Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

Gli autori ringraziano lo staff tecnico di Nordic Bioscience per il supporto dei laboratori, nonché la Fondazione danese per la ricerca per il sostegno generale alla nostra ricerca.

1. Isolamento dei tessuti
<ol><li>Approvvigionamento dei tessuti<ol>
<li>Eseguire l'intera sezione di approvvigionamento dei tessuti all'esterno di una cappa a flusso laminare in un ambiente asettico.</li>
		<li>Dal macello locale, ottenere un'intera articolazione tibiofemorale del ginocchio bovino fresco dai vitelli tra 1,5 e 2 anni di età.</li>
		<li>Sezionare delicatamente il ginocchio del polpaccio rimuovendo prima la carne in eccesso, scoprendo i condili, il menisco, i tendini e la membrana sinoviale. Tagliare i ...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Il protocollo qui presentato per la profilazione del ricambio dei tessuti cartilari negli espepoli della cartilagine bovina può essere utilizzato per caratterizzare gli effetti di trattamento di molti tipi di farmaci, tra cui inibitori delle vie infiammatorie intracellulari, inibitori di enzimi proteolitici, o fattori di crescita anabolizzanti.
In questo protocollo sono state descritte due diverse impostazioni: un setup anabolizzante in cui gli espianti sono stati stimolati con fattore di cre...

I condrociti producono e mantengono la matrice della cartilagine. Per studiare la biologia dei condrociti e come loro e l'ECM circostante reagiscono a stimoli esterni, è fondamentale interrogarli nel loro ambiente nativo1,2. Lo studio del turnover dei tessuti cartilanei è importante per aumentare la comprensione dei meccanismi sottostanti nelle malattie articolari come l'OA, una malattia per la quale attualmente non esiste un trattamento che modifichi la malattia. Di conseguenza, vi è una notevole necessità di migliori modelli di traduzione2.
La caratterizzazione ex vivo degli effetti cellulari e tissutali è essenziale per completare altri modelli preclinici, sia in vitro, come le colture di motrice condrociti, sia in vivo, come i modelli oA indotti da interventi chirurgici o il modello di artrite autoimmune al collagene (CIA ). Numerosi studi hanno evidenziato le differenze tra il modo in cui le cellule si comportano nelle colture di monostrato 2D e nelle strutture 3D o nel loro tessuto nativo3,4. Molte cellule negli strati 2D adottano morfologie innaturali, comprese le differenze nella polarità cellulare e nell'attaccamento dei tessuti, con conseguenti differenze visive e funzionali nelle cellule all'interno dei tessuti nativi5. Le differenze sono evidenti anche nella funzionalità delle cellule, che possono spostare l'espressione proteica, portando a modelli di differenziazione profondamente alterati, macchinari regolatori e funzionalità cellulare5,6,7 ,8.
La cartilagine ECM consiste principalmente di collagene di tipo II che fornisce un quadro a matrice, e aggrecan, un proteoglicano che aiuta a trattenere il fluido all'interno del tessuto. Altre molecole matriciali come collagene di tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteina oligomericica cartilaginea (COMP), biglycan, decorin e perlecan sono presenti anche9.
Mentre l'eziologia dell'OA rimane poco chiara10,11, l'insorgenza della malattia si crede di essere causato da squilibri nel turnover dei tessuti e processi di riparazione12,13. La degradazione della cartilagine articolare è un segno distintivo di OA. I condrociti residenti nella cartilagine o le cellule nei tessuti circostanti aumentano il loro rilascio di citochine, stimolando la produzione elevata di proteine come le metalloproteine a matrice (MMP) e le aggrecanasi, che aumentano la degradazione della cartilagine ECM 14.Questa degradazione si traduce nel rilascio di piccoli frammenti proteici unici chiamati neo-epitopi, che possono essere quantificati nel siero, nelle urine o nel mezzo di coltura15. Dopo la formazione e la maturazione del collagene, vengono rilasciate anche le cosiddette proframmentazioni; questi possono essere quantificati come misura della produzione di matrici16.
Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire un modello di cartilagine ex vivo per confrontare l'effetto della stimolazione e/o del trattamento farmacologico sul turnover dei tessuti ECM. Il fatturato della cartilagine è profilato misurando i biomarcatori neo-epitopi derivanti dalla matrice direttamente nel mezzo di coltura condizionata utilizzando ELISA: AGNx1 (riflettendo l'attività dell'aggrecanasi), C2M (che riflette l'attività MMP a matrice) e ProC2 (riflettendo il collagene di tipo II) formazione). I risultati possono essere verificati dalla colorazione istologica dell'ECM, che visualizza anche l'organizzazione dei condrociti nei singoli espianti. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l'effetto di nuovi trattamenti sulla funzione condrocite e sulla cartilagine turnover ECM. Una serie di studi ha utilizzato espianti della cartilagine per descrivere i processi biologici o l'effetto dell'intervento sugli espianti sfidati con citochine utilizzando approcci quantitativi istologici o immunohistochimici, mRNA, espressione proteica o proteomica2 ,17,18. Tuttavia, questi protocolli esulano dall'ambito del manoscritto corrente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

I sistemi di coltura Ex vivo coprono un'ampia gamma di esperimenti dedicati allo studio della funzione cellulare e dei tessuti in un ambiente nativo. La cartilagine è un tessuto unico importante per il corretto funzionamento dell'articolazione sinoviale ed è costituito da una densa matrice extracellulare (ECM), ricca di collagene proteoglicano e di tipo II. I condrociti sono l'unico tipo di cellula presente all'interno della cartilagine e sono diffusi e relativamente bassi nel numero. Gli stimoli esterni alterati e la segnalazione cellulare possono portare a cambiamenti nella composizione e nel deterioramento dell'ECM, che sono importanti segni patologici in malattie come l'osteoartrite (OA) e l'artrite reumatoide.
I modelli di cartilagine Ex vivo consentono la profilazione di 1) di alterazioni mediate da condrociti del turnover del tessuto cartilagineo, 2) visualizzando la composizione ECM della cartilagine e 3) riarrangiamento dei condrociti direttamente nel tessuto. La profilazione di queste alterazioni in risposta a stimoli o trattamenti è di grande importanza in vari aspetti della biologia della cartilagine e completa gli esperimenti in vitro in condrociti isolati, o modelli più complessi in animali vivi in cui le condizioni sperimentali sono più difficili da controllare.
Gli esepanti della cartilagine presentano un metodo traslazionale e facilmente accessibile per valutare il rimodellamento dei tessuti nella cartilagine ECM in ambienti controllabili. Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare gli esoti della cartilagine bovina viva. Il metodo utilizza tessuto dal ginocchio bovino, che è facilmente accessibile dalla macelleria locale. Sia gli espianti che il mezzo di coltura condizionata possono essere analizzati per studiare il turnover dei tessuti, la composizione ECM e la funzione di condrocite, profilando così la modulazione ECM.

Gli espianti bovini a fondo sono stati isolati, coltivati e trattati per 3 settimane(Figura 1). Il mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di trattamento 3 volte a settimana. Una volta settimanalmente, l'attività metabolica è stata misurata dall'assaggio di resazurina. I biomarcatori del turnover di ECM sono stati misurati nel supernatore raccolto dalla piastra di coltura 3 volte a settimana. Gli esepanti sono stati divisi in 4 gruppi per il trattamento: 1) Oncostatin M e TNF ( 2...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Qui, presentiamo un protocollo che descrive l'isolamento e la coltura di espiante cartilaginee dalle ginocchia bovine. Questo metodo fornisce uno strumento facile e accessibile per descrivere i cambiamenti dei tessuti in risposta a stimoli biologici o nuove terapie mirati all'articolazione.

Un modello di cultura del tessuto Ex Vivo di Cartilage Rimodellamento in Esplants bovina del ginocchio

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Gli impianti cartilaginei rappresentano un metodo traslazionale facilmente accessibile per interrogare il rimodellamento dei tessuti nella matrice della cartilagine. Il metodo può fornire una visione precoce di come potenziali nuovi trattamenti influenzano la struttura articolare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la cartilagine rimane in un ambiente 3D nativo, che consente la profilazione dell'interazione tra le cellule e la matrice circostante utilizzando biomarcatori.Il principio nel metodo non è unico per la cartilagine. Le espianto possono essere estratte da altri tessuti come un ovio, fegato e polmone e interrogate usando biomarcatori derivati dalla matrice. A dimostrare la procedura sarà Amalie Engstrom, studentessa del nostro laboratorio.Eseguire l'intero processo di approvvigionamento tissutale al di fuori di una cappa di flusso laminare in un ambiente asettico. Da un macello locale, ottenere un'intera articolazione femorale femminile bovina fresca dai vitelli tra 1,5 e due anni. Quindi, sezionare delicatamente il ginocchio del polpaccio rimuovendo prima la carne in eccesso, scoprendo i condili, il menisco, i tendini e la membrana sinoviale.Tagliare i tendini e la membrana sinoviale permettendo all'articolazione di smembrarsi. Rimuovere il menisco per esporre i condili femorali. Utilizzare un punzonatore per biopsia di tre millimetri per isolare le espianto dall'area portante dei condili femorali e rilasciarle dalla superficie auricolare tagliando con un bisturi parallelo e il più vicino possibile all'osso subcondrale.Conservare e mescolare immediatamente le espianto in un mezzo di coltura glutimax DMEM F12 contenente 1%penicillina e streptomicina in un tubo da 50 millilitri o piastra di Petri. Per iniziare la coltura tissutale, trasferire le espianto su una piastra sterile da 96 pozzetti in una cappa di flusso laminare posizionando tutte le repliche all'interno di ciascun gruppo in diagonale per ridurre al minimo la variazione indotta dall'evaporazione. Aggiungere PBS ai pozzali esterni della piastra di coltura per evitare ulteriormente l'evaporazione del supernatante.Quindi, lavare le espianto tre volte nel mezzo di coltura o PBS. Coltura gli espianto in 200 microlitri di mezzo di coltura per pozzo fino all'inizio dell'esperimento per un massimo di 10 settimane in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Se si applicano trattamenti, prepararli alla concentrazione desiderata nei pozzi di espianto per diluizione nel mezzo di coltura prima di cambiare il mezzo.Cambia il mezzo di coltura ogni due o tre giorni in una cappa di flusso laminare. Rimuovere delicatamente il supernatante da ogni pozzo e trasferirlo su una nuova piastra da 96 pozza per lo stoccaggio. Aggiungere immediatamente 200 microlitri di mezzo di coltura fresco o trattamento ad ogni pozzo.Non lasciare asciugare le espianto durante il cambio medio e assicurarsi che tutte le espianto siano completamente immerse nel nuovo mezzo. Sigillare la nuova piastra con nastro adesivo e conservarla a meno 20 gradi Celsius per l'analisi biomarcatore del turnover tissutale e dell'espressione proteica. Per iniziare un test di resazurina, creare una soluzione di supporto per coltura contenente il 10% di resazurina.Raccogliere il supernatante come descritto in precedenza e immergere le espianto nella soluzione di resazurina al 10% a 37 gradi Celsius per tre ore o fino a quando i supernatanti diventano viola. Quindi, trasferire la soluzione di resazurina condizionata e di controllo dello sfondo su una piastra di microtitolo nero e misurare la fluorescenza ad un'eccitazione di 540 nanometri e un'emissione di 590 nanometri. Successivamente, immergere le espianto nel mezzo di lavaggio per cinque-10 minuti per consentire alla resazurina di diffondersi completamente e aggiungere nuovo mezzo di coltura o trattamenti se utilizzato.Continuare a misurare l'attività metabolica una volta alla settimana come misurazione indiretta della vitalità cellulare. In questo studio, le espianto a piena profondità bovina vengono isolate, coltivate e trattate. Le espianto sono suddivise in quattro gruppi per il trattamento, compresi quelli trattati con Oncostatin M e fattore alfa di necrosi tumorale, quelli trattati con Oncostatina M e il fattore di necrosi tumorale alfa con GM 6001, quelli trattati con fattore di crescita dell'insulina uno e un controllo senza trattamento.L'attività metabolica è relativamente stabile durante le tre settimane per tutti e quattro i gruppi. C'era una tendenza per L'IGF-1 ad aumentare e i gruppi O più T a diminuire rispetto al controllo. O più T viene quindi applicato ai pozzi di coltura tre volte a settimana per indagare sulla degradazione mediata della cartilagine O più T.O più T è visto aumentare la degradazione del collagene di tipo due dal settimo al 21 ° giorno e la degradazione dell'aggrecan dai giorni da tre a 14 rispetto al gruppo di controllo. L'aggiunta di GM 6001 in combinazione con O più T blocca il rilascio del C2M mediato O più T, ma ha un effetto limitato su AGN X1 con livelli simili al gruppo O più T al giorno 10. L'insulina come fattore di crescita uno viene applicata tre volte alla settimana agli espianto a piena profondità bovina per indagare come la stimolazione anabolizzante moduli il fatturato ECM cartilagine.L'effetto di IGF-1 sugli espianto di cartilagine è stato osservato principalmente sulle misurazioni della formazione di collagene di tipo due come previsto per gli stimoli anabolizzanti. Quando si tratta con IGF-1, i livelli pro-C2 diminuiscono meno di quelli osservati nel gruppo di controllo, indicando che IGF-1 stimola la formazione di collagene di tipo due dal settimo giorno. Gli espianto possono deteriorarsi nel tempo e quindi un'attenta pipettazione è fondamentale in tutte le fasi di trattamento e lavaggio per non perdere o distruggere le espianto nelle diverse fasi di scambio dei media.I risultati generati utilizzando questo modello non dovrebbero essere autonomi, ma essere supportati dai dati generati nel tessuto umano, nonché cellulare e in modelli più recenti per convalidare ulteriormente i risultati. Per far luce sul meccanismo sottostante nel tessuto e non solo sui risultati, è possibile analizzare ulteriormente sia i tessuti che i supernanti usando altre tecniche di biologia molecolare, come l'analisi dell'espressione genica e proteica, o l'immunoistochimica, o altre tecniche permanenti di biologia molecolare.

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