Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

저자는 실험실 지원을 위한 북유럽 생명과학의 기술 직원, 그리고 우리의 연구의 일반적인 지원을 위한 덴마크 연구 재단에 감사드립니다.

1. 조직 격리
<ol><li>조직 소싱<ol>
<li>무균 환경에서 층류 후드 외부의 전체 조직 소싱 섹션을 수행합니다.</li>
		<li>지역 도살장에서 1.5 세에서 2 세 사이의 송아지에서 신선한 소 경골 무릎 관절 전체를 얻으라.</li>
		<li>먼저 여분의 살을 제거하고, 콘디일, 반월 상 연골, 힘줄 및 활막막을 발견하여 종아리 무릎을 부드럽게 해부하십시오. 힘줄과 활막을 잘라 관절이 절단 할 수 있도록. 대퇴 골반 을...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

소 연골 이식에서 연골 조직 회전율의 프로파일링을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 염증성 세포 내 경로의 억제제, 억제제를 포함하여 많은 유형의 약물의 치료 효과를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 프로테올리산 효소, 또는 단백 동화 성장 인자.
두 개의 다른 설정이 프로토콜에 설명 되었다: 이식 인슐린 같은 성장 인자로 자극 했다 단백 동화 설정 1 (IGF-1), 그리고 TN...

연골 세포는 연골 매트릭스를 생성하고 유지합니다. 연골 세포의 생물학을 연구하고 그들과 주변 ECM이 외부 자극에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해서는 그들의 모국 환경에서 심문하는 것이 중요합니다1,2. 연골 조직 회전율을 공부하는 것은 OA와 같은 합동 질병에 있는 근본적인 기계장치의 이해를 증가시키기 위하여 중요합니다, 질병 은 현재 아무 질병 변경 처리도 없습니다. 따라서 더 나은 번역 모델2에대한 상당한 필요성이 있습니다.
세포 및 조직 효과의 생체 내 특성화는 연골세포 단층 배양과 같은 체외 및 생체 내, 수술 유발 OA 모델 또는 자가면역 콜라겐 유도 관절염 모델(CIA)을 보완하는 데 필수적입니다. ). 수많은 연구는 세포가 2D 단층 배양과 3D 구조또는 그들의 기본 조직에서 어떻게 행동하는지의 차이를 강조했다3,4. 2D 층의 많은 세포는 세포 극성과 조직 부착의 차이를 포함하여 부자연스러운 형태를 채택하여 기본 조직 내의 세포에서 시각적 및 기능적 차이를 모두초래합니다 5. 그 차이는 또한 단백질 발현을 변화시킬 수 있는 세포의 기능성에서 명백하며, 이는 심오한 변화된 분화 패턴, 조절 기계 및 세포 기능5,6,7로 이어진다. ,8.
연골 ECM은 주로 매트릭스 프레임 워크를 제공하는 유형 II 콜라겐으로 구성, 그리고 aggrecan, 조직 내에서 유체를 유지하는 데 도움이 프로테오글리칸. 콜라겐 형 IV, VI, IX, X, XII, 피브로넥틴, 연골 올리고메릭 단백질(COMP), 빅리칸, 데코린 및 펄칸과 같은 다른 매트릭스 분자도9.
OA의 병인학은 불분명하게 남아 있는 동안10,11,질병의 개시는 조직 회전율 및 수리 과정의 불균형에 기인하는 것으로 여겨진다12,13. 관절 연골의 저하는 OA의 특징입니다. 주변 조직에 있는 연골 세포 또는 세포는 사이토카인의 그들의 방출을 증가시키고, 매트릭스 금속 단백질성 (MMPs) 및 동맥과 같은 단백질아종의 높은 생산을 자극하여 연골 ECM의 분해를 증가시다. 14.이러한 분해는 신에피토프라고 불리는 작은 독특한 단백질 단편의 방출을 초래하며, 이는 혈청, 소변, 또는 배양 배지15에서정량화될 수 있다. 콜라겐의 형성과 성숙시, 소위 profragments는 또한 풀어 놓입니다; 이들은 매트릭스 생산(16)의측정으로 정량화 될 수있다.
이 프로토콜의 목적은 ECM 조직 회전율에 대한 자극 및 / 또는 약물 치료의 효과를 비교하기 위해 생체 연골 모델을 확립하는 것입니다. 연골 회전율은 ELISA를 사용하여 컨디셔닝 된 배양 배지에서 매트릭스 유래 네오 에피토프 바이오 마커를 직접 측정하여 프로파일링됩니다: AGNx1 (응형 활성 반영), C2M (반사 매트릭스 MMP 활성), 및 ProC2 (반성 형 II 콜라겐 반사) 형성)을 형성합니다. 사실 인정은 또한 개별 적인 이식에 있는 연골 세포의 조직을 구상하는 ECM의 조직학 염색에 의해 확인될 수 있습니다. 기재된 프로토콜은 연골세포 기능 및 연골 ECM 회전율에 대한 신규한 치료법의 효과를 테스트하는데 사용될 수 있다. 많은 연구에서 생물학적 과정 또는 정량적 조직학적 또는 면역 조직화학적 접근법, mRNA, 단백질 발현 또는 프로테오믹스를 사용하여 사이토카인 도전 이식에 대한 개입의 효과를 설명하기 위해 연골 이식을 사용했습니다2 ,17,18. 그러나 이러한 프로토콜은 현재 원고의 범위를 벗어납니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Ex vivo 배양 시스템은 네이티브 환경에서 조직 및 세포 기능을 연구하는 데 전념하는 광범위한 실험을 다룹니다. 연골은 활액 관절의 적절한 기능에 중요한 독특한 조직이며, 프로테오글리칸과 타입 II 콜라겐이 풍부한 조밀한 세포외 매트릭스(ECM)로 구성됩니다. 연골 세포는 연골 내에 존재하는 유일한 세포 유형이며 광범위하고 상대적으로 숫자가 낮습니다. 변경된 외부 자극 및 세포 신호는 골관절염 (OA) 및 류마치스성 관절염과 같은 질병에 있는 중요한 병리학 적인 특징인 ECM 조성 그리고 열화에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다.
Ex vivo 연골 모델은 1) 연골 조직 회전율의 연골 세포 매개 변경의 프로파일링을 허용하고, 2) 연골 ECM 조성물을 시각화하고, 3) 연골 세포 재배열을 조직에서 직접 재배열할 수 있다. 자극 또는 치료에 대한 응답으로 이러한 변경을 프로파일링은 연골 생물학의 다양한 측면에서 매우 중요하며, 분리 된 연골 세포에서 시험관 내 실험, 또는 실험 조건이있는 살아있는 동물의 복잡한 모델을 보완합니다. 제어하기가 더 어렵습니다.
연골 전지는 제어 가능한 설정에서 연골 ECM에서 조직 리모델링을 평가하기위한 번역 및 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제시한다. 여기에서, 우리는 살아있는 소 연골 이식을 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 소 무릎의 조직을 사용하며, 현지 도축장에서 쉽게 접근 할 수 있습니다. 이식 및 컨디셔닝 된 배양 배지 모두 조직 회전율, ECM 조성 및 연골 세포 기능을 조사하기 위해 분석 될 수 있으며, 따라서 ECM 변조를 프로파일링합니다.

소 전체 깊이 의 이식은 3 주 동안 분리, 배양 및 처리하였다(그림 1). 배양 배지는 일주일에 3회 치료를 추가하여 변경하였다. 1회 주간, 대사 활성은 레자주린 분석에 의해 측정되었다. ECM 회전율의 바이오마커는 배양플레이트로부터 수확한 상복부에서 주 3회 측정하였다. 이식은 치료를 위해 4그룹으로 나누어졌다: 1) 온코스테틴 M 및 TNFα (O+T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) 성장 인...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

여기에서, 우리는 소 무릎에서 연골 이식의 격리 및 배양을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관절을 표적으로 하는 생물학적 자극 또는 새로운 치료법에 반응하여 조직 변화를 설명하기 위한 쉽고 접근가능한 도구를 제공한다.

소 무릎 이식에서 연골 리모델링의 전 생체 외 조직 문화 모델

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

연골 임플란트는 연골 매트릭스에서 조직 리모델링을 심문하는 번역쉽게 접근 할 수있는 방법을 나타냅니다. 이 방법은 잠재적인 새로운 치료가 관절 구조에 미치는 영향에 대한 초기 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연골이 바이오마커를 사용하여 세포와 주변 매트릭스 사이의 상호 작용을 프로파일링을 허용하는 네이티브 3D 환경에 남아 있다는 것입니다.이 방법의 원리는 연골에만 국한되지 않습니다. 박은 ovium, 간 및 폐와 같은 다른 조직에서 추출하고 매트릭스 유래 바이오 마커를 사용하여 심문 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 실험실에서 졸업생 인 Amalie Engstrom이 될 것입니다.무균 환경에서 라미나르 흐름 후드 외부에서 전체 조직 소싱 프로세스를 수행합니다. 현지 도살장에서 1.5세에서 2세 사이의 송아지에서 신선한 소 경골 대퇴 무릎 관절전체를 얻습니다. 그런 다음 종아리 무릎을 먼저 제거하고 condyles, 반월 상 연골, 힘줄 및 수축 막을 발견하여 종아리 무릎을 부드럽게 해부합니다.힘줄과 끈적 끈적한 막을 잘라 관절이 절단 할 수 있도록. 대퇴추를 노출하는 반월 상 연골을 제거합니다. 3mm 생검 펀처를 사용하여 대퇴 엽물의 하중 베어링 영역에서 이출을 분리하고 가능한 한 아부콘드랄 뼈에 가깝게 메스로 절단하여 소변 표면에서 방출하십시오.DMEM F12 글루티맥스 배양 배지에 50밀리리터 튜브 또는 페트리 접시에 1%페니실린과 연쇄절제술을 함유한 배양 배지에 즉시 저장하고 섞는다. 조직 배양을 시작하려면, 각 그룹 내에서 모든 복제를 대각선으로 배치하는 라미나르 플로우 후드에 멸균 96 웰 플레이트에 이출을 전달하여 증발에 의해 유도된 변이를 최소화한다. 초상체의 증발을 피하기 위해 배양 판의 외부 우물에 PBS를 추가합니다.이어서, 배양 배지 또는 PBS에서 이절을 세 번 세척한다. 이산화탄소 5%를 가진 37°C의 인큐베이터에서 최대 10주 동안 실험이 시작될 때까지 양문화 배지 200마이크로리터에 배양한다. 어떤 치료를 적용하는 경우, 배지를 변경하기 전에 배양 배지에서 희석하여 유정에서 원하는 농도로 이들을 준비한다.라미나르 플로우 후드에서 2~3일마다 배양 배지를 변경합니다. 각 우물에서 상체를 부드럽게 제거하고 저장을위한 새로운 96 웰 플레이트로 전송합니다. 즉시 신선한 배양 배지 또는 치료의 200 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.중간 변화 중에 이출가 건조하게 되지 않도록 하고 모든 이출이 새로운 매체에 완전히 침수되도록 하십시오. 새로운 플레이트를 밀봉 테이프로 밀봉하고 조직 회전율 및 단백질 발현의 바이오마커 분석을 위해 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 레사쥐린 테스트를 시작하려면 10%의 레사쥐린을 함유한 배양 배지의 솔루션을 만드십시오.앞에서 설명한 대로 상체를 수확하고 3시간 동안 섭씨 37도또는 초월자가 보라색으로 변할 때까지 10%의 레사쥐린 용액에 담급니다. 이어서, 조건부 및 배경 제어 소쥐린 용액을 검은 마이크로티터 플레이트로 옮기고 540나노미터의 발산과 590나노미터의 방출에서 형광을 측정한다. 그 후, 세척 매체에 5~10분 동안 담그고 레사쥐린이 완전히 확산되고 사용시 새로운 배양 배지 또는 트리트먼트를 추가할 수 있도록 한다.세포 생존가능성의 간접 측정으로 대사 활성을 매주 한 번 측정하십시오. 이 연구에서는 소 전체 깊이 이월이 고립되고 배양되고 치료됩니다. 박은 치료를 위한 4개의 그룹으로 나뉘며, 온코스타틴 M및 종양 괴사 인자 알파로 치료받은 사람, 온코스타틴 M 및 종양 괴사 인자 알파로 치료받은 사람, 인슐린 성장 인자 1개로 치료된 이들, 치료 없이 대조군이다.신진 대사 활동은 4개의 단모두를 위한 3 주 내내 상대적으로 안정적입니다. IGF-1 증가 하는 경향이 있었다 및 O 플러스 T 그룹 제어에 비해 감소. O 플러스 T는 O 플러스 T 매개 연골 저하를 조사하기 위해 일주일에 세 번 문화 우물에 적용됩니다.O 플러스 T는 대조군에 비해 7일째에서 21일째까지 2형 콜라겐 분해를 증가시키고, 아그리컨의 분해를 대조군에 비해 3일에서 14일로 증가시키는 것으로 볼 수 있다. O 플러스 T와 함께 GM 6001을 추가하면 O 플러스 T 매개 C2M의 출시를 차단하지만 10 일째에 O 플러스 T 그룹과 유사한 수준으로 AGN X1에 미치는 영향만 제한적입니다. 성장 인자 1과 같은 인슐린은 연골 ECM 회전율을 모듈하는 방법을 조사하기 위해 소 전체 깊이 각질에 매주 세 번 적용됩니다.연골 연분에 대한 IGF-1의 효과는 주로 단백 동화 자극에 대해 예상대로 2형 콜라겐 형성의 측정에 주로 관찰되었다. IGF-1로 치료 할 때, 프로-C2 수준은 대조군에서 관찰 된 것보다 덜 감소, IGF-1 은 7 일에서 유형 2 콜라겐 형성을 자극 하는 것을 나타내는. 각출은 시간이 지남에 따라 악화될 수 있으므로 다양한 미디어 교환 단계에서 이주를 잃거나 파괴하지 않기 위해 모든 치료 및 세척 단계에서 신중한 파이펫팅이 중요합니다.이 모델을 사용하여 생성된 결과는 단독으로 서서는 안되지만, 연구 결과를 더 검증하기 위해 인간 조직뿐만 아니라 세포 및 최신 모델에서 생성된 데이터에 의해 지원되어야 합니다. 조직의 기본 메커니즘뿐만 아니라 결과뿐만 아니라, 유전자 및 단백질 발현 분석, 또는 면역 조직 화학, 또는 기타 영구 분자 생물학 기술과 같은 다른 분자 생물학 기술을 사용하여 조직과 초월제 모두를 더 분석 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

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기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

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소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

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마우스 배아의 피부와 Melanoblast 이주의 라이브 영상의 생체 문화

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

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<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

은 C-FOS 단백질 면역 조직 검색 : 특정 생리적 반응에 관여 중앙 진학의 마커로서 유용한 도구<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 전의 VIVO</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

소 난소 피질 조직 배양

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...