Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

Авторы благодарят технического персонала Nordic Bioscience за лабораторную поддержку, а также Датский исследовательский фонд за общую поддержку наших исследований.

1. Изоляция тканей
<ol><li>Ткань источников<ol>
<li>Выполните весь раздел поиска ткани за ламинарным капотом потока в асептической среде.</li>
		<li>С местной скотобойни, получить весь свежий бычьего тибиофеморального коленного сустава от телят в возрасте от 1,5 до 2 лет.</li>
		<li>Аккуратно вскрыть ик?...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Представленный здесь протокол для профилирования оборота хрящевой ткани в вылазках хряща крупного рогатого скота может быть использован для характеристики лечебных эффектов многих видов препаратов, включая ингибиторы воспалительных внутриклеточных путей, ингибиторы протеолитичес...

Хондроциты производят и поддерживают матрицу хряща. Для того, чтобы изучить биологию хондроцитов и как они и окружающие ECM реагируют на внешние раздражители, очень важно, чтобы допросить их в их родной среде1,2. Изучение текучести хрящевой ткани важно для расширения понимания основных механизмов в суставных заболеваний, таких как ОА, болезнь, для которой в настоящее время нет болезни изменения лечения. Следовательно, существует значительная потребность в улучшении моделей перевода2.
Ex vivo характеристика клеточных и тканей эффекты имеет важное значение для дополнения других доклинических моделей, как в пробирке, таких как хондроцит монослой культур, и in vivo, таких как хирургия индуцированных моделей ОА или аутоиммунных коллагена индуцированной модели артрита (ЦРУ ). Многочисленные исследования выявили различия между тем, как клетки ведут себя в 2D монослойных культур и 3D структур или в их родной ткани3,4. Многие клетки в 2D слоях принимают неестественные морфологии, в том числе различия в полярности клеток и привязанности тканей, в результате чего как визуальные, так и функциональные различия в клетках в родных тканях5. Различия также проявляются в функциональности клеток, которые могут сдвинуть экспрессию белка, что приводит к глубоко измененным дифференциации моделей, регулятивного механизма и функциональности клеток5,6,7 ,8.
Хрящ ECM состоит в основном из коллагена типа II, обеспечивающего матричную основу, и аггрекан, протеогликан, который помогает удерживать жидкость в ткани. Другие молекулы матрицы, такие как коллаген типа IV, VI, IX, X, XI, XII, фибронектин, хрящ олигомерный белок (COMP), biglycan, декорин, и perlecan также присутствуют9.
Хотя этиология ОА остается неясным10,11, начало заболевания, как полагают, вызвано дисбалансом в текучести тканей и процессов ремонта12,13. Деградация суставного хряща является отличительной чертой ОА. Хондроциты или клетки в окружающих тканях увеличивают высвобождение цитокинов, стимулируя повышенную выработку протеиназов, таких как матричные металлопротеиназы (ММп) и аггреканатазы, которые усиливают деградацию хряща ECM 14. Эта деградация приводит к освобождению небольших уникальных фрагментов белка, называемых неоэпитопами, которые могут быть количественно в сыворотке, моче или культуре среды15. При формировании и созревании коллагена также высвобождаются так называемые профрагменты; они могут быть количественно как мера производства матрицы16.
Целью данного протокола является создание модели хряща ex vivo для сравнения влияния стимуляции и/или медикаментозного лечения на оборот тканей ECM. Оборот хряща профилируется путем измерения матричных биоэпитопных биомаркеров непосредственно в условной среде культуры с использованием ELISA: AGNx1 (отражающая активность аггреканазы), C2M (отражающая активность матрицы MMP) и ProC2 (отражающий коллаген II типа формирования). Выводы могут быть проверены гистологическим окрашиванием ECM, который также визуализирует организацию хондроцитов в отдельных эксцатах. Описанный протокол может быть использован для проверки влияния новых методов лечения на функцию хондроцитов и оборот хряща ECM. Ряд исследований использовали хрящевые экспланты для описания биологических процессов или влияния вмешательства на цитокин-оспоренные экспланты с использованием количественных гистологических или иммуногистохимических подходов, мРНК, экспрессии белка или протеомики2 ,17,18. Однако эти протоколы выходят за рамки текущей рукописи.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Системы культуры Ex vivo охватывают широкий спектр экспериментов, посвященных изучению тканей и клеточной функции в родной обстановке. Хрящ является уникальной тканью, важной для правильной функции синовиального сустава и состоит из плотной внеклеточной матрицы (ECM), богатой протеогликаном и коллагеном II типа. Хондроциты являются единственным типом клеток, присутствующих в хрящевой и широко распространены и относительно низкив по количеству. Измененные внешние стимулы и клеточная сигнализация могут привести к изменениям в составе ЭКМ и ухудшению, которые являются важными патологическими признаками при таких заболеваниях, как остеоартрит (ОА) и ревматоидный артрит.
Модели хряща Ex vivo позволяют 1) профилирование хондроцитов опосредованного изменения оборота хрящевой ткани, 2) визуализации состава хряща ECM, и 3) хондроцитов перестановки непосредственно в ткани. Профилирование этих изменений в ответ на стимулы или лечения имеют большое значение в различных аспектах биологии хряща, и дополняют эксперименты in vitro в изолированных хондроцитах, или более сложные модели у живых животных, где экспериментальные условия труднее контролировать.
Хрящ explants представить переводный и легко доступный метод для оценки ткани ремоделирования в хрящеe ECM в контролируемых условиях. Здесь мы описываем протокол для изоляции и культивирования живых выемок хряща крупного рогатого скота. Метод использует ткани из бычьего колена, который легко доступен из местной бойни. Оба explants и обусловленной среды культуры можно проанализировать для того чтобы исследовать оборачиваемость ткани, состав ECM, и функцию хондроцита, таким образом профилировать модуляцию ECM.

Бовин полноглубинные экспланты были изолированы, культурны, и лечение в течение 3 недель(рисунок 1). Культура среда была изменена с добавлением лечения 3 раза в неделю. Однажды еженедельно метаболическая активность измерялась с помощью резазурина. Биомаркеры оборота ECM и...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Здесь мы представляем протокол, описывающий изоляцию и культивирование эксрастений хряща от бычьих коленей. Этот метод обеспечивает простой и доступный инструмент для описания изменений тканей в ответ на биологические стимулы или новые терапевтические средства, направленные на сустав.

Ex Vivo Ткань Культура Модель хряща Ремоделирования в Bovine колено Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Хрящ имплантаты представляют собой переводный легко доступный метод для допроса ткани ремоделирования в матрице хряща. Метод может обеспечить раннее понимание того, как потенциальные новые методы лечения влияют на структуру суставов. Основным преимуществом этого метода является то, что хрящ остается в родной 3D-среде, что позволяет профилировать взаимодействие между клетками и окружающей матрицей с помощью биомаркеров.Принцип в методе не уникален для хряща. Экспланты могут быть извлечены из других тканей, таких как овий, печень и легкие и допрошены с помощью матрицы производных биомаркеров. Демонстрацией процедуры будет Амали Энгстром, аспирант из нашей лаборатории.Выполните весь процесс поиска тканей за пределами ламинарного капюшона потока в асептической среде. С местной скотобойни, получить весь свежий бычий трибиальный бедренной коленного сустава от телят в возрасте от 1,5 до двух лет. Затем, нежный вскрыть колено теленка, сначала удалив избыток плоти, раскрытие кондилов, мениска, сухожилий и синовиальной мембраны.Вырезать сухожилия и синовиальной мембраны позволяет сустава расчленить. Удалите мениска, чтобы разоблачить бедренную кондили. Используйте три миллиметра биопсии перфоратор, чтобы изолировать explants от нагрузки подшипник области бедренной кости и освободить их от иллюминационной поверхности путем резки скальпелем параллельно и как можно ближе к субхондральной кости, как это возможно.Немедленно хранить и смешивать explants в DMEM F12 glutimax культуры среды, содержащей 1%пенициллин и стрептомицин в 50 миллилитров трубки или Чашки Петри. Чтобы начать культивирование тканей, перенесите экспланты в стерильную пластину 96 хорошо в ламинарном капюшоне потока размещения всех репликаций в каждой группе по диагонали, чтобы свести к минимуму изменения, вызванные испарения. Добавьте PBS к наружным колодцам пластины культуры, чтобы избежать испарения супернатанта.Затем, мыть explants три раза в любой среде культуры или PBS. Культура explants в 200 микролитров среды культуры на колодец до начала эксперимента на срок до 10 недель в инкубаторе при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа. При применении каких-либо методов лечения, подготовить их к нужной концентрации в explant скважин путем разбавления в среде культуры до изменения среды.Изменение культуры среды каждые два-три дня в ламинарный капюшон потока. Аккуратно удалите супернатант из каждой хорошо и перенесите его на новую пластину 96 хорошо для хранения. Немедленно добавьте 200 микролитров свежей культуры среды или лечения к каждому хорошо.Не позволяйте explants высохнуть во время среднего изменения и убедитесь, что все explants полностью погружены в новую среду. Печать новой пластины с уплотнительной лентой и хранить его при температуре минус 20 градусов по Цельсию для биомаркера анализа текучести тканей и экспрессии белка. Чтобы начать резазурин-тест, сделайте решение среды культуры, содержащее 10%resazurin.Урожай супернатант, как описано ранее, и погрузить explants в 10%resazurin раствор при 37 градусов по Цельсию в течение трех часов или до тех пор, пока супернатанты свою очередь, фиолетовый. Затем перенесите условный и фоновый контроль раствора резазурина на черную пластину микротитра и измерьте флуоресценцию при возбуждении 540 нанометров и выбросе 590 нанометров. После этого, погрузить explants в мытье среды в течение пяти до 10 минут, чтобы резазурин полностью рассеять и добавить новые культуры среды или лечения при использовании.Продолжить измерение метаболической активности один раз в неделю в качестве косвенного измерения жизнеспособности клеток. В этом исследовании, бычья полная глубина explants изолированы, культурные, и лечение. Экспланты делятся на четыре группы для лечения, в том числе тех, которые лечатся онкостатином M и фактором некроза опухоли альфа, те, которые лечатся онкостатином M и фактором некроза опухоли альфа с ГМ 6001, те, которые лечатся с фактором роста инсулина один, и контроль без лечения.Метаболическая активность относительно стабильна в течение трех недель для всех четырех групп. Существовала тенденция к увеличению IGF-1, а группы O plus T уменьшались по сравнению с контролем. O плюс T затем применяется к культуре скважин три раза в неделю, чтобы исследовать O плюс T опосредованного деградации хряща.O плюс T, как видно, увеличение типа два коллагена деградации с седьмого дня до 21 и аггреканской деградации с 3 до 14 дней по сравнению с контрольной группой. Добавление GM 6001 в сочетании с O плюс T блокирует выпуск O плюс T опосредованного C2M, но только имеет ограниченное влияние на AGN X1 с уровнями, похожими на группу O plus T в день 10. Инсулин, как фактор роста один применяется три раза в неделю, чтобы бычьей полной глубины explants исследовать, как анаболические модули стимуляции хряща ECM оборота.Влияние IGF-1 на экспланты хряща наблюдалось в основном на измерениях образования коллагена второй типа, как и ожидалось для анаболических стимулов. При лечении IGF-1, про-C2 уровни уменьшаются меньше, чем те, которые наблюдаются в контрольной группе, указывая, что IGF-1 стимулирует образование коллагена типа два с седьмого дня. Explants может ухудшиться с течением времени и, таким образом, тщательная пипетка имеет решающее значение во всех шагов по обработке и стирке, чтобы не потерять или уничтожить explants в различных шагах обмена средствами массовой информации.Результаты, полученные с использованием этой модели, не должны стоять особняком, а должны подкрепляться данными, генерируемыми в тканях человека, а также в клеточных и более новых моделях для дальнейшей проверки результатов. Чтобы пролить свет на основной механизм в ткани, а не только результаты, можно дальнейшего анализа тканей и супернатантов с помощью других методов молекулярной биологии, таких как анализ экспрессии генов и белков, или иммуногистохимия, или другие постоянные методы молекулярной биологии.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Роман<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Метод эмбриональном сердце мыши

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Экс естественных Культура мышиных эмбриональных Внешний Live-визуализации меланобластов миграции

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Культура Система по изучению развития щитовидной железы

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS белка Обнаружение иммуногистохимического: Полезный инструмент в качестве маркера Центральной путей, участвующих в конкретных физиологических реакций<em&gt; В Vivo</em&gt; и<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Измерение Жесткость<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Аорте при помощи мыши атомно-силовой микроскопии

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Культура ткани модель эстроген производителей первичного говядину гранулезы ячейки

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Культура ткани коры яичников крупного рогатого скота

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Ex Vivo Choroid Прорастание анализ глазного микрососудистого ангиогенеза

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...