Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
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Los autores agradecen al personal técnico de Nordic Bioscience el apoyo de laboratorio, así como a la Fundación Danesa de Investigación por el apoyo general a nuestra investigación.

1. Aislamiento de tejidos
<ol><li>Abastecimiento de tejidos<ol>
<li>Realice toda la sección de abastecimiento de tejido fuera de una campana de flujo laminar en un entorno aséptico.</li>
		<li>Del matadero local, obtenga una articulación entera de rodilla tibiofemoral bovina fresca de terneros entre 1,5 y 2 años de edad.</li>
		<li>Disecciona suavemente la rodilla de la pantorrilla eliminando primero el exceso de carne, descubriendo los cóndilos, el menisco, los tendones y la membrana sinovial. Cortar los tendones...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

El protocolo presentado aquí para la elaboración de perfiles de rotación de tejido de cartílago en explantas de cartílago bovino se puede utilizar para caracterizar los efectos del tratamiento de muchos tipos de fármacos, incluidos los inhibidores de las vías intracelulares inflamatorias, los inhibidores de enzimas proteolíticas, o factores de crecimiento anabólicos.
En este protocolo se describieron dos configuraciones diferentes: una configuración anabólica en la que se estimularo...

Los condrocitos producen y mantienen la matriz del cartílago. Con el fin de estudiar la biología de los condrocitos y cómo ellos y el ECM circundante reaccionan a los estímulos externos, es crucial interrogarlos en su entorno nativo1,2. El estudio de la rotación del tejido del cartílago es importante para aumentar la comprensión de los mecanismos subyacentes en enfermedades articulares como la OA, una enfermedad para la que actualmente no existe un tratamiento modificador de la enfermedad. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de mejores modelos de traducción2.
La caracterización ex vivo de los efectos celulares y tisulares es esencial para complementar otros modelos preclínicos, tanto in vitro, como cultivos monocapa de condrocitos, como in vivo, como modelos de OA inducidos por cirugía o el modelo de artritis autoinmune inducida por colágeno (CIA ). Numerosos estudios han destacado las diferencias entre cómo se comportan las células en cultivos monocapa 2D y estructuras 3D o en su tejido nativo3,4. Muchas células en capas 2D adoptan morfologías no naturales, incluyendo diferencias en la polaridad celular y la unión tisular, lo que resulta en diferencias visuales y funcionales en las células dentro de los tejidos nativos5. Las diferencias también son evidentes en la funcionalidad de las células, que pueden desplazar la expresión de proteínas, lo que conduce a patrones de diferenciación profundamente alterados, maquinaria reguladora y funcionalidad celular5,6,7 ,8.
El eCM del cartílago consiste principalmente en colágeno tipo II que proporciona un marco de matriz, y agrecan, un proteoglicano que ayuda a retener el líquido dentro del tejido. Otras moléculas de matriz como colágeno tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteína oligomérica del cartílago (COMP), biglycan, decorin, y perlecan también están presentes9.
Mientras que la etiología de OA sigue sin estar clara10,11, la aparición de la enfermedad se cree que es causada por desequilibrios en los procesos de rotación y reparación de tejidos12,13. La degradación del cartílago articular es un sello distintivo de la OA. Los condrocitos o células residentes en el cartílago en los tejidos circundantes aumentan su liberación de citoquinas, estimulando la producción elevada de proteinasas como las metaloproteinasas matriciales (MMP) y las agresorasas, que aumentan la degradación del cartílago ECM 14. Esta degradación da lugar a la liberación de pequeños fragmentos de proteína únicos llamados neoepítos, que se pueden cuantificar en suero, orina o medio de cultivo15. Tras la formación y maduración del colágeno, también se liberan los llamados profragmentos; estos pueden cuantificarse como medida de la producción de matriz16.
El objetivo de este protocolo es establecer un modelo de cartílago ex vivo para comparar el efecto de la estimulación y/o el tratamiento farmacológico en la rotación de tejido SCM. La rotación del cartílago se perfila midiendo biomarcadores de neoepitopos derivados de la matriz directamente en el medio de cultivo condicionado utilizando ELISA: AGNx1 (que refleja la actividad de la agresorasa), C2M (que refleja la actividad de MMP de matriz) y ProC2 (reflejando colágeno tipo II formación). Los hallazgos pueden ser verificados por la tinción histológica del ECM, que también visualiza la organización de los condrocitos en los explantes individuales. El protocolo descrito se puede utilizar para probar el efecto de nuevos tratamientos sobre la función de condrocitos y la rotación de ECM de cartílago. Varios estudios han utilizado explantes de cartílago para describir procesos biológicos o el efecto de la intervención en explantes con problemas de citoquinas utilizando enfoques histológicos o inmunohistoquímicos cuantitativos, ARNm, expresión de proteínas o proteómica2 ,17,18. Sin embargo, estos protocolos están fuera del alcance del manuscrito actual.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Los sistemas de cultivo ex vivo cubren una amplia gama de experimentos dedicados al estudio de la función tisular y celular en un entorno nativo. El cartílago es un tejido único importante para el correcto funcionamiento de la articulación sinovial y está constituido por una matriz extracelular densa (ECM), rica en proteoglicano y colágeno tipo II. Los condrocitos son el único tipo de célula presente dentro del cartílago y son generalizados y relativamente bajos en número. Los estímulos externos alterados y la señalización celular pueden conducir a cambios en la composición y el deterioro de la ECM, que son importantes señas de identidad patológicas en enfermedades como la osteoartritis (OA) y la artritis reumatoide.
Los modelos de cartílago ex vivo permiten 1) perfilar alteraciones mediadas por condrocitos de rotación de tejido de cartílago, 2) visualizar la composición del cartílago ECM y 3) reorganizar condrocitos directamente en el tejido. La elaboración de perfiles de estas alteraciones en respuesta a estímulos o tratamientos son de gran importancia en diversos aspectos de la biología del cartílago, y complementan los experimentos in vitro en condrocitos aislados, o modelos más complejos en animales vivos donde las condiciones experimentales son más difíciles de controlar.
Los explantes de cartílago presentan un método traslacional y de fácil acceso para evaluar la remodelación de tejidos en el ECM del cartílago en entornos controlables. Aquí, describimos un protocolo para aislar y cultivar explantes vivos de cartílago bovino. El método utiliza tejido de la rodilla bovina, que es fácilmente accesible desde la carnicería local. Tanto los explantas como el medio de cultivo condicionado se pueden analizar para investigar la rotación de tejidos, la composición de ECM y la función de condrocitos, lo que genera perfiles de modulación de ECM.

Los explantes bovinos a profundidad fueron aislados, cultivados y tratados durante 3 semanas(Figura 1). El medio de cultivo se cambió con la adición de tratamiento 3 veces por semana. Una vez por semana, la actividad metabólica se midió mediante el ensayo de resazurina. Los biomarcadores de la rotación de ECM se midieron en el sobrenadante cosechado de la placa de cultivo 3 veces por semana. Los explantas se dividieron en 4 grupos para el tratamiento: 1) Oncostatin M y TNF (O+T); 2) O+T...

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An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Aquí, presentamos un protocolo que describe el aislamiento y el cultivo de explantes de cartílago de rodillas bovinas. Este método proporciona una herramienta fácil y accesible para describir los cambios de tejido en respuesta a estímulos biológicos o nuevas terapias dirigidas a la articulación.

Un modelo de cultivo de tejido ex vivo de remodelación del cartílago en explantes de rodilla bovinas

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Los implantes de cartílago representan un método traslacional de fácil acceso para interrogar la remodelación del tejido en la matriz del cartílago. El método puede proporcionar una visión temprana de cómo los nuevos tratamientos potenciales afectan la estructura articular. La principal ventaja de esta técnica es que el cartílago permanece en un entorno 3D nativo, que permite perfilar la interacción entre las células y la matriz circundante utilizando biomarcadores.El principio en el método no es exclusivo del cartílago. Las plantas se pueden extraer de otros tejidos como un óvulo, hígado y pulmón e interrogarse utilizando biomarcadores derivados de matrices. Demostrando el procedimiento estará Amalie Engstrom, una estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.Realice todo el proceso de abastecimiento de tejido fuera de una campana de flujo laminar en un entorno aséptico. De un matadero local, obtener una articulación de rodilla femoral tibial bovina fresca entera de terneros entre 1,5 y dos años de edad. Luego, disecciona suavemente la rodilla de la pantorrilla primero eliminando el exceso de carne, descubriendo los cónditos, menisco, tendones y membrana sinovial.Cortar los tendones y la membrana sinovial permitiendo que la articulación se desmembra. Retire el menisco para exponer los cónlabios femorales. Utilice un punzón de biopsia de tres milímetros para aislar los explantes del área de carga de los cóndilos femorales y liberarlos de la superficie auricular cortando con un bisturí paralelo y lo más cerca posible del hueso subcondral.Almacene y mezcle inmediatamente los explantes en un medio de cultivo de GLutimax DMEM F12 que contenga 1%penicilina y estreptomicina en un tubo de 50 mililitros o una placa Petri. Para comenzar el cultivo de tejido, transfiera los explantes a una placa estéril de 96 pozos en una campana de flujo laminar colocando todas las réplicas dentro de cada grupo diagonalmente para minimizar la variación inducida por la evaporación. Añadir PBS a los pozos exteriores de la placa de cultivo para evitar aún más la evaporación del sobrenadante.A continuación, lave los explants tres veces en medio de cultivo o PBS. Cultivo de los explantes en 200 microlitros de medio de cultivo por pozo hasta el inicio del experimento durante hasta 10 semanas en una incubadora a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono. Si se aplica algún tratamiento, prepárelos a la concentración deseada en los pozos explantes por dilución en el medio de cultivo antes de cambiar el medio.Cambie el medio de cultivo cada dos o tres días en una campana de flujo laminar. Retire suavemente el sobrenadante de cada pozo y transfiéralo a una nueva placa de 96 pozos para su almacenamiento. Añadir inmediatamente 200 microlitros de medio de cultivo fresco o tratamiento a cada pozo.No deje que los explantes se sequen durante el cambio medio y asegúrese de que todos los explantes estén completamente sumergidos en el nuevo medio. Selle la nueva placa con cinta adhesiva y guárdela en menos 20 grados Celsius para el análisis de biomarcadores de la rotación de tejidos y la expresión de proteínas. Para comenzar una prueba de resazurin, haga una solución de medio de cultivo que contenga 10%resazurin.Cosecha el sobrenadante como se describió anteriormente y sumerge los explantes en la solución de 10%resazurin a 37 grados Celsius durante tres horas o hasta que los sobrenadantes se vuelvan púrpuras. A continuación, transfiera la solución de resazurin condicionada y de control de fondo a una placa de microtiter negro y mida la fluorescencia con una excitación de 540 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros. Después de esto, sumergir los explantes en medio de lavado durante cinco a 10 minutos para permitir que la resazurin se difunda por completo y añadir nuevo medio de cultivo o tratamientos si se utiliza.Continuar midiendo la actividad metabólica una vez por semana como una medida indirecta de la viabilidad celular. En este estudio, los explantes de profundidad completa bovina son aislados, cultivados y tratados. Los explantes se dividen en cuatro grupos para el tratamiento, incluidos los tratados con Oncostatina M y el factor alfa de necrosis tumoral, los tratados con Oncostatina M y el factor de necrosis tumoral alfa con GM 6001, los tratados con el factor de crecimiento de insulina uno y un control sin tratamiento.La actividad metabólica es relativamente estable a lo largo de las tres semanas para los cuatro grupos. Hubo una tendencia para IGF-1 para aumentar y O más grupos T para disminuir en comparación con el control. O más T se aplica a pozos de cultivo tres veces a la semana para investigar O más la degradación del cartílago mediado T.O más T se ve para aumentar la degradación del colágeno tipo dos del día siete a 21 y la degradación agraquina de los días tres a 14 en comparación con el grupo de control. La adición de GM 6001 en combinación con O más T bloquea la versión del C2M mediado O más T, pero solo tiene un efecto limitado en AGN X1 con niveles similares al grupo O más T en el día 10. Insulina como factor de crecimiento uno se aplica tres veces por semana a los explantes de profundidad completa bovino para investigar cómo módulos de estimulación anabólica la rotación de ECM de cartílago.El efecto de IGF-1 en los explantes de cartílago se observó principalmente en las mediciones de tipo dos formación de colágeno como se esperaba para los estímulos anabólicos. Cuando se trata con IGF-1, los niveles pro-C2 disminuyen menos que los observados en el grupo de control, lo que indica que IGF-1 estimula la formación de colágeno tipo dos desde el día siete. Los explantes pueden deteriorarse con el tiempo y, por lo tanto, el pipeteo cuidadoso es crítico en todos los pasos de tratamiento y lavado con el fin de no perder o destruir los explantes en los diferentes pasos de intercambio de medios.Los resultados generados con este modelo no deben ser independientes, sino que deben estar respaldados por datos generados en tejidos humanos, así como celulares y en modelos más recientes para validar aún más los hallazgos. Para arrojar luz sobre el mecanismo subyacente en el tejido y no sólo los resultados, es posible analizar más a fondo tanto los tejidos como los sobrenadantes utilizando otras técnicas de biología molecular, como el análisis de expresión de genes y proteínas, o la inmunohistoquímica, u otras técnicas permanentes de biología molecular.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

La proteína c-Fos detección inmunohistoquímico: una herramienta útil como marcador de vías centrales implicados en las respuestas fisiológicas específicas<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Un modelo de cultivo de tejidos de Granulosa bovino primario producción de estrógeno de las células

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Cultivo de tejido de corteza ovárica bovina

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Un ensayo ex vivo de brotes de coroides de angiogénesis microvascular ocular

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...