Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
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Die Autoren danken dem technischen Personal von Nordic Bioscience für die Unterstützung des Labors sowie der Dänischen Forschungsstiftung für die allgemeine Unterstützung unserer Forschung.

1. Gewebeisolierung
<ol><li>Gewebebeschaffung<ol>
<li>Führen Sie den gesamten Gewebebeschaffungsbereich außerhalb einer laminaren Strömungshaube in einer aseptischen Umgebung durch.</li>
		<li>Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie ein ganzes frisches rindertibiofemorales Kniegelenk von Kälbern zwischen 1,5 und 2 Jahren.</li>
		<li>Sezieren Sie das Wadenknie vorsichtig, indem Sie zuerst das überschüssige Fleisch entfernen und die Kondylen, den Meniskus, die Sehnen und die Synovialmembran aufdecken. Schneiden Sie...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Das hier vorgestellte Protokoll zur Profilierung des Knorpelgewebeumsatzes in Rinderknorpelexplanten kann zur Charakterisierung von Behandlungseffekten vieler Arten von Arzneimitteln verwendet werden, einschließlich Inhibitoren entzündlicher intrazellulärer Bahnen, proteolytische Enzyme oder anabole Wachstumsfaktoren.
In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Setups beschrieben: ein anaboles Setup, bei dem Exmodule mit Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) stimuliert wurden, und e...

Chondrozyten produzieren und pflegen die Knorpelmatrix. Um die Biologie von Chondrozyten zu studieren und wie sie und das umgebende ECM auf äußere Reize reagieren, ist es entscheidend, sie in ihrer heimischen Umgebung zu befragen1,2. Die Untersuchung des Knorpelgewebeumsatzes ist wichtig, um das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen bei Gelenkerkrankungen wie OA zu erweitern, einer Krankheit, für die es derzeit keine krankheitsmodifizierende Behandlung gibt. Folglich besteht ein erheblicher Bedarf an besseren Übersetzungsmodellen2.
Die Ex-vivo-Charakterisierung von Zell- und Gewebeeffekten ist wesentlich, um andere präklinische Modelle zu ergänzen, sowohl in vitro, wie Chondrozyten-Monolayer-Kulturen, als auch in vivo, wie z. B. chirurgisch induzierte OA-Modelle oder das autoimmune Kollagen-induzierte Arthritis-Modell (CIA ). Zahlreiche Studien haben die Unterschiede zwischen dem Verhalten von Zellen in 2D-Monolayer-Kulturen und 3D-Strukturen oder in ihrem nativen Gewebe3,4hervorgehoben. Viele Zellen in 2D-Schichten übernehmen unnatürliche Morphologien, einschließlich Unterschiede in der Zellpolarität und Gewebebindung, was zu visuellen und funktionellen Unterschieden in Zellen innerhalb nativer Gewebeführt 5. Die Unterschiede zeigen sich auch in der Funktionalität der Zellen, die die Proteinexpression verschieben können, was zu tiefgreifend veränderten Differenzierungsmustern, regulatorischen Maschinen und Zellfunktionalität5,6,7 führt. ,8.
Der Knorpel ECM besteht hauptsächlich aus Typ-II-Kollagen, das ein Matrix-Framework bietet, und Aggrecan, einem Proteoglykan, der hilft, Flüssigkeit im Gewebe zu halten. Andere Matrixmoleküle wie Kollagen Typ IV, VI, IX, X, XI, XII, Fibronectin, Knorpel-Oligomerprotein (COMP), Biglycan, Decorin und Perlecan sind ebenfalls vorhanden9.
Während die Ätiologie von OA bleibt unklar10,11, der Beginn der Krankheit wird geglaubt, um durch Ungleichgewichte im Gewebeumsatz und Reparaturprozesse verursacht werden12,13. Der Abbau des Gelenkknorpels ist ein Markenzeichen von OA. Knorpelresidente Chondrozyten oder Zellen in den umgebenden Geweben erhöhen ihre Freisetzung von Zytokinen und stimulieren die erhöhte Produktion von Proteinasen wie Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und Aggrecanasen, die den Abbau von Knorpel ECM erhöhen 14. Dieser Abbau führt zur Freisetzung kleiner einzigartiger Proteinfragmente, sogenannteneo-Epitope, die in Serum, Urin oder Kulturmedium15quantifiziert werden können. Bei der Bildung und Reifung von Kollagen werden auch sogenannte Profragmente freigesetzt; diese können als Maß für die Matrixproduktion quantifiziert werden16.
Ziel dieses Protokolls ist es, ein ex vivo Knorpelmodell zu erstellen, um die Auswirkungen der Stimulation und/oder medikamentösen Behandlung auf den ECM-Gewebeumsatz zu vergleichen. Der Knorpelumsatz wird durch Messung von Matrix-abgeleiteten Neo-Epitop-Biomarkern direkt im konditionierten Kulturmedium mit ELISA profiliert: AGNx1 (reflektierende Aggrecanase-Aktivität), C2M (reflektierende Matrix-MMP-Aktivität) und ProC2 (reflektierendes Typ-II-Kollagen Bildung). Die Befunde können durch histologische Färbung des ECM überprüft werden, die auch die Organisation von Chondrozyten in den einzelnen Explants visualisiert. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung neuartiger Behandlungen auf chondrozytenfunktion und Knorpel-ECM-Umsatz zu testen. In einer Reihe von Studien wurden Knorpelexate verwendet, um biologische Prozesse oder die Wirkung von Interventionen auf zytokinbefragte Explanten mit quantitativen histologischen oder immunhistochemischen Ansätzen, mRNA, Proteinexpression oder Proteomik zu beschreiben2 ,17,18. Diese Protokolle fallen jedoch nicht in den Anwendungsbereich des aktuellen Manuskripts.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Ex-vivo-Kultursysteme decken eine breite Palette von Experimenten ab, die sich der Untersuchung von Gewebe und zellulärer Funktion in einer nativen Umgebung widmen. Knorpel ist ein einzigartiges Gewebe, das für die ordnungsgemäße Funktion des Synovials wichtig ist und aus einer dichten extrazellulären Matrix (ECM) besteht, die reich an Proteoglykan und Typ-II-Kollagen ist. Chondrozyten sind der einzige Zelltyp, der im Knorpel vorliegt und weit verbreitet und relativ gering ist. Veränderte äußere Reize und zelluläre Signalgebung können zu Veränderungen in der Zusammensetzung und Verschlechterung des ECM führen, die wichtige pathologische Kennzeichen bei Krankheiten wie Arthrose (OA) und rheumatoider Arthritis sind.
Ex-vivo-Knorpelmodelle ermöglichen 1) Profilierung von Chondrozyten vermittelten Veränderungen des Knorpelgewebeumsatzes, 2) Visualisierung der Knorpel-ECM-Zusammensetzung und 3) Chondrozyten-Umlagerung direkt im Gewebe. Die Profilierung dieser Veränderungen als Reaktion auf Reize oder Behandlungen ist in verschiedenen Aspekten der Knorpelbiologie von großer Bedeutung und ergänzt In-vitro-Experimente an isolierten Chondrozyten oder komplexere Modelle bei lebenden Tieren, bei denen experimentelle Bedingungen sind schwieriger zu kontrollieren.
Knorpelexplantationen stellen eine translationale und leicht zugängliche Methode zur Beurteilung der Gewebeumgestaltung im Knorpel-ECM in kontrollierbaren Einstellungen dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung lebender Rinderknorpelexplantationen. Die Methode verwendet Gewebe aus dem Rinderknie, das von der örtlichen Metzgerei leicht zugänglich ist. Sowohl Explanten als auch konditioniertes Kulturmedium können analysiert werden, um den Gewebeumsatz, die ECM-Zusammensetzung und die Chondrozytenfunktion zu untersuchen und so die ECM-Modulation zu profilieren.

Rinder-Explanten mit voller Tiefe wurden isoliert, kultiviert und 3 Wochen lang behandelt (Abbildung 1). Das Kulturmedium wurde mit der Zugabe der Behandlung 3 mal pro Woche verändert. Einmal wöchentlich wurde die metabolische Aktivität durch den Resazurin-Assay gemessen. Biomarker des ECM-Umsatzes wurden in dem Überstand gemessen, der dreimal pro Woche von der Kulturplatte geerntet wurde. Die Explanten wurden zur Behandlung in 4 Gruppen eingeteilt: 1) Oncostatin M und TNF (O+T); 2) O+T ...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Isolierung und Kultivierung von Knorpelexpflanzen von Rinderknien beschreibt. Diese Methode bietet ein einfaches und zugängliches Werkzeug, um Gewebeveränderungen als Reaktion auf biologische Reize oder neuartige Therapeutika, die auf das Gelenk abzielen, zu beschreiben.

Ein Ex-Vivo-Gewebekulturmodell des Knorpel-Remodels in Rinderknie-Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Knorpelimplantate stellen eine translationale, leicht zugängliche Methode zur Rückfragen zur Gewebeumgestaltung in der Knorpelmatrix dar. Die Methode kann einen frühen Einblick in die Auswirkungen potenzieller neuer Behandlungen auf die Gelenkstruktur geben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass dieser Knorpel in einer nativen 3D-Umgebung verbleibt, die eine Profilerstellung der Interaktion zwischen Zellen und der umgebenden Matrix mit Biomarkern ermöglicht.Das Prinzip in der Methode ist nicht nur Knorpel. Explanten können aus anderen Geweben wie einem Ovium, Leber und Lunge extrahiert und mit Matrix-abgeleiteten Biomarkern abgefragt werden. Demonstriert wird das Verfahren von Amalie Engstrom, einer Grad-Studentin aus unserem Labor.Führen Sie den gesamten Gewebebeschaffungsprozess außerhalb einer laminaren Strömungshaube in einer aseptischen Umgebung durch. Von einem lokalen Schlachthof erhalten Sie ein ganzes frisches rindertibiales Oberschenkelkniegelenk von Kälbern zwischen 1,5 und zwei Jahren. Dann sezieren Sie das Wadenknie sanft, indem Sie zuerst das überschüssige Fleisch entfernen und die Kondylen, den Meniskus, die Sehnen und die Synovialmembran aufdecken.Schneiden Sie die Sehnen und die Synovialmembran, so dass sich das Gelenk zerlegen kann. Entfernen Sie den Meniskus, um die Femoralkondylen zu entblößen. Verwenden Sie einen Drei-Millimeter-Biopsie-Stanzer, um Expflanzen aus dem tragenden Bereich der Femoralkondylen zu isolieren und sie von der auricularen Oberfläche freizusetzen, indem Sie mit einem Skalpell parallel zum subchondralen Knochen schneiden.Die Expflanzen in DMEM F12 glutimax Kulturmedium, das 1%Penicillin und Streptomycin enthält, sofort in einer 50-Milliliter-Röhre oder Petrischale aufbewahren und mischen. Um mit der Gewebekultivierung zu beginnen, übertragen Sie die Expflanzen auf eine sterile 96-Wellplatte in einer laminaren Strömungshaube, die alle Replikationen innerhalb jeder Gruppe diagonal platziert, um die durch Verdunstung induzierte Variation zu minimieren. Fügen Sie PBS zu den äußeren Brunnen der Kulturplatte hinzu, um eine weitere Verdunstung des Überstandes zu vermeiden.Dann waschen Sie die Explants dreimal entweder in Kulturmedium oder PBS. Kultur die Explants in 200 Mikroliter Kultur Medium pro Brunnen bis zum Beginn des Experiments für bis zu 10 Wochen in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Wenn Sie irgendwelche Behandlungen anwenden, bereiten Sie diese auf die gewünschte Konzentration in den Explantbrunnen durch Verdünnung im Kulturmedium vor dem Wechsel des Mediums vor.Ändern Sie das Kulturmedium alle zwei bis drei Tage in einer laminaren Strömungshaube. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig von jedem Brunnen und übertragen Sie ihn zur Lagerung auf eine neue 96-Wellplatte. Sofort 200 Mikroliter frisches Kulturmedium oder Behandlung zu jedem Brunnen hinzufügen.Lassen Sie die Explants während des mittleren Wechsels nicht austrocknen und stellen Sie sicher, dass alle Expflanzen vollständig in das neue Medium getaucht sind. Versiegeln Sie die neue Platte mit Dichtband und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für die Biomarkeranalyse des Gewebeumsatzes und der Proteinexpression. Um einen Resazurin-Test zu beginnen, machen Sie eine Lösung von Kulturmedium mit 10%resazurin.Ernten Sie den Überstand wie zuvor beschrieben und tauchen Sie die Expflanzen in die 10%resazurin Lösung bei 37 Grad Celsius für drei Stunden oder bis die Überräube lila werden. Übertragen Sie dann die konditionierte und Hintergrundsteuerung Resazurin-Lösung auf eine schwarze Mikrotiterplatte und messen Sie die Fluoreszenz bei einer Anregung von 540 Nanometern und einer Emission von 590 Nanometern. Danach tauchen Sie die Ex-Pflanzen für fünf bis zehn Minuten in Waschmedium, damit das Resazurin vollständig ausdiffus ist und bei Verwendung ein neues Kulturmedium oder Behandlungen hinzufügt.Messen Sie die Stoffwechselaktivität einmal wöchentlich als indirekte Messung der Zelllebensfähigkeit. In dieser Studie werden Rinder-Expflanzen mit voller Tiefe isoliert, kultiviert und behandelt. Explanten werden in vier Gruppen für die Behandlung unterteilt, einschließlich der mit Oncostatin M und Tumornekrosefaktor alpha behandelten, der mit Oncostatin M und dem Tumornekrosefaktor alpha mit GM 6001 behandelten, der mit Insulinwachstumsfaktor eins behandelten Und einer Kontrolle ohne Behandlung.Die Stoffwechselaktivität ist während der drei Wochen für alle vier Gruppen relativ stabil. Es gab eine Tendenz für IGF-1 zu erhöhen und O plus T-Gruppen im Vergleich zur Kontrolle zu verringern. O plus T wird dann dreimal pro Woche auf Kulturbrunnen angewendet, um o plus T vermittelte Knorpeldegradation zu untersuchen.O plus T wird gesehen, um Typ zwei Kollagen Abbau von Tag sieben bis 21 und Aggrecan Abbau von Dentagen drei bis 14 im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erhöhen. Das Hinzufügen von GM 6001 in Kombination mit O plus T blockiert die Veröffentlichung des O plus T vermittelten C2M, hat aber nur begrenzte Auswirkungen auf AGN X1 mit ähnlichen Werten wie O plus T Gruppe an Tag 10. Insulin wie Wachstumsfaktor eins wird dreimal wöchentlich auf Rinder volltief Explanten angewendet, um zu untersuchen, wie anabole Stimulation Module den Knorpel ECM Umsatz.Die Wirkung von IGF-1 auf die Knorpelexplantationen wurde hauptsächlich bei Messungen der Kollagenbildung typ2 beobachtet, wie für anabole Reize erwartet. Bei der Behandlung mit IGF-1, die Pro-C2-Spiegel verringern sich weniger als die in der Kontrollgruppe beobachtet, was darauf hindeutet, dass IGF-1 stimuliert Typ zwei Kollagenbildung von Tag sieben. Explants können sich im Laufe der Zeit verschlechtern und daher ist eine sorgfältige Pipettierung bei allen Behandlungs- und Waschschritten von entscheidender Bedeutung, um Expflanzen in den verschiedenen Medienaustauschschritten nicht zu verlieren oder zu zerstören.Die mit diesem Modell generierten Ergebnisse sollten nicht allein stehen, sondern durch Daten unterstützt werden, die sowohl im menschlichen Gewebe als auch in zellulären und in neueren Modellen generiert werden, um die Ergebnisse weiter zu validieren. Um den zugrunde liegenden Mechanismus im Gewebe und nicht nur die Ergebnisse zu beleuchten, ist es möglich, sowohl Gewebe als auch Überstände mit anderen molekularbiologischen Techniken wie Gen- und Proteinexpressionsanalyse oder Immunhistochemie oder anderen permanenten molekularbiologischen Techniken weiter zu analysieren.

Research

JoVE Journal

Biology

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