Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

著者は、北欧バイオサイエンスの技術スタッフにラボサポートを提供し、デンマーク研究財団の研究を一般的な支援に感謝しています。

1. 組織分離
<ol><li>ティッシュソーシング<ol>
<li>無菌環境で層流フードの外側で組織全体の調達セクションを実行します。</li>
		<li>地元の食肉処理場から、1.5歳から2歳までの子牛から新鮮なウシ脛骨大腿骨膝関節全体を得る。</li>
		<li>最初に余分な肉を取り除き、凹凸、半月板、腱、およびスイノビカル膜を明らかにして、ふくらはぎの膝を穏やかに解剖します。腱とスイノブニカル膜を切?...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

ここで提示されるウシ軟骨除植物における軟骨組織回転率のプロファイリングのために提示されるプロトコルは、炎症性細胞内経路の阻害剤、阻害剤を含む多くの種類の薬物の治療効果を特徴付するために使用することができるタンパク質分解酵素、または同化成長因子。
このプロトコルでは、2つの異なるセットアップが説明されました:除植物がインスリン様成長因子...

軟骨細胞は軟骨マトリックスを産生し、維持する。軟骨細胞の生物学を研究し、それらと周囲のECMが外部刺激にどのように反応するかを研究するためには、彼らの母国環境1、2でそれらを尋問することが重要です。軟骨組織のターンオーバーを研究することは、OAなどの関節疾患の基礎的メカニズムの理解を深めるために重要であり、現在疾患改変治療がない疾患である。その結果、より良い翻訳モデル2が大きく必要になります。
細胞および組織効果のEx vivo特性評価は、軟骨細胞単層培養物などのインビトロと、手術誘発OAモデルや自己免疫コラーゲン誘発関節炎モデル(CIA)などの生体内の両方の他の前臨床モデルを補完するために不可欠である).多くの研究は、2D単層培養物と3D構造、または天然組織3、4における細胞の振る舞いの違いを強調している。2D層の多くの細胞は、細胞極性および組織結合の違いを含む不自然な形態を採用し、その結果、天然組織5内の細胞における視覚的および機能的な違いをもたらす。違いは、タンパク質発現をシフトさせる可能性のある細胞の機能性においても明らかであり、分化パターン、調節機械、および細胞機能の大幅な変化につながる5,6,7 、8.
軟骨ECMは、マトリックスフレームワークを提供するII型コラーゲンと、組織内の流体を保持するのに役立つプロテオグリカンであるアグレカンで構成されています。コラーゲンタイプIV、VI、IX、X、XI、XII、フィブロネクチン、軟骨オリゴマータンパク質(COMP)、ビッグリカン、デコリン、およびペルレカンなどの他のマトリックス分子も9に存在する。
OAの病因は不明のままであるが、10、11、この疾患の発症は、組織のターンオーバーおよび修復プロセス12、13の不均衡によって引き起こされると考えられている。関節軟骨の劣化はOAの特徴である。周囲の組織の軟骨細胞または細胞はサイトカインの放出を増加させ、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)やアグレカナーズなどのタンパク質アナーゼの産生の上昇を刺激し、軟骨ECMの分解を増加させる14.この分解は、血清、尿、または培養培地15で定量することができるネオエピトープと呼ばれる小さなユニークなタンパク質断片の放出をもたらす。コラーゲンの形成と成熟に際して、いわゆるプロフラグメントも放出される。これらは、マトリックス生産16の尺度として定量することができる。
このプロトコルの目的は、ECM組織回転率に対する刺激および/または薬物治療の効果を比較するex vivo軟骨モデルを確立することである。軟骨回転率は、ELISAを用いてコンディショニング培養培地中でマトリックス由来ネオエピトープバイオマーカーを直接測定することによってプロファイリングされる:AGNx1(アグレカナゼ活性を反映する)、C2M(マトリックスMMP活性を反映する)、およびProC2(反射型IIコラーゲン)形成)。この知見は、個々の外見における軟骨細胞の組織を可視化するECMの組織学的染色によって検証することができる。記載のプロトコルは、軟骨細胞機能および軟骨ECM回転率に対する新規治療の効果を試験するために使用することができる。多くの研究は、生物学的プロセスまたは細胞カインに挑戦した見葉植物に対する介入の効果を、定量的組織学的または免疫組織化学的アプローチ、mRNA、タンパク質発現、またはプロテオミクス2を用いて記述するために軟骨剥離植物を使用してきた。 、17、18.しかし、これらのプロトコルは、現在の原稿の範囲外です。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Ex vivo培養システムは、ネイティブの設定で組織と細胞機能を研究することに特化した幅広い実験をカバーしています。軟骨は、静脈関節の適切な機能のために重要なユニークな組織であり、密な細胞外マトリックス(ECM)によって構成され、プロテオグリカンとII型コラーゲンが豊富です。軟骨細胞は軟骨内に存在する唯一の細胞型であり、広範囲にわたり、比較的少ない数である。変化した外部刺激および細胞シグナル伝達は、変形性関節症(OA)および関節リウマチなどの疾患において重要な病理学的特徴であるECM組成および劣化の変化につながる可能性がある。
ex vivo軟骨モデルは、軟骨組織回転率の変化を媒介する軟骨細胞のプロファイリング、2)軟骨ECM組成物の可視化、および3)軟骨細胞転位を組織中で直接行うことを可能にする。刺激または治療に応答してこれらの変化をプロファイリングすることは、軟骨生物学の様々な側面において非常に重要であり、単離された軟骨細胞におけるインビトロ実験、または実験条件がある生きている動物におけるより複雑なモデルを補完する制御がより困難です。
軟骨剥離植物は、制御可能な設定で軟骨ECMにおける組織改造を評価するための翻訳的かつ容易にアクセス可能な方法を提示する。ここでは、生きた牛軟骨切除植物を分離および培養するためのプロトコルについて説明する。この方法は、地元の肉屋から簡単にアクセスできる牛の膝からの組織を使用しています。除植物および調節培養培地の両方を分析して、組織のターンオーバー、ECM組成物、および軟骨細胞機能を調べ、ECM変調をプロファイリングすることができる。

牛の全深分の植え付けを単離し、培養し、3週間処理した(図1)。培養培地は、週3回の治療を加えて変更した。週1回、代謝活性をレサズリンアッセイにより測定した。ECM回転率のバイオマーカーは、培養プレートから採取した上清で週3回測定した。エクスプラントは、治療のために4つのグループに分けられた:1)オンコスタチンMおよびTNFα(O+T);。2) O+T + GM6001 (GM6001);3) 成長?...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

ここでは、ウシの膝からの軟骨の切除と培養を記述するプロトコルを提示する。この方法は、関節を標的とする生物学的刺激または新規治療に応答して組織の変化を記述するための容易でアクセス可能なツールを提供する。

牛膝剥離植物における軟骨改造のEx Vivo組織培養モデル

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

軟骨インプラントは、軟骨マトリックスにおける組織のリモデリングを問い出す翻訳簡素なアクセス可能な方法を表す。この方法は、潜在的な新しい治療法が関節構造にどのような影響を与えるかについての早期の洞察を提供するかもしれない。この技術の主な利点は、軟骨がネイティブの3D環境に残り、バイオマーカーを使用して細胞と周囲のマトリックスとの相互作用のプロファイリングを可能にすることです。この方法の原理は軟骨に特有のものではありません。排泄物は、オビウム、肝臓、肺などの他の組織から抽出し、マトリックス由来のバイオマーカーを使用して尋問することができる。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の卒業生であるアマリー・エングストロームです。無菌環境で層流フードの外側の組織調達プロセス全体を実行します。地元の食肉処理場から、1.5歳から2歳までの子牛から新鮮な牛脛骨大腿骨膝関節全体を得る。次に、最初に余分な肉を取り除き、コンディレ、半月板、腱、滑膜を明らかにすることによって、ふくらはぎの膝を穏やかに解剖する。腱と滑膜を切断し、関節をバラバラにします。半月板を取り除き、大腿骨の小間症を露呈する。3ミリメートルの生検パンチャーを使用して、大腿骨顆の負荷軸受面積から外植を分離し、可能な限り軟骨下骨に平行かつ近いメスで切断することによって、耳介表面から外植を放出する。すぐに50ミリリットルチューブまたはペトリ皿に1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM F12グルチマックス培地に外植を保存し、混合します。組織培養を開始するには、蒸発によって誘発される変動を最小限に抑えるために、各グループ内のすべての複製を斜めに配置する層流フードの滅菌96ウェルプレートに外植体を移す。上清の蒸発をさらに避けるために培養板の外側のウェルにPBSを加える。次いで、培養培地またはPBSのいずれかで外植を3回洗浄する。5%の二酸化炭素を有する摂氏37度のインキュベーターで最大10週間の実験開始まで、ウェルあたり200マイクロリットルの培養培地で外植物を培養する。何らかの処理を施す場合は、培地を変える前に培地中で希釈することにより、外植油中の必要な濃度にこれらを調製する。ラミナーフローフードで2~3日ごとに培養培地を交換します。各ウェルから上澄み地をそっと取り出し、新しい96ウェルプレートに移して保管します。すぐに各井戸に新鮮な培養培地または処理の200マイクロリットルを追加します。培地の変化の間に外植を乾燥させず、すべての外植物が新しい媒体に完全に沈まっていることを確認してください。シーリングテープで新しいプレートをシールし、組織のターンオーバーとタンパク質発現のバイオマーカー分析のためにマイナス20°Cで保存します。再サズリン試験を開始するには、10%レサズリンを含有する培地の溶液を作る。先に述べたように上清を収穫し、37°Cで10%の外植物を摂氏37度で、または上清が紫色になるまで浸漬する。次に、調整されたバックグラウンドコントロールのresazurin溶液を黒いマイクロタイタープレートに移し、540ナノメートルの励起と590ナノメートルの放出で蛍光を測定します。この後、外植を洗浄媒体に5〜10分間沈め、レサズリンが完全に拡散し、使用すれば新しい培養培地または治療を加えるようにします。細胞生存率の間接的な測定として、週1回の代謝活性の測定を続ける。本研究では、ウシの完全な深さの外植は、単離、培養、および処理される。外植は治療のために4つのグループに分けられ、治療のために、オンコスタチンMおよび腫瘍壊死因子αで治療したもの、GM 6001でオンコスタチンMおよび腫瘍壊死因子αで治療したもの、インスリン増殖因子1で治療されたもの、および治療なしの対照を含む。代謝活性は、4つのグループすべてについて3週間を通して比較的安定している。IGF-1が増加し、O+T基が対照と比較して減少する傾向があった。次に、OプラスTを週に3回培養井戸に適用し、OプラスT媒介軟骨の分解を調査する。O plus Tは、7日目から21日目までの2種類のコラーゲン分解を増加させ、アグリカン分解を対照群と比較して3日目から14日目に増加させることが分かる。GM 6001をOプラスTと組み合わせて加えると、OとT媒介C2Mの放出がブロックされますが、10日目のO+T群と同様のレベルのAGN X1への影響は限定的です。成長因子1のようなインスリンは、同化刺激が軟骨ECMターンオーバーをどのようにモジュールするかを調査するために、牛の完全な深さの外植に毎週3回適用される。IGF-1が軟骨外植に及ぼす影響は、主に2種類のコラーゲン形成の測定に対して、同化刺激に期待される。IGF-1で治療する場合、Pro-C2レベルは対照群で観察されたものよりも減少し、IGF-1が7日目から2種類のコラーゲン形成を刺激することを示す。外植は時間の経過とともに劣化する可能性があるため、異なるメディア交換ステップで外植物を失ったり破壊したりしないために、すべての処理および洗浄工程において慎重なピペット処理が重要です。このモデルを使用して生成された結果は、単独で立つものではなく、ヒト組織および細胞および新しいモデルで生成されたデータによってサポートされ、発見をさらに検証する必要があります。結果だけでなく、組織の根底にあるメカニズムに光を当てるために、遺伝子やタンパク質発現解析、免疫組織化学、その他の永久的な分子生物学技術などの他の分子生物学技術を使用して、組織と上清の両方をさらに分析することが可能です。

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

初代ヒト卵管上皮細胞のex vivoでの文化

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

小説<em&gt;エクスビボ</emマウス胎児ハート&gt;文化法

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

ex vivoで培養マウス胚の皮膚およびメラノブラストの移行のライブイメージング

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

アン<em&gt;生体外</em甲状腺の開発を研究する&gt;文化システム

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOSタンパク質免疫組織学的検出：特定の生理反応に関与する中央経路のマーカーとして有用ツール<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt; ex vivoで</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

の剛性を測定します<em&gt; ex vivoで</em原子間力顕微鏡を使用&gt;マウス大動脈

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

細胞のエストロゲン産生主ウシ顆粒の組織培養モデル

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

ウシ卵巣皮質組織培養

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...