Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
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Les auteurs remercient le personnel technique de Nordic Bioscience pour son soutien en laboratoire, ainsi que la Fondation danoise de la recherche pour son soutien général à notre recherche.

1. Isolement tissulaire
<ol><li>Approvisionnement en tissus<ol>
<li>Effectuez toute la section d'approvisionnement en tissu à l'extérieur d'une hotte à flux laminaire dans un environnement aseptique.</li>
		<li>De l'abattoir local, obtenir une articulation du genou tibiofemoral bovin frais entier des veaux entre 1,5 et 2 ans.</li>
		<li>Disséquez doucement le genou du mollet en enlevant d'abord l'excès de chair, en découvrant les condyles, ménisques, tendons et membrane synoviale. Couper les tendons et la membra...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Le protocole présenté ici pour le profilage du renouvellement des tissus cartilagineux dans les explants de cartilage bovin peut être utilisé pour caractériser les effets de traitement de nombreux types de médicaments, y compris les inhibiteurs des voies intracellulaires inflammatoires, inhibiteurs de protéolytiques, ou facteurs de croissance anabolisants.
Deux configurations différentes ont été décrites dans ce protocole : une configuration anabolisante où des explants ont été s...

Les chondrocytes produisent et maintiennent la matrice de cartilage. Afin d'étudier la biologie des chondrocytes et comment eux et l'ECM environnant réagissent aux stimuli externes, il est crucial de les interroger dans leur environnement natif1,2. L'étude du renouvellement des tissus cartilagineux est importante pour améliorer la compréhension des mécanismes sous-jacents dans les maladies articulaires telles que l'arthrose, une maladie pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement modifiant la maladie. Par conséquent, il y a un besoin important de meilleurs modèles de traduction2.
La caractérisation ex vivo des effets cellulaires et tissulaires est essentielle pour compléter d'autres modèles précliniques, à la fois in vitro, tels que les cultures monocouches de chondrocytes, et in vivo, tels que les modèles d'arthrose induits par la chirurgie ou le modèle d'arthrite auto-immune induit par le collagène (CIA ). De nombreuses études ont mis en évidence les différences entre le se comporter dans les cultures monocouches 2D et les structures 3D ou dans leur tissu indigène3,4. Beaucoup de cellules dans les couches 2D adoptent des morphologies non naturelles, y compris des différences dans la polarité cellulaire et l'attachement de tissu, ayant pour résultat des différences visuelles et fonctionnelles dans les cellules dans les tissus indigènes5. Les différences sont également apparentes dans la fonctionnalité des cellules, qui peuvent changer l'expression des protéines, conduisant à des modèles de différenciation profondément modifiés, les machines de régulation, et la fonctionnalité cellulaire5,6,7 ,8.
Le cartilage ECM se compose principalement de collagène de type II fournissant un cadre de matrice, et l'aggrecan, un protéoglycane qui aide à retenir le liquide dans le tissu. D'autres molécules de matrice telles que le collagène de type IV, VI, IX, X, XI, XII, la fibronectin, la protéine oligomeric de cartilage (COMP), le biglycan, la décoration, et la perlecan sont également présentes9.
Tandis que l'étiologie de l'arthrose reste peu claire10,11, le début de la maladie est censé être causé par des déséquilibres dans le renouvellement des tissus et les processus de réparation12,13. La dégradation du cartilage articulaire est une caractéristique de l'arthrose. Les chondrocytes ou les cellules du cartilage-résident dans les tissus environnants augmentent leur libération de cytokines, stimulant la production élevée de protéinases telles que les métalloprotéinases de matrice (MMP) et les aggrecanases, qui augmentent la dégradation de l'ECM de cartilage 14. Cette dégradation entraîne la libération de petits fragments de protéines uniques appelés néo-épitopes, qui peuvent être quantifiés dans le sérum, l'urine ou le milieu de culture15. Lors de la formation et de la maturation du collagène, des soi-disant profragments sont également libérés ; ceux-ci peuvent être quantifiés comme mesure de la production de matrice16.
Le but de ce protocole est d'établir un modèle de cartilage ex vivo pour comparer l'effet de la stimulation et/ou du traitement médicamenteux sur le renouvellement des tissus ECM. Le renouvellement du cartilage est profilé en mesurant les biomarqueurs néoépitope dérivés de la matrice directement dans le milieu de culture conditionné à l'aide d'ELISA : AGNx1 (reflétant l'activité de l'aggrecanase), C2M (reflétant l'activité MMP de matrice) et ProC2 (reflétant le collagène de type II formation). Les résultats peuvent être vérifiés par la coloration histologique de l'ECM, qui visualise également l'organisation des chondrocytes dans les explants individuels. Le protocole décrit peut être employé pour tester l'effet des traitements nouveaux sur la fonction de chondrocyte et le chiffre d'affaires d'ECM de cartilage. Un certain nombre d'études ont utilisé des explants de cartilage pour décrire les processus biologiques ou l'effet de l'intervention sur les explants cytokine-contestés utilisant des approches histologiques ou immunohistochimiques quantitatives, arnAS, expression de protéine, ou protéomique2 ,17,18. Cependant, ces protocoles ne sont pas du champ d'application du manuscrit actuel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Les systèmes de culture ex vivo couvrent un large éventail d'expériences consacrées à l'étude des tissus et de la fonction cellulaire dans un milieu autochtone. Le cartilage est un tissu unique important pour le bon fonctionnement de l'articulation synoviale et est constitué par une matrice extracellulaire dense (ECM), riche en protéoglycane et collagène de type II. Les chondrocytes sont le seul type de cellules présents dans le cartilage et sont répandus et relativement peu nombreux. Des stimuli externes altérés et la signalisation cellulaire peuvent entraîner des changements dans la composition et la détérioration de l'ECM, qui sont d'importantes caractéristiques pathologiques dans des maladies telles que l'arthrose (Arthrose) et la polyarthrite rhumatoïde.
Les modèles de cartilage ex vivo permettent 1) profilage des altérations médiées de chondrocyte du chiffre d'affaires de tissu de cartilage, 2) visualisant la composition d'ECM de cartilage, et 3) le réarrangement de chondrocyte directement dans le tissu. Le profilage de ces altérations en réponse à des stimuli ou des traitements sont d'une grande importance dans divers aspects de la biologie du cartilage, et complètent des expériences in vitro chez des chondrocytes isolés, ou des modèles plus complexes chez des animaux vivants où les conditions expérimentales sont plus difficiles à contrôler.
Les explants de cartilage présentent une méthode translationnelle et facilement accessible pour évaluer le tissu remodelant dans l'ECM de cartilage dans des arrangements contrôlables. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les explants vivants de cartilage bovin. La méthode utilise des tissus du genou bovin, qui est facilement accessible à partir de la boucherie locale. Les explantes et le milieu de culture conditionné peuvent être analysés pour étudier le renouvellement des tissus, la composition de l'ECM et la fonction de chondrocyte, profilant ainsi la modulation de l'ECM.

Les explants bovins en profondeur ont été isolés, cultivés et traités pendant 3 semaines(figure 1). Le milieu de culture a été changé avec l'ajout du traitement 3 fois par semaine. Une fois par semaine, l'activité métabolique a été mesurée par l'analyse de resazurin. Les biomarqueurs du chiffre d'affaires de l'ECM ont été mesurés dans le supernatant récolté à partir de la plaque de culture 3 fois par semaine. Les explantations ont été divisées en 4 groupes pour le trait...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Ici, nous présentons un protocole décrivant l'isolement et la culture des explants de cartilage des genoux bovins. Cette méthode fournit un outil facile et accessible pour décrire les changements tissulaires en réponse à des stimuli biologiques ou de nouvelles thérapies ciblant l'articulation.

Un modèle de culture de tissu d'Ex Vivo du cartilage transformant dans les explants de genou de bovine

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Les implants cartilagineux représentent une méthode translationnelle facilement accessible pour interroger le remodelage des tissus dans la matrice du cartilage. La méthode peut fournir un aperçu précoce de la façon dont les nouveaux traitements potentiels affectent la structure articulaires. Le principal avantage de cette technique est que ce cartilage reste dans un environnement 3D natif, qui permettent le profilage de l’interaction entre les cellules et la matrice environnante à l’aide de biomarqueurs.Le principe de la méthode n’est pas propre au cartilage. Les explantations peuvent être extraites d’autres tissus tels qu’un ovium, un foie et un poumon et interrogées à l’aide de biomarqueurs dérivés de la matrice. Amalie Engstrom, étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure.Effectuez l’ensemble du processus d’approvisionnement en tissus à l’extérieur d’une hotte d’écoulement laminaire dans un environnement aseptique. À partir d’un abattoir local, obtenir une articulation du genou fémoral tibial tibial bovine entière auprès de veaux âgés de 1,5 à 2 ans. Puis, disséquez doucement le genou du mollet en enlevant d’abord l’excès de chair, en découvrant les condyles, le ménisque, les tendons et la membrane synoviale.Couper les tendons et la membrane synoviale permettant à l’articulation de démembrer. Retirer le ménisque pour exposer les condyles fémoraux. Utilisez un poinçonneur de biopsie de trois millimètres pour isoler les explants de la zone de charge des condyles fémoraux et les libérer de la surface auriculaire en coupant avec un scalpel parallèle et aussi près que possible de l’os subchondral.Conservez et mélangez immédiatement les explants dans le milieu de culture du glutimax DMEM F12 contenant 1 % de pénicilline et de streptomycine dans un tube de 50 millilitres ou une boîte de Pétri. Pour commencer la culture tissulaire, transférez les explants à une plaque stérile de puits 96 dans une hotte d’écoulement laminaire plaçant toutes les répliques dans chaque groupe en diagonale pour minimiser la variation induite par l’évaporation. Ajouter pbs aux puits extérieurs de la plaque de culture pour éviter davantage l’évaporation du surnatant.Ensuite, lavez les explantations trois fois dans le milieu de culture ou PBS. Culture des explantations dans 200 microlitres de milieu de culture par puits jusqu’au début de l’expérience jusqu’à 10 semaines dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Si vous appliquez des traitements, préparez-les à la concentration souhaitée dans les puits d’explantation par dilution dans le milieu de culture avant de changer le milieu.Changez le milieu de culture tous les deux à trois jours dans une hotte d’écoulement laminaire. Retirez délicatement le supernatant de chaque puits et transférez-le dans une nouvelle plaque de puits 96 pour le rangement. Ajoutez immédiatement 200 microlitres de culture fraîche moyenne ou de traitement à chaque puits.Ne laissez pas sécher les explants pendant le changement moyen et assurez-vous que toutes les explants sont complètement immergées dans le nouveau milieu. Sceller la nouvelle plaque avec du ruban adhésif et la conserver à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse des biomarqueurs du renouvellement des tissus et de l’expression des protéines. Pour commencer un test de résazurine, faire une solution de milieu de culture contenant 10% de resazurine.Récoltez le supernatant tel que décrit précédemment et plongez les explants dans la solution de 10% de resazurine à 37 degrés Celsius pendant trois heures ou jusqu’à ce que les supernatants deviennent violets. Ensuite, transférez la solution de resazurine conditionnée et de contrôle de fond à une plaque de microtiter noire et mesurez la fluorescence à une excitation de 540 nanomètres et une émission de 590 nanomètres. Après cela, submerger les explants dans le milieu de lavage pendant cinq à 10 minutes pour permettre à la résazurine de se diffuser complètement et d’ajouter un nouveau milieu de culture ou des traitements s’ils sont utilisés.Continuer à mesurer l’activité métabolique une fois par semaine comme mesure indirecte de la viabilité cellulaire. Dans cette étude, les explants bovins à pleine profondeur sont isolés, cultivés et traités. Les explants sont divisés en quatre groupes pour le traitement, y compris ceux traités avec l’Oncostatin M et le facteur alpha de nécrose de tumeur, ceux traités avec l’Oncostatin M et le facteur alpha de nécrose de tumeur avec GM 6001, ceux traités avec le facteur un de croissance d’insuline, et un contrôle sans traitement.L’activité métabolique est relativement stable tout au long des trois semaines pour les quatre groupes. Il y avait une tendance pour iGF-1 à augmenter et O plus T groupes à diminuer par rapport au contrôle. O plus T est ensuite appliqué aux puits de culture trois fois par semaine pour étudier o plus T dégradation du cartilage médiatisé.O plus T est vu pour augmenter la dégradation de collagène de type deux du septième au 21ème jour et la dégradation aggrecane des jours trois à 14 comparés au groupe témoin. L’ajout de GM 6001 en combinaison avec O plus T bloque la sortie de l’O plus T 2M médiatisé, mais n’a qu’un impact limité sur AGN X1 avec des niveaux similaires au groupe O plus T au jour 10. L’insuline comme facteur de croissance un est appliquée trois fois par semaine aux explants bovins pleine profondeur pour étudier comment les modules anabolisants de stimulation le chiffre d’affaires d’ECM de cartilage.L’effet de l’IGF-1 sur les explants de cartilage a été principalement observé sur des mesures de la formation de collagène de type deux comme prévu pour des stimulus anabolisants. En traitant avec IGF-1, les niveaux pro-C2 diminuent moins que ceux observés dans le groupe témoin, indiquant que l’IGF-1 stimule la formation de collagène de type deux dès le septième jour. Les explantations peuvent se détériorer au fil du temps et il est donc essentiel de faire attention au pipetage dans toutes les étapes de traitement et de lavage afin de ne pas perdre ou détruire les explants dans les différentes étapes d’échange de médias.Les résultats générés à l’aide de ce modèle ne devraient pas être autonomes, mais être étayés par des données générées dans les tissus humains ainsi que cellulaires et dans de nouveaux modèles pour valider davantage les résultats. Pour faire la lumière sur le mécanisme sous-jacent dans le tissu et pas seulement les résultats, il est possible d’analyser davantage les tissus et les supernatants en utilisant d’autres techniques de biologie moléculaire, telles que l’analyse de l’expression des gènes et des protéines, ou l’immunohistochimie, ou d’autres techniques permanentes de biologie moléculaire.

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