliter buis of petrischaal. Om te beginnen weefsel kweken, breng de explants naar een steriele 96 put plaat in een laminaire stroom kap het plaatsen van alle replica's binnen elke groep diagonaal om de variatie veroorzaakt door verdamping te minimaliseren. Voeg PBS toe aan de buitenste putten van de kweekplaat om verdamping van de supernatant verder te voorkomen.Was vervolgens de explants drie keer in een kweekmedium of PBS. Kweek de explants in 200 microliters van cultuurmedium per goed tot het begin van het experiment voor maximaal 10 weken in een incubator bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Als u behandelingen toepast, bereid deze dan voor op de gewenste concentratie in de explantputten door verdunning in het kweekmedium voordat het medium wordt gewijzigd.Verander het cultuurmedium om de twee tot drie dagen in een laminaire stroomkap. Verwijder voorzichtig de supernatant van elke put en breng het naar een nieuwe 96 put plaat voor opslag. Voeg onmiddellijk 200 microliters van verse cultuurmedium of behandeling aan elke put toe.Laat de explants niet uitdrogen tijdens de middelgrote verandering en zorg ervoor dat alle explants volledig onder water staan in het nieuwe medium. Verzegel de nieuwe plaat met afdichtingstape en bewaar deze op min 20 graden Celsius voor biomarkeranalyse van weefselomzet en eiwitexpressie. Om te beginnen met een resazurin test, maak een oplossing van cultuur medium met 10% resazurin.Oogst de supernatant zoals eerder beschreven en dompel de explants onder in de 10% resazurin oplossing bij 37 graden Celsius gedurende drie uur of totdat de supernatants paars worden. Breng vervolgens de geconditioneerde en achtergrondcontrole resazurin-oplossing over op een zwarte microtiterplaat en meet de fluorescentie bij een excitatie van 540 nanometer en een emissie van 590 nanometer. Daarna dompel je de explants gedurende vijf tot 10 minuten onder in wasmiddel, zodat de resazurine volledig kan verspreiden en nieuwe kweekmedium of behandelingen kan toevoegen als ze worden gebruikt.Doorgaan met het meten van de metabolische activiteit eenmaal per week als een indirecte meting van de levensvatbaarheid van de cel. In deze studie worden boviene explants op volle diepte geïsoleerd, gekweekt en behandeld. Explants zijn verdeeld in vier groepen voor behandeling, met inbegrip van die behandeld met Oncostatin M en tumor necrose factor alpha, die behandeld met Oncostatin M en tumor necrose factor alfa met GM 6001, die behandeld met insuline groeifactor een, en een controle zonder behandeling.De metabolische activiteit is relatief stabiel gedurende de drie weken voor alle vier de groepen. Er was een tendens voor IGF-1 te verhogen en O plus T groepen te verminderen in vergelijking met controle. O plus T wordt vervolgens toegepast op cultuur putten drie keer per week te onderzoeken O plus T bemiddelde kraakbeen afbraak.O plus T wordt gezien om type twee collageen degradatie te verhogen van dag zeven tot 21 en aggrecan afbraak van dag drie tot 14 in vergelijking met de controlegroep. Het toevoegen van GM 6001 in combinatie met O plus T blokkeert de release van de O plus T gemedieerde C2M, maar heeft slechts beperkte invloed op AGN X1 met niveaus vergelijkbaar met O plus T groep op dag 10. Insuline zoals groeifactor men wordt drie keer per week toegepast op runder volledige diepte-explants om te onderzoeken hoe anabole stimulatie modules het kraakbeen ECM omzet.Het effect van IGF-1 op de kraakbeen explants werd voornamelijk waargenomen op metingen van type twee collageen vorming zoals verwacht voor anabole stimuli. Bij de behandeling met IGF-1 dalen de pro-C2-niveaus minder dan die welke in de controlegroep worden waargenomen, wat aangeeft dat IGF-1 type twee collageenvorming vanaf dag zeven stimuleert. Explants kunnen na verloop van tijd verslechteren en dus is voorzichtig pipetten van cruciaal belang in alle behandelings- en wasstappen om explants in de verschillende media-uitwisselingsstappen niet te verliezen of te vernietigen.Resultaten gegenereerd met behulp van dit model moet niet op zichzelf staan, maar worden ondersteund door gegevens gegenereerd in menselijk weefsel, alsmede cellulaire en in nieuwere modellen om verder te valideren bevindingen. Om licht te werpen op het onderliggende mechanisme in het weefsel en niet alleen de resultaten, is het mogelijk om zowel weefsel als supernatants verder te analyseren met behulp van andere moleculaire biologietechnieken, zoals gen- en eiwitexpressieanalyse, immunohistochemie, of andere permanente moleculaire biologietechnieken.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Methode voor Cultuur van Early kippenembryo&#39;s ex vivo (Nieuwe Cultuur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultuur van primaire menselijke eileider epitheelcellen

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo cultuur van muis embryonale Huid en live-beeldvorming van melanoblast Migratie

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

De c-FOS Protein Immunohistologische Detection: Een handig hulpmiddel als een marker van Central Pathways betrokken bij specifieke fysiologische reacties<em&gt; In Vivo</em&gt; en<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Een weefselkweek Model van primaire boviene Granulosa oestrogeen-producerende cellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Bovine Ovarian Cortex Weefselkweek

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...