Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

המחברים מודים לצוות הטכני ב-נורדי Bioscience לתמיכה במעבדות, וכן בקרן המחקר הדנית לתמיכה כללית במחקר שלנו.

1. בידוד רקמות
<ol><li>לחיזוי רקמות<ol>
<li>לבצע את כל הרקמות לחיזוי המקטע מחוץ מכסה הזרימה למינארי בסביבה אספטי.</li>
		<li>מתוך המטבחיים המקומי, לקבל מפרק הברך החדש של השור מוסרי המפרק מעגלים בין 1.5 ו 2 שנים של גיל.</li>
		<li>בעדינות לנתח את הברך העגל על ידי הסרת הבשר העודף, חשיפת הקונדיקלס, מניסקוס, הגידי?...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג כאן עבור הפרופיל של מחזור רקמות הסחוס בתוך הסחוס בתאי הפרה יכול לשמש לאפיון השפעות הטיפול של סוגים רבים של תרופות, כולל מעכבי של מסלולים תאיים, מעכבי של אנזימים פרוטנוגד חרדה, או גורמי גדילה אנבוליים.
שני הכיוונונים שונים תוארו בפרוטוקול זה: התקנה אנבוליים ש...

כונדרוציטים לייצר ולתחזק את מטריצת הסחוס. כדי ללמוד את הביולוגיה של כונדרוציטים וכיצד הם ו-ecm המקיפים מגיבים לגירויים חיצוניים, חשוב לחקור אותם בסביבתם הטבעית1,2. לימוד מחזור רקמות הסחוס חשוב להגדיל את ההבנה של המנגנונים הבסיסיים במחלות משותפות כגון OA, מחלה שאין כרגע מחלה שינוי הטיפול. כתוצאה מכך, יש צורך משמעותי במודלים תרגום2.
האפיון vivo Ex של השפעות התאים והרקמה הוא חיוני כדי להשלים מודלים קדם קליניים אחרים, הן בתוך מבחנה, כגון תרבויות מונאולייר כונדרוגיה, ובvivo, כגון מודלים OA המושרה או מודל דלקת מפרקים אוטואימונית המושרה (CIA ). מחקרים רבים הדגישו את ההבדלים בין כיצד תאים להתנהג בתרבויות 2d מונאולייר ומבנים תלת-ממדיים או ברקמה הטבעית שלהם3,4. תאים רבים בשכבות דו-ממדיות לאמץ מורפולוגיות לא טבעיות, כולל הבדלים של קוטביות התא והחזקה רקמות, וכתוצאה מכך הן הבדלים חזותיים ופונקציונליים בתאים בתוך רקמות יליד5. ההבדלים גם ברור בפונקציונליות של התאים, אשר עשוי לנוע ביטוי חלבון, המוביל דפוסי בידול עמוק שונה, מכונות רגולציה, ופונקציונליות תא5,6,7 ,8.
ECM הסחוס מורכב בעיקר מסוג II קולגן מתן מסגרת מטריצה, וצובר, פרוטנוגליקן המסייע לשמור על הנוזלים בתוך הרקמה. מולקולות אחרות של מטריקס כגון קולגן סוג IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, הסחוס oligomeric חלבון (COMP), biglycan, קישוט, ו perlecan הם גם הנוכחי9.
בעוד זה של OA נשאר ברור10,11, התחלתה של המחלה הוא האמין להיגרם על ידי חוסר איזון במחזור רקמות ותהליכי תיקון12,13. השפלה של הסחוס הפרקולארית הוא סימן ההיכר של OA. הסחוס-תושב כונדרוציטים או תאים ברקמות הסובבות להגדיל את שחרורם של ציטוקינים, עירור הייצור הגבוה של פרוטטינוסים כגון מטריקס מטאלוסים (MMPs) ו-מוספים, אשר להגדיל את השפלה של ECM הסחוס 14. השפלה זו גורמת לשחרורו של שברי חלבון ייחודיים קטנים המכונים ניאו-אפיסקופים, שניתן לכמת בסרום, בשתן או בתרבות בינונית-15. עם היווצרות והתבגרות של קולגן, שברים שנקרא גם profragments הם שוחרר; אלה ניתן לכמת כמדד של ייצור מטריקס16.
מטרת פרוטוקול זה היא להקים מודל הסחוס vivo ex כדי להשוות את ההשפעה של גירוי ו/או טיפול בסמים על מחזור רקמות ECM. מחזור סחוס הוא הפרופיל על ידי מדידת מטריקס-נגזר בסמנים ניאו-אפירופה באופן ישיר במדיום התרבות הממוזגת באמצעות אליסה: AGNx1 (המשקף פעילות צובר), C2M (המשקף פעילות MMP מטריצה), ו ProC2 (המשקף סוג II קולגן מבנה). הממצאים יכולים להיות מאומת על ידי כתמים היסטולוגית של ECM, אשר גם לדמיין את הארגון של כונדרוציטים ב explants בודדים. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי לבדוק את ההשפעה של טיפולים חדשניים על הפונקציה כchondrocyte ומחזור ECM הסחוס. מספר מחקרים השתמשו explants הסחוס לתאר תהליכים ביולוגיים או את ההשפעה של התערבות על explants האתגר cytokine באמצעות היסטולוגית כמותית או אימונוהיסטויוכימיים גישות, mRNA, ביטוי חלבון, או פרוטאומניקס2 ,17,18. עם זאת, פרוטוקולים אלה נמצאים מחוץ לטווח של כתב היד הנוכחי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

לשעבר מערכות תרבות vivo לכסות מגוון רחב של ניסויים המוקדש ללמוד רקמות ותפקוד הסלולר בסביבה מקורית. סחוס הוא רקמה ייחודית חשוב לתפקוד הנכון של משותפת אמתחת והוא היווה על ידי מטריקס מסחטות צפופה (ecm), עשיר פרוטאוגליקן וקולגן סוג II. כונדרוציטים הם סוג התא היחיד הנמצא בתוך הסחוס הם נפוצים יחסית נמוך במספר. גירויים חיצוניים שהשתנו ואיתות סלולרי יכולים להוביל לשינויים בקומפוזיציה ובהתדרדרות של ECM, שהם סימנים פתולוגיים חשובים במחלות כגון אוסטיאוארתריטיס (OA) ודלקת מפרקים שגרונית.
Vivo לשעבר הסחוס מודלים לאפשר 1) הפרופילים של כchondrocyte שינויים בתיווך של מחזור רקמות הסחוס, 2) מדמיין את הרכב ECM הסחוס, ו 3) כchondrocyte הסידור מחדש ישירות ברקמה. יצירת פרופילים של שינויים אלה בתגובה לגירויים או טיפולים הם בעלי חשיבות גבוהה בהיבטים שונים של ביולוגיה של הסחוס, ומשלימים את הניסויים במבחנה בתוך כונדרוציטים מבודדים, או מודלים מורכבים יותר בבעלי חיים בהם התנאים הניסיוניים קשה יותר לשלוט בהם
Explants סחוס להציג שיטה בקלות ונגיש עבור הערכת שיפוץ רקמות ב ECM הסחוס בהגדרות לשליטה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד ו culturing חיות הסחוס הפרה החיה. השיטה משתמשת ברקמה מן הברך הפרה, אשר נגיש בקלות מן הבוצ המקומי. ניתן לנתח הן את האקסוצמחים והן את אמצעי התרבות הממוזג כדי לחקור מחזור רקמות, הרכב ECM, ותפקוד כchondrocyte, ובכך ליצור פרופילים של אפנון ECM.

הרחבות של שור עומק מלא היו מבודדים, מתורבתים ומטופלים במשך 3 שבועות (איור 1). המדיום התרבותי השתנה עם תוספת טיפול 3 פעמים בשבוע. פעם בשבוע, פעילות מטבולית נמדדה על ידי שיטת resazurin. ביוארקרס של מחזור ECM נמדדו על הסופרנטנט שנקטפו מלוח התרבות 3 פעמים בשבוע. Explants חולקו 4 קבוצות לטיפול...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר בידוד ו-culturing של הסחוס לאקצמחים מן הברכיים של הפרה. שיטה זו מספקת כלי קל ונגיש כדי לתאר שינויי רקמה בתגובה גירויים ביולוגיים או רומן therapeutics מיקוד המפרק.

Vivo לשעבר התרבות רקמה מודל של שיפוץ הסחוס של הברך שור בעלי מפעלים

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

שתלי סחוס מייצגים שיטה תרגום נגיש בקלות לחקור שיפוץ רקמות במטריצת הסחוס. השיטה עשויה לספק תובנה מוקדמת כיצד טיפולים חדשים פוטנציאליים משפיעים על מבנה המפרקים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהסחוס נשאר בסביבה תלת-מימדית מקורית, המאפשרת יצירת פרופיל של האינטראקציה בין התאים לבין המטריצה שמסביב באמצעות סמנים ביולוגיים.העיקרון בשיטה אינו ייחודי לסחוס. Explants ניתן לחלץ מרקמות אחרות כגון אוביום, כבד, ריאות ונחקר באמצעות סמנים ביולוגיים מטריצה נגזר. הפגנת ההליך תהיה אמלי אנגסטרום, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.בצע את כל תהליך המקור של הרקמות מחוץ למכסה המנוע של זרימה למינארית בסביבה אספטית. מבית מטבחיים מקומי, השג מפרק ברך טיביאלי טרי שלם מעגלים בגילאי שנה וחצי עד שנתיים. לאחר מכן, בעדינות לנתח את הברך עגל על ידי הסרת תחילה את הבשר העודף, חשיפת condyles, מניסקוס, גידים, קרום סינוביאלי.חותכים את הגידים ואת קרום סינוביאלי המאפשר המפרק לבתר. הסר את המניסקוס כדי לחשוף את תריס הירך. השתמש אגרוף ביופסיה שלושה מילימטר כדי לבודד explants מאזור נושאת העומס של תבלין הירך ולשחרר אותם מפני השטח auricular על ידי חיתוך עם אזמל מקביל וקרוב ככל האפשר לעצם subchondral ככל האפשר.מיד לאחסן ולערבב את explants ב DMEM F12 גלוטימקס תרבות בינוני המכיל 1% פניצילין סטרפטומיצין בצינור 50 מיליליטר או צלחת פטרי. כדי להתחיל culturing רקמות, להעביר את explants לצלחת סטרילית 96 גם במכסה המנוע זרימה למינארית הצבת כל שכפולים בתוך כל קבוצה באלכסון כדי למזער את הווריאציה הנגרמת על ידי אידוי. הוסף PBS ל בארות החיצוניות של צלחת התרבות כדי למנוע עוד יותר אידוי של העל-טבעי.לאחר מכן, לשטוף את explants שלוש פעמים או בינוני תרבות או PBS. תרבות explants ב 200 microliters של תרבות בינונית לגם עד תחילת הניסוי עד 10 שבועות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. אם מיישמים טיפולים כלשהם, מכינים אותם לריכוז המבוקש בארות explant על ידי דילול במדיום התרבות לפני שינוי המדיום.שנה את מדיום התרבות כל יומיים עד שלושה במכסה המנוע של זרימה למינארית. מוציאים בעדינות את העל-טבעי מכל באר ומעבירים אותו לצלחת חדשה של 96 בארות לאחסון. מיד להוסיף 200 microliters של תרבות טרייה בינוני או טיפול לכל באר.אל תתנו ל explants להתייבש במהלך השינוי הבינוני ולהבטיח כי כל explants שקועים לחלוטין במדיום החדש. לאטום את הצלחת החדשה עם סרט איטום ולאחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח סמן ביולוגי של תחלופת רקמות וביטוי חלבון. כדי להתחיל במבחן resazurin, לעשות פתרון של מדיום תרבות המכיל 10%resazurin.לקצור את העל-טבעי כפי שתואר קודם לכן ולטבול את המתפוצצים בתסיסה של 10%resazurin ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות או עד העל-טבעיים הופכים סגולים. לאחר מכן, להעביר את הפתרון resazurin בקרת רקע מותנה לצלחת microtiter שחור למדוד את הפלואורסצנטיות בגירוש של 540 ננומטר פליטה של 590 ננומטר. לאחר מכן, להטביע את explants במדיום לשטוף במשך חמש עד 10 דקות כדי לאפשר resazurin להתפזר לחלוטין ולהוסיף מדיום תרבות חדש או טיפולים אם נעשה שימוש.המשך למדוד את הפעילות המטבולית פעם בשבוע כמדידה עקיפה של כדאיות התא. במחקר זה, מפזרי עומק מלאים של חזיר מבודדים, מתורבתים ומטופלים. Explants מחולקים לארבע קבוצות לטיפול, כולל אלה שטופלו ב- Oncostatin M וגורם נמק הגידול אלפא, אלה שטופלו ב- Oncostatin M וגורם נמק הגידול אלפא עם GM 6001, אלה שטופלו בגורם הגדילה לאינסולין אחד, ובקרה ללא טיפול.הפעילות המטבולית יציבה יחסית לאורך שלושת השבועות עבור כל ארבע הקבוצות. הייתה נטייה IGF-1 להגדיל O בתוספת קבוצות T לרדת בהשוואה לשליטה. O פלוס T מוחל אז על בארות תרבות שלוש פעמים בשבוע כדי לחקור O בתוספת T תיווך השפלה סחוס.O פלוס T נראה להגדיל את סוג שני השפלה קולגן מהיום השביעי עד 21 השפלה aggrecan מיום שלוש עד 14 בהשוואה לקבוצת הביקורת. הוספת GM 6001 בשילוב עם O פלוס T חוסמת את שחרורו של ה-O פלוס T מתווך C2M, אבל יש רק השפעה מוגבלת על AGN X1 עם רמות דומות O בתוספת T הקבוצה ביום 10. אינסולין כמו פקטורי גדילה אחד מוחל שלוש פעמים בשבוע כדי לפזר עומק מלא בקר כדי לחקור כיצד מודולים גירוי אנבוליים תחלופת ECM הסחוס.ההשפעה של IGF-1 על explants הסחוס נצפתה בעיקר על מדידות של סוג שני היווצרות קולגן כצפוי עבור גירויים אנבוליים. כאשר מטפלים עם IGF-1, רמות pro-C2 להקטין פחות מאלה שנצפו בקבוצת הביקורת, המציין כי IGF-1 מגרה סוג שני היווצרות קולגן מהיום השביעי. Explants עלול להתדרדר לאורך זמן ובכך צינור זהיר הוא קריטי בכל צעדי טיפול וכביסה על מנת לא לאבד או להרוס explants בשלבי חילופי התקשורת השונים.תוצאות שנוצרו באמצעות מודל זה לא צריך לעמוד לבד, אבל להיות נתמך על ידי נתונים שנוצרו רקמה אנושית, כמו גם הסלולר במודלים חדשים יותר כדי לאמת עוד יותר את הממצאים. כדי לשפוך אור על המנגנון הבסיסי ברקמה ולא רק על התוצאות, ניתן להמשיך לנתח הן רקמות והן על-טבעיים באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית אחרות, כגון ניתוח ביטוי גנים וחלבונים, או אימונוהיסטוכימיה, או טכניקות ביולוגיה מולקולרית קבועות אחרות.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...