Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

Os autores agradecem ao pessoal técnico da Nordic Bioscience pelo apoio laboratorial, bem como à Danish Research Foundation pelo apoio geral da nossa investigação.

1. Isolamento de tecidos
<ol><li>Fornecimento de tecidos<ol>
<li>Executar toda a seção de fornecimento de tecido fora de uma capa de fluxo laminar em um ambiente asséptico.</li>
		<li>Do matadouro local, obtenha uma articulação do joelho tibiofemoral bovina fresca inteira de bezerros entre 1,5 e 2 anos de idade.</li>
		<li>Dissecar suavemente o joelho da panturrilha, removendo primeiro o excesso de carne, descobrindo os condyles, menisco, tendões e membrana sinovial. Corte os tendões e a membrana sinovial, permi...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

O protocolo apresentado aqui para o perfil da rotatividade de tecido sino da cartilagem bovina explants pode ser usado para caracterizar os efeitos do tratamento de muitos tipos de drogas, incluindo inibidores de vias intracelulares inflamatórias, inibidores de enzimas proteolíticas, ou fatores de crescimento anabolizantes.
Duas configurações diferentes foram descritas neste protocolo: uma configuração anabolizante onde as explantas foram estimuladas com fator de crescimento semelhante ?...

Condrocitos produzem e mantêm a matriz da cartilagem. A fim de estudar a biologia dos condrócitos e como eles e o ECM circundante reagem a estímulos externos, é crucial interrogá-los em seu ambiente nativo1,2. Estudar a rotatividade de tecidos da cartilagem é importante para aumentar a compreensão dos mecanismos subjacentes em doenças articulares, como a OA, uma doença para a qual atualmente não há tratamento modificador da doença. Consequentemente, há uma necessidade significativa de melhores modelos de tradução2.
A caracterização ex vivo dos efeitos celulares e tecidos é essencial para complementar outros modelos pré-clínicos, tanto in vitro, como culturas monocamadas de condrocito, quanto in vivo, como modelos de OA induzidos por cirurgia ou o modelo de artrite induzida por colágeno autoimune (CIA ). Numerosos estudos destacaram as diferenças entre a forma como as células se comportam em culturas monocamadas 2D e estruturas 3D ou em seu tecido nativo3,4. Muitas células em camadas 2D adotam morfologias não naturais, incluindo diferenças na polaridade celular e fixação de tecidos, resultando em diferenças visuais e funcionais nas células dentro dos tecidos nativos5. As diferenças também são aparentes na funcionalidade das células, que podem mudar a expressão proteica, levando a padrões de diferenciação profundamente alterados, máquinas regulatórias e funcionalidade celular5,6,7 8.
O ECM da cartilagem consiste principalmente no colágeno tipo II que fornece uma estrutura da matriz, e do agressor, um proteoglycan que ajude a reter o líquido dentro do tecido. Outras moléculas mmatrixas como o colágeno tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteína oligomérica da cartilagem (COMP), biglycan, decorina e perlecan também estão presentes9.
Enquanto a aetiologia da OA permanece pouco clara10,11, acredita-se que o início da doença seja causado por desequilíbrios na rotatividade de tecidos e processos de reparo12,13. A degradação da cartilagem articular é uma marca registrada da OA. Condrocitos ou células residentes em cartilagem nos tecidos circundantes aumentam a sua libertação de citocinas, estimulando a produção elevada de proteinases como metaloproteinases matricezas (MMPs) e aglomerações, que aumentam a degradação da cartilagem ECM 14.Esta degradação resulta na liberação de pequenos fragmentos de proteína única chamados neo-epítopos, que podem ser quantificados em soro, urina ou cultura média15. Após a formação e maturação do colágeno, os chamados profragmentos também são liberados; estes podem ser quantificados como uma medida da produção da matriz16.
O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo de cartilagem ex vivo para comparar o efeito da estimulação e/ou tratamento medicamentoso na rotatividade de tecidos ECM. A rotatividade de cartilagem é perfilada pela medição de biomarcadores neo-epitopéus derivados da matriz diretamente no meio de cultura condicionada usando ELISA: AGNx1 (refletindo a atividade da aggrecanase), C2M (atividade de MMP de matriz refletindo) e ProC2 (refletindo o colágeno tipo II formação). Os achados podem ser verificados por manchas histológicas do ECM, que também visualiza a organização de condrocitos nas explantas individuais. O protocolo descrito pode ser usado para testar o efeito de novos tratamentos sobre a função condrócito e cartilagem de volume de negócios ECM. Uma série de estudos têm usado explantas de cartilagem para descrever processos biológicos ou o efeito da intervenção em explantas desafiadas por citocina usando abordagens histológicas ou imunohistoquímicas quantitativas, mRNA, expressão proteica ou proteômica2 17,18. No entanto, esses protocolos estão fora do escopo do manuscrito atual.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Os sistemas de cultura Ex vivo abrangem uma ampla gama de experimentos dedicados ao estudo da função de tecido e celular em um ambiente nativo. A cartilagem é um tecido único importante para a função adequada da articulação sinovial e é constituída por uma densa matriz extracelular (ECM), rica em proteoglican e colágeno tipo II. Condrocitos são o único tipo de célula presente dentro da cartilagem e são difundidos e relativamente baixos em número. Estímulos externos alterados e sinalização celular podem levar a mudanças na composição e deterioração do CmCm, que são importantes características patológicas em doenças como osteoartrite (OA) e artrite reumatóide.
Os modelos de cartilagem ex vivo permitem 1) o perfil de alterações mediadas por condrocitos de volume de negócios de tecido de cartilagem, 2) visualizando a composição do ECM da cartilagem e 3) rearranjo de condrocito diretamente no tecido. O perfil dessas alterações em resposta a estímulos ou tratamentos são de alta importância em vários aspectos da biologia da cartilagem e complementam experimentos in vitro em condrócitos isolados ou modelos mais complexos em animais vivos onde condições experimentais são mais difíceis de controlar.
Os explants da cartilagem apresentam um método translational e facilmente acessível para avaliar a remodelação do tecido na cartilagem ECM em ajustes controláveis. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar e cultivar explantas de cartilagem bovina viva. O método usa o tecido do joelho bovino, que é facilmente acessível a partir da carnificina local. Tanto explantas quanto o meio de cultura condicionada podem ser analisados para investigar a rotatividade de tecidos, composição de ECM e função condrocito, traçando assim o perfil da modulação do CmCM.

As explantas de profundidade total bovinas foram isoladas, cultivadas e tratadas por 3 semanas(Figura 1). O meio de cultura foi alterado com a adição de tratamento 3 vezes por semana. Uma vez semanal, a atividade metabólica foi medida pelo ensaio da resazurina. Os biomarcadores da rotatividade de ECM foram medidos no supernatant colhido da placa de cultura 3 vezes por semana. As explantas foram divididas em 4 grupos para tratamento: 1) Oncostatin m e TNFα (O+T); 2) O+T + GM6001 (GM6001);...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o isolamento e a culturing de explants de cartilagem de joelhos bovinos. Este método fornece uma ferramenta fácil e acessível para descrever mudanças de tecido em resposta a estímulos biológicos ou novas terapêuticas visando a articulação.

Um modelo ex vivo da cultura do tecido da cartilagem que remodela em explants bovinos do joelho

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Implantes de cartilagem representam um método translacional de fácil acesso para interrogar a remodelação tecidual na matriz da cartilagem. O método pode fornecer uma visão precoce de como os potenciais novos tratamentos afetam a estrutura articular. A principal vantagem dessa técnica é que essa cartilagem permanece em um ambiente 3D nativo, que permite o perfil da interação entre as células e a matriz circundante usando biomarcadores.O princípio no método não é exclusivo da cartilagem. Explantas podem ser extraídas de outros tecidos, como ovium, fígado e pulmão e interrogadas usando biomarcadores derivados de matriz. Demonstrando o procedimento será Amalie Engstrom, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.Realize todo o processo de fornecimento de tecido fora de uma coifa de fluxo laminar em um ambiente asséptico. De um matadouro local, obtenha uma articulação de joelho femoral bovina bovina fresca de bezerros entre 1,5 e 2 anos de idade. Em seguida, disseque suavemente o joelho da panturrilha, primeiro removendo o excesso de carne, descobrindo os condyles, menisco, tendões e membrana sinovial.Corte os tendões e a membrana sinovial permitindo que a articulação se desmembre. Remova o menisco para expor os condyles femorais. Use um perfurador de biópsia de três milímetros para isolar explantas da área de rolamento de carga dos condyles femorais e soltá-las da superfície auricular cortando com um bisturi paralelo e o mais próximo possível do osso subcondral.Armazene imediatamente e misture as explantas no meio de cultura glutimax DMEM F12 contendo 1%de penicilina e estreptomicina em um tubo de 50 mililitros ou placa de Petri. Para iniciar a colheita tecidual, transfira as explanações para uma placa de poço estéril de 96 em um capô de fluxo laminar colocando todas as réplicas dentro de cada grupo na diagonal para minimizar a variação induzida pela evaporação. Adicione PBS aos poços externos da placa de cultura para evitar ainda mais a evaporação do supernante.Em seguida, lave as explantas três vezes em meio de cultura ou PBS. Cultura as explanações em 200 microliters de cultura média por poço até o início do experimento por até 10 semanas em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Se aplicar algum tratamento, prepare-os para a concentração desejada nos poços de explantação por diluição no meio de cultura antes de mudar o meio.Mude o meio de cultura a cada dois ou três dias em um capô de fluxo laminar. Remova suavemente o supernatante de cada poço e transfira-o para uma nova placa de 96 poços para armazenamento. Adicione imediatamente 200 microliters de meio de cultura fresca ou tratamento a cada poço.Não deixe as explantas secarem durante a mudança média e certifique-se de que todas as explantas estejam completamente submersas no novo meio. Sele a nova placa com fita de vedação e armazene-a a menos 20 graus Celsius para análise biomarcadora de rotatividade tecidual e expressão proteica. Para iniciar um teste de resazurina, faça uma solução de meio de cultura contendo 10% de resazurina.Colher o supernante como descrito anteriormente e imergir as explantas na solução de resazurina de 10% a 37 graus Celsius por três horas ou até que os supernantes ficam roxos. Em seguida, transfira a solução de resazurina condicionada e de controle de fundo para uma placa de microtâmio preto e meça a fluorescência em uma excitação de 540 nanômetros e uma emissão de 590 nanômetros. Depois disso, submergir as explantas em meio de lavagem por cinco a 10 minutos para permitir que a resazurina se difunda completamente e adicione novos meios de cultura ou tratamentos, se usado.Continue medindo a atividade metabólica uma vez por semana como uma medida indireta da viabilidade celular. Neste estudo, as explantas de profundidade total bovina são isoladas, cultivadas e tratadas. As explanações são divididas em quatro grupos para tratamento, incluindo os tratados com Oncostatin M e fator de necrose tumoral alfa, aqueles tratados com Oncostatin M e fator de necrose tumoral alfa com GM 6001, aqueles tratados com fator de crescimento de insulina um, e um controle sem tratamento.A atividade metabólica é relativamente estável ao longo das três semanas para todos os quatro grupos. A tendência era que o IGF-1 aumentasse e os grupos O mais T diminuíssem em relação ao controle. O mais T é então aplicado a poços de cultura três vezes por semana para investigar a degradação da cartilagem mediada O plus T.O mais T é visto para aumentar a degradação do colágeno tipo dois do sétimo para o 21 e a degradação aggrecan dos dias três para 14 em comparação com o grupo controle. Adicionar GM 6001 em combinação com O plus T bloqueia o lançamento do C2M mediado O plus T, mas só tem efeito limitado no AGN X1 com níveis semelhantes ao grupo O plus T no dia 10. Insulina como fator de crescimento um é aplicado três vezes por semana em explantes de profundidade total bovina para investigar como módulos de estimulação anabólico a cartilagem ECM rotatividade.O efeito do IGF-1 nas explantas da cartilagem foi observado principalmente nas medidas de formação de colágeno tipo dois, como esperado para estímulos anabólicos. Ao tratar com IGF-1, os níveis pró-C2 diminuem menos do que os observados no grupo controle, indicando que o IGF-1 estimula a formação de colágeno tipo dois a partir do sétimo dia. As explantas podem se deteriorar ao longo do tempo e, portanto, a pipetação cuidadosa é fundamental em todas as etapas de tratamento e lavagem, a fim de não perder ou destruir explantas nas diferentes etapas de troca de mídia.Os resultados gerados com esse modelo não devem ficar sozinhos, mas ser suportados por dados gerados no tecido humano, bem como no celular e em modelos mais recentes para validar ainda mais os achados. Para lançar luz sobre o mecanismo subjacente no tecido e não apenas os resultados, é possível analisar mais tanto tecidos quanto supernantes usando outras técnicas de biologia molecular, como análise de expressão genética e proteica, ou imunohistoquímica, ou outras técnicas permanentes de biologia molecular.

Research

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo de Cultura Primária células epiteliais trompa de Falópio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de Cultura para o Rato coração embrionário

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Cultura do Rato Embryonic pele e Live-imaging de Migração melanoblasto

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Uma<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

A proteína c-Fos Detecção imuno: Uma ferramenta útil como um marcador de vias centrais envolvidos em respostas fisiológicas específicas<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Medindo a rigidez<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aortas Usando Microscopia de Força Atômica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Um modelo de cultura de tecidos de produção de estrogênio primário Granulosa bovina células

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Cultura do tecido do córtex ovariano bovino

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Um Ensaio Ex Vivo Choroid de Angiogênese Microvascular Ocular

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...