Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

Författarna tackar den tekniska personalen på Nordic Bioscience för laboratorie stöd, samt den danska forskningsstiftelsen för allmänt stöd för vår forskning.

1. vävnads isolering
<ol><li>Vävnads anskaffning<ol>
<li>Utför hela vävnads sourcing sektionen utanför ett laminärt flödeshuv i en aseptisk miljö.</li>
		<li>Från det lokala slakteriet, skaffa en hel färsk bovint hos knäled från kalvar mellan 1,5 och 2 års ålder.</li>
		<li>Försiktigt dissekera kalv knäet genom att först ta bort överflödigt kött, avslöja kondylerna, menisken, senor, och LED membran. Skär senor och LED membran, vilket gör att leden till Dismember. Ta bort menisken för att exponer...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Det protokoll som presenteras här för profilering av broskvävnad omsättning hos bovint brosk djur kan användas för att karakterisera Behandlingseffekterna av många typer av läkemedel, inklusive hämmare av inflammatoriska intracellulära vägar, hämmare av proteolytiska enzymer, eller anabola tillväxtfaktorer.
Två olika uppställningar beskrevs i detta protokoll: en anabola inställning där djur stimulerades med insulin-liknande tillväxtfaktor 1 (IGF-1), och en katabol inställnin...

Chondrocyter producera och underhålla brosk Matrix. För att studera biologin av kondrocyter och hur de och den omgivande ECM reagerar på yttre stimuli, är det viktigt att förhöra dem i deras infödda miljö1,2. Att studera broskvävnad omsättning är viktigt att öka förståelsen av de bakomliggande mekanismerna i gemensamma sjukdomar som OA, en sjukdom för vilken det för närvarande inte finns någon sjukdomsmodifierande behandling. Därför finns det ett stort behov av bättre översättnings modeller2.
Ex vivo karakterisering av cell-och vävnads effekter är viktigt att komplettera andra prekliniska modeller, både in vitro, såsom kondrocyte enskiktslager kulturer, och in vivo, såsom kirurgi-inducerad OA modeller eller den autoimmuna kollagen-inducerad artrit modell (CIA ). Många studier har belyst skillnaderna mellan hur celler beter sig i 2D enskiktslager kulturer och 3D-strukturer eller i deras ursprungliga vävnad3,4. Många celler i 2D-skikt anta onaturliga morfologier, inklusive skillnader i cellpolaritet och vävnad kvarstad, vilket resulterar i både visuella och funktionella skillnader i celler inom infödda vävnader5. Skillnaderna är också uppenbara i funktionaliteten hos cellerna, som kan skifta proteinuttryck, vilket leder till djupt förändrad differentiering mönster, reglerande maskiner och cellfunktioner5,6,7 ,8.
Brosk ECM består huvudsakligen av typ II kollagen som ger en matris ram, och aggrecan, en proteoglykan som hjälper till att behålla vätska i vävnaden. Andra Matrix molekyler som kollagen typ IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, brosk oligomeriska protein (COMP), biglycan, Decorin och perlecan finns också9.
Medan etiologi OA fortfarande oklar10,11, uppkomsten av sjukdomen tros orsakas av obalanser i vävnad omsättning och reparationsprocesser12,13. Nedbrytningen av ledbrosk är ett kännetecken för OA. Brosk-bosatt chondrocyter eller celler i de omgivande vävnaderna öka deras frisättning av cytokiner, stimulera förhöjd produktion av proteinaser såsom Matrix metalloproteinaser (MMPs) och aggrecanases, som ökar nedbrytningen av brosk ECM 14. denna nedbrytning resulterar i frisättning av små unika proteinfragment kallas neo-epitopes, som kan kvantifieras i serum, urin, eller kultur medium15. Vid bildandet och mogningen av kollagen, så kallade profragment frigörs också; dessa kan kvantifieras som ett mått på matris produktion16.
Syftet med detta protokoll är att upprätta en ex vivo brosk modell för att jämföra effekten av stimulering och/eller läkemedelsbehandling av ECM-vävnadens omsättning. Brosket omsättningen profileras genom att mäta matris-härledda Neo-epitop biomarkörer direkt i den konditionerade odlingssubstrat med hjälp av ELISA: AGNx1 (reflekterande aggrecanase aktivitet), C2M (reflekterande Matrix MMP aktivitet), och ProC2 (reflekterande typ II kollagen bildning). Resultaten kan verifieras genom histologisk färgning av ECM, som också visualiserar organisationen av chondrocyter i enskilda explants. Det beskrivna protokollet kan användas för att testa effekten av nya behandlingar på Chondrocyte funktion och brosk ECM omsättning. Ett antal studier har använt brosk djur för att beskriva biologiska processer eller effekten av intervention på cytokin-utmanade djur med hjälp av kvantitativa histologiska eller immunohistokemiska metoder, mRNA, proteinuttryck eller proteomik2 ,17,18. Dessa protokoll finns dock utanför tillämpningsområdet för det aktuella manuskriptet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Ex vivo kultur system omfattar ett brett spektrum av experiment som ägnas åt att studera vävnad och cellulär funktion i en ursprunglig miljö. Brosk är en unik vävnad viktigt för korrekt funktion av LED leden och utgörs av en tät extracellulär matris (ECM), rik på proteoglykan och typ II kollagen. Chondrocyter är den enda celltypen som finns inom brosk och är utbredd och relativt låg till antalet. Förändrade yttre stimuli och cellulär signalering kan leda till förändringar i ECM sammansättning och försämring, som är viktiga patologiska kännetecken vid sjukdomar som artros (OA) och reumatoid artrit.
Ex vivo brosk modeller tillåter 1) profilering av Chondrocyte medierade förändringar av broskvävnad omsättning, 2) visualisera brosket ECM sammansättning, och 3) kondrocyte rearrangering direkt i vävnaden. Profilering av dessa förändringar som svar på stimuli eller behandlingar är av stor betydelse i olika aspekter av broskbiologi, och komplettera in vitro-experiment i isolerade kondrocyter, eller mer komplexa modeller i levande djur där experimentella tillstånd är svårare att kontrollera.
Brosk djur presentera en translationell och lättillgänglig metod för att bedöma vävnad remodeling i brosk ECM i kontrollerbara inställningar. Här beskriver vi ett protokoll för att isolera och odla levande nötkreatur brosk växter. Metoden använder vävnad från bovint knä, som är lättillgänglig från den lokala slakteri. Både djur och konditionerade odlingssubstrat kan analyseras för att undersöka vävnads omsättningen, ECM-sammansättningen och Chondrocyte-funktionen, och därmed profilera ECM-modulering.

Nötkreatur fulldjup djur isolerades, odlade och behandlades i 3 veckor (figur 1). Kultur mediet ändrades med tillägg av behandling 3 gånger per vecka. En gång i veckan mättes metabolisk aktivitet med resazurin-analysen. Biomarkörer för ECM-omsättningen mättes i supernatanten som skördats från kultur plattan 3 gånger per vecka. Explants delades upp i 4 grupper för behandling: 1) Onkostatin M och TNFα (O + T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) insulin som tillväxtfaktor-1 (IGF-1);...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Här presenterar vi ett protokoll som beskriver isolering och odling av brosk växter från nötkreatur knän. Denna metod ger ett enkelt och lättillgängligt verktyg för att beskriva vävnadsförändringar som svar på biologiska stimuli eller nya Therapeutics riktade mot leden.

En ex vivo vävnad kultur modell av brosk remodeling i nötkreatur knä Explants

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Broskimplantat representerar en translationell lättillgänglig metod för att förhöra vävnadsremodellering i broskmatrisen. Metoden kan ge tidig insikt i hur potentiella nya behandlingar påverkar ledstrukturen. Den största fördelen med denna teknik är att det brosket kvar i en infödd 3D-miljö, som möjliggör profilering av samspelet mellan celler och den omgivande matrisen med hjälp av biomarkörer.Principen i metoden är inte unik för brosk. Explants kan extraheras från andra vävnader såsom ett ägg, lever, och lunga och förhörs med hjälp av matrix härledda biomarkörer. Demonstrerar proceduren blir Amalie Engstrom, en grad student från vårt laboratorium.Utför hela vävnad sourcing processen utanför en laminär flöde huva i en aseptisk miljö. Från ett lokalt slakteri, skaffa en hel färsk tibialbens knäled från kalvar mellan 1,5 och två år. Sedan, mild dissekera kalven knä genom att först ta bort överflödigt kött, avslöja condyles, menisken, senor och synovial membran.Skär senor och synovialmembranet så att leden kan styckas. Ta bort menisken för att exponera femorala condyles. Använd en tre millimeters biopsistansare för att isolera explants från det bärande området på lårbenskondylarna och släpp dem från auricular yta genom att skära med en skalpell parallellt med och så nära det subkondrala benet som möjligt.Förvara och blanda omedelbart explanterna i DMEM F12 glutimax odlingsmedium som innehåller 1%penicillin och streptomycin i en 50 milliliter tub eller Petriskål. För att börja vävnadskultering, överför explantsna till en steril 96 brunnsplatta i en laminär flödeshuv som placerar alla replikat inom varje grupp diagonalt för att minimera variationen som framkallas genom avdunstning. Tillsätt PBS till de yttre brunnarna i odlingsplattan för att ytterligare undvika avdunstning av supernatanten.Sedan tvätta explants tre gånger i antingen odlingsmedium eller PBS. Odla explanterna i 200 mikroliter av odlingsmedium per brunn fram till början av experimentet i upp till 10 veckor i en inkubator vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Om du applicerar några behandlingar, förbered dessa till den önskade koncentrationen i explant brunnarna genom utspädning i odlingsmediet innan du byter medium.Ändra odlingsmediet varannan till var tredje dag i en laminär flödeshuva. Ta försiktigt bort supernatanten från varje brunn och överför den till en ny 96 brunnsplatta för förvaring. Omedelbart lägga 200 mikroliter av färsk odling medium eller behandling till varje brunn.Låt inte explanterna torka ut under mediets byte och se till att alla explants är helt nedsänkta i det nya mediet. Täta den nya plattan med tätningstejp och förvara den på minus 20 grader Celsius för biomarköranalys av vävnadsomsättning och proteinuttryck. För att påbörja ett resazurintest, gör en lösning av odlingsmedium som innehåller 10%resazurin.Skörda supernatanten som tidigare beskrivits och sänk ned explanterna i 10%resazurinlösningen vid 37 grader Celsius i tre timmar eller tills supernatanterna blir lila. Överför sedan den konditionerade och bakgrundsstyrnings-resazurinlösningen till en svart mikrotiterplatta och mäter fluorescensen vid en excitation av 540 nanometer och ett utsläpp av 590 nanometer. Efter detta, dränka explants i tvätt medium i fem till 10 minuter så att resazurin att helt diffusa ut och lägga till nya kultur medium eller behandlingar om de används.Fortsätt mäta den metaboliska aktiviteten en gång i veckan som ett indirekt mått på cellernas livsduglighet. I denna studie, nötkreatur fullt djup explants är isolerade, odlade och behandlade. Explants är indelade i fyra grupper för behandling, inklusive de som behandlats med Oncostatin M och tumör nekros faktor alfa, de som behandlats med Oncostatin M och tumör nekros faktor alfa med GM 6001, de som behandlats med insulin growth factor en, och en kontroll utan behandling.Den metaboliska aktiviteten är relativt stabil under de tre veckorna för alla fyra grupperna. Det fanns en tendens för IGF-1 att öka och O plus T grupper att minska jämfört med kontroll. O plus T appliceras sedan på odlingsväldarna tre gånger i veckan för att undersöka O plus T medierad brosknedbrytning.O plus T ses för att öka typ två kollagen nedbrytning från dag sju till 21 och aggrecan nedbrytning från dag tre till 14 jämfört med kontrollgruppen. Lägga GM 6001 i kombination med O plus T blockerar frisläppandet av O plus T medierad C2M, men bara har begränsad inverkan på AGN X1 med nivåer som liknar O plus T-grupp på dag 10. Insulin som tillväxtfaktor en appliceras tre gånger i veckan till nötkreatur fullt djup explants att undersöka hur anabola stimulering moduler brosket ECM omsättning.Effekten av IGF-1 på brosk explants observerades främst på mätningar av typ två kollagen bildning som förväntat för anabola stimuli. Vid behandling med IGF-1 minskar pro-C2-nivåerna mindre än de som observerats i kontrollgruppen, vilket indikerar att IGF-1 stimulerar typ två kollagenbildning från dag sju. Explants kan försämras med tiden och därmed noggrann pipettering är kritisk i all behandling och tvättsteg för att inte förlora eller förstöra explants i de olika stegen mediautbyte.Resultat som genereras med hjälp av denna modell bör inte stå ensam, men stödjas av data som genereras i mänsklig vävnad samt cellulära och i nyare modeller för att ytterligare validera resultaten. För att belysa den underliggande mekanismen i vävnaden och inte bara resultaten, är det möjligt att ytterligare analysera både vävnad och supernatanter med hjälp av andra molekylärbiologiska tekniker, såsom gen- och proteinuttrycksanalys, eller immunohistokemi, eller andra permanenta molekylärbiologiska tekniker.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex vivo Kultur av primära humana äggledaren epitelceller

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur Metod för embryonala Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Kultur av Mouse embryonala Hud-och Live-avbildning av Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur systemet studerar Thyroid Utveckling

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

C-FOS Protein Immunohistological Detection: ett användbart verktyg som en markör centralbanks involverade i specifika fysiologiska reaktioner<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; Ex vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Mätning av styvheten hos<em&gt; Ex vivo</em&gt; Mus Aorta Använda atomkraftsmikroskopi

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vävnadskultur modell av östrogen-producerande primära nötkreatur Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Vävnadskultur för bovinscancer

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

En Ex Vivo Choroid Sprouting Assay av okulär Microvascular Angiogenesis

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...