Name: an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants
Uploaded: 2019-11-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

Yazarlar, Laboratuvar desteği için Nordic Bioscience teknik personel teşekkür yanı sıra araştırma genel destek için Danimarka Araştırma Vakfı.

1. Doku izolasyonu
<ol><li>Doku kaynak<ol>
<li>Bir aseptik ortamda bir laminar akış başlık dışında tüm doku kaynak bölümü gerçekleştirin.</li>
		<li>Yerel mezbaha dan, 1.5 ve 2 yaş ları arasında buzağılardan bütün bir taze sığır tibiofemoral diz eklemi elde.</li>
		<li>Yavaşça ilk aşırı eti kaldırarak buzağı diz incelemek, konisileler ortaya, menisküs, tendin, ve sinovyal membran. Tendonu ve sinovyal membranı keserek eklemin parçalanmasına izin verin. Femoral kondiles ortaya çıkarma...

<ol>
	<li>Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+osteoarthritis:+the+good,+the+bad+and+the+promising.">Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).</li><li>Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targets,+models+and+challenges+in+osteoarthritis+research.">Targets, models and challenges in osteoarthritis research.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Articular+cartilage+from+osteoarthritis+patients+shows+extracellular+matrix+remodeling+over+the+course+of+treatment+with+sprifermin+(recombinant+human+fibroblast+growth+factor+18).">Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18).</a> Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+biomarkers:+ex+vivo+characterization+of+three+biomarkers+for+identification+of+inflammatory+osteoarthritis.">Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis.</a> Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).</li><li>Henriksen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+subtype+of+osteoclasts+secretes+factors+inducing+nodule+formation+by+osteoblasts.">A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts.</a> Bone. 51 (3), 353-361 (2012).</li><li>Gigout, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+enables+proliferation+of+chondrocytes+producing+a+hyaline+cartilage+matrix.">Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).</li><li>Reker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprifermin+(rhFGF18)+modulates+extracellular+matrix+turnover+in+cartilage+explants+ex+vivo.">Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).</li><li>Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).</li><li>Heineg&#229;rd, D., Saxne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+cartilage+matrix+in+osteoarthritis.">The role of the cartilage matrix in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis&#8211;+a+case+for+personalized+health+care?.">Osteoarthritis&#8211; a case for personalized health care?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).</li><li>Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+osteoarthritis+involves+bone,+cartilage+and+synovial+inflammation:+may+estrogen+be+a+magic+bullet?.">The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?.</a> Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).</li><li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis:+a+disease+of+the+joint+as+an+organ.">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li><li>Goldring, M. B., Goldring, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoarthritis.">Osteoarthritis.</a> Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).</li><li>Karsdal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coupling+of+bone+and+cartilage+turnover+in+osteoarthritis:+opportunities+for+bone+antiresorptives+and+anabolics+as+potential+treatments?.">The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).</li><li>Genovese, F., Karsdal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+fragments+as+diagnostic+and+prognostic+biomarkers+of+connective+tissue+diseases:+understanding+the+extracellular+matrix+message+and+implication+for+current+and+future+serological+biomarkers.">Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers.</a> Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).</li><li>Gudmann, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+turnover+reflected+by+metabolic+processing+of+type+II+collagen:+a+novel+marker+of+anabolic+function+in+chondrocytes.">Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).</li><li>Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unloading+results+in+rapid+loss+of+TGF&#946;+signaling+in+articular+cartilage:+role+of+loading-induced+TGF&#946;+signaling+in+maintenance+of+articular+chondrocyte+phenotype?.">Unloading results in rapid loss of TGF&#946; signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGF&#946; signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).</li><li>Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+biomarkers+and+ex+vivo+models+of+joint+tissues+as+a+tool+for+drug+development+in+rheumatoid+arthritis.">Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+MMP+activity+in+bovine+cartilage+explants+cultures+has+little+if+any+effect+on+the+release+of+aggrecanase-derived+aggrecan+fragments.">Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments.</a> BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).</li><li>Bay-Jensen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-linked+immunosorbent+assay+(ELISAs)+for+metalloproteinase+derived+type+II+collagen+neoepitope,+CIIM&#8212;Increased+serum+CIIM+in+subjects+with+severe+radiographic+osteoarthritis.">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM&#8212;Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis.</a> Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).</li><li>Lories, R. J., Luyten, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone-cartilage+unit+in+osteoarthritis.">The bone-cartilage unit in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).</li></ol>

Büyükbaş kıkırdak ekskatörlerinde kıkırdak doku cirosunun profilini çıkarmak için burada sunulan protokol, inflamatuar hücre içi yolların inhibitörleri, inhibitörleri de dahil olmak üzere birçok ilaç çeşidinin tedavi edici etkilerinin karakterize edilmesinde kullanılabilir. proteolitik enzimler veya anabolik büyüme faktörleri.
Bu protokolde iki farklı kurulum tanımlanmıştır: eksplalerin insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1) ile uyarıldığı anabolik bir ...

Kondrositler kıkırdak matrisini üretir ve korurlar. Kondrositlerin biyolojisini ve onların ve çevredeki ECM'nin dış uyaranlara nasıl tepki verdiğini incelemek için, onları yerelortam1,2'desorgulamak çok önemlidir. Kıkırdak doku cirosunun incelenmesi, şu anda tedaviyi değiştiren bir hastalık bulunmayan OA gibi eklem hastalıklarında altta yatan mekanizmaların anlaşılmasını sağlamak açısından önemlidir. Sonuç olarak, daha iyi çevirimodelleri2 için önemli bir ihtiyaç vardır.
Hücre ve doku etkilerinin ex vivo karakterizasyonu kondrosit monolayer kültürler gibi in vitro, ve in vivo, cerrahi kaynaklı OA modelleri veya otoimmün kollajen kaynaklı artrit modeli (CIA) gibi diğer preklinik modelleri tamamlamak için gereklidir ). Çok sayıda çalışma hücrelerin 2D monolayer kültürlerde ve 3D yapılarda veya kendi doğal doku3,4nasıl davranışlarını arasındaki farkları vurgulamıştır. 2D tabakalardaki birçok hücre, hücre polaritesi ve doku eki farklılıkları da dahil olmak üzere doğal olmayan morfolojileri benimseyerek, doğal dokulardaki hücrelerde hem görsel hem de fonksiyonel farklılıklara yol açar5. Farklılıklar da hücrelerin işlevselliği belirgindir, hangi protein ekspresyonu kayması olabilir, derinden değişmiş farklılaşma desenleri yol, düzenleyici makine, ve hücre işlevselliği5,6,7 ,8.
Kıkırdak ECM bir matris çerçeve sağlayan tip II kollajen esas oluşur, ve aggrecan, doku içinde sıvı tutmaya yardımcı olan bir proteoglikan. Kollajen tip IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronektin, kıkırdak oligomerik protein (COMP), biglycan, decorin ve perlecan gibi diğer matris molekülleri de mevcut9.
OA etiyolojisi belirsiz kalırken10,11, hastalığın başlangıcı doku ciro ve onarım süreçlerinde dengesizlikler neden olduğuna inanılmaktadır12,13. Eklem kıkırdağının bozulması OA'nın bir özelliğidir. Kıkırdak yerleşik kondrositler veya çevre dokularda hücreler sitokin salınımını artırmak, matris metalloproteinazlar gibi proteinlerin yüksek üretimini uyarıcı (MDP) ve aggrecanases, kıkırdak ECM bozulmasını artırmak 14. Bu bozulma, serum, idrar veya kültür ortamı15'teölçülebilen neo-epitoponlar adı verilen küçük benzersiz protein parçalarının salınımına neden olur. Kollajen oluşumu ve olgunlaşması üzerine, sözde profragments da serbest bırakılır; bu matris üretiminin bir ölçüsü olarak ölçülebilir16.
Bu protokolün amacı, stimülasyon ve/veya ilaç tedavisinin ECM doku cirosu üzerindeki etkisini karşılaştırmak için bir ex vivo kıkırdak modeli oluşturmaktır. Kıkırdak cirosu, elisa: AGNx1 (agrega aktivitesini yansıtan), C2M (matriks MMP aktivitesini yansıtan) ve ProC2 (tip II kollajeni yansıtan) kullanılarak doğrudan şartlı kültür ortamında matris kaynaklı neo-epitop biyobelirteçlerin ölçülmesiyle profillenir. oluşumu). Bulgular, ecm histolojik boyama ile doğrulanabilir, aynı zamanda bireysel ekstremite kondrosit organizasyonu görselleştirir. Açıklanan protokol kondrosit fonksiyonu ve kıkırdak ECM ciro üzerinde yeni tedavilerin etkisini test etmek için kullanılabilir. Bir dizi çalışmada, nicel histolojik veya immünhistokimyasal yaklaşımlar, mRNA, protein ekspresyonu veya proteomik ler kullanılarak biyolojik süreçleri veya müdahalenin sitokin-meydan lı ekstremiteler üzerindeki etkisini tanımlamak için kıkırdak eksplorleri kullanılmıştır2 ,17,18. Ancak, bu protokoller geçerli makalenin kapsamı dışındadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>45% Iron(III) chloride solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00056.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alamar Blue</td>
			<td>Life tech Invitrogen</td>
			<td>DAL1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy processing cassettes &#8211; green</td>
			<td>IHCWORLD</td>
			<td>BC-0109G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch W/Plunger (3 mm)</td>
			<td>Scandidat</td>
			<td>MTP-33-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine cartilage (Bovine knees)</td>
			<td>Local slaughterhouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2M</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass &#216; 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol &#8805;96%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83804.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute &#8805;99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83813.36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exAGNx1</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>exPRO-C2</td>
			<td>Nordic Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Fee for service</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution 4%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1004965000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM6001</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5939-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>30721-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGF-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3769-50UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oncostatin M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O9635-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (P/S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertex (mounting medium for light microscopy)</td>
			<td>HistoLab</td>
			<td>811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Standard Scalpels</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08327.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filtration &#34;rapid&#34;-Filtermax</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99955</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants

Ex vivo kültür sistemleri, doğal bir ortamda doku ve hücresel fonksiyon eğitimine adanmış çok çeşitli deneyleri kapsar. Kıkırdak sinovyal eklemin düzgün çalışması için önemli benzersiz bir dokudur ve proteoglikan ve tip II kollajen açısından zengin yoğun bir ekstrasellüler matriks (ECM) tarafından oluşturulmuştur. Kondrositler kıkırdak içinde bulunan tek hücre tipidir ve yaygın ve sayıları nispeten düşüktür. Değiştirilmiş dış uyaranlar ve hücresel sinyalizasyon ECM bileşiminde değişikliklere ve bozulmaya yol açabilir, osteoartrit gibi hastalıklarda önemli patolojik özellikleri olan (OA) ve romatoid artrit.
Ex vivo kıkırdak modelleri izin 1) kıkırdak doku ciro kondrosit aracılı değişiklikler profilleme, 2) kıkırdak ECM kompozisyongörselleştirme, ve 3) doku da doğrudan kondrosit rearrangement. Bu değişikliklerin uyaranlara veya tedavilere yanıt olarak profilleilmesi kıkırdak biyolojisinin çeşitli yönlerinde yüksek öneme sahiptir ve izole kondrositlerde in vitro deneyleri veya deneysel koşulların olduğu canlı hayvanlarda daha karmaşık modellerde in vitro deneyleri tamamlamaktadır. kontrol etmek daha zordur.
Kıkırdak eksperleri, kontrol edilebilir ortamlarda kıkırdak ECM doku remodeling değerlendirmek için bir çeviri ve kolay erişilebilir bir yöntem salar. Burada canlı büyükbaş kıkırdak ekskbitkileri izole etmek ve kültüre etmek için bir protokol uyguluyoruz. Yöntem kolayca yerel kasaplık erişilebilir sığır diz, doku kullanır. Doku cirosu, ECM bileşimi ve kondrosit fonksiyonunu araştırmak için hem ekskbitkiler hem de şartlı kültür ortamı analiz edilerek ECM modülasyonu profillenebilmiştir.

Büyükbaş tam derinlemesine eksüleler izole edildi, kültürlendi ve 3 hafta boyunca tedavi edildi(Şekil 1). Haftada 3 kez tedavinin eklenmesiyle kültür ortamı değiştirildi. Haftalık bir kez, metabolik aktivite resazurin tsay ile ölçüldü. ECM cirobiyobelirteçleri haftada 3 kez kültür plakasından hasat supernatant ölçüldü. Eksektifler tedavi için 4 gruba ayrılmıştır: 1) Onkostatin M ve TNFα (O+T); 2) O+T + GM6001 (GM6001); 3) Büyüme Faktörü-1 (IGF-1) gibi insü...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants at JoVE.com

An Ex Vivo Tissue Culture Model of Cartilage Remodeling in Bovine Knee Explants

Burada, büyükbaş dizleri kıkırdak eksültasyonunun izole edilmesi ve kültürlenmesini açıklayan bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, eklemi hedefleyen biyolojik uyaranlara veya yeni terapötiklere yanıt olarak doku değişikliklerini tanımlamak için kolay ve erişilebilir bir araç sağlar.

Sığır Diz Eksbitkilerinde Kıkırdak Remodeling Ex Vivo Doku Kültür Modeli

Ex vivo culture systems cover a broad range of experiments dedicated to studying tissue and cellular function in a native setting. Cartilage is a unique ...

Kıkırdak implantları, kıkırdak matrisinde doku remodeling sorgulamak için bir çeviri kolay erişilebilir yöntemi temsil eder. Bu yöntem, potansiyel yeni tedavilerin eklem yapısını nasıl etkilediğine dair erken bir fikir verebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kıkırdağın biyobelirteçler kullanarak hücreler ve çevredeki matris arasındaki etkileşimin profilini çıkarmasağlayan doğal bir 3B ortamda kalmasıdır.Yöntemdeki ilke kıkırdak için özel değildir. Ekseksörler yumurtalık, karaciğer ve akciğer gibi diğer dokulardan elde edilebilir ve matris kaynaklı biyobelirteçler kullanılarak sorgulanabilir. Prosedürü gösteren Amalie Engstrom, laboratuvarımızdan yüksek lisans öğrencisi olacak.Bir aseptik ortamda bir laminar akış başlık dışında tüm doku kaynak işlemi gerçekleştirin. Yerel bir mezbaha dan, 1.5 ve iki yaş arasında buzağılardan bütün bir taze sığır tibial femoral diz eklemi elde. Sonra, nazik ilk aşırı eti kaldırarak buzağı diz incelemek, konisileler ortaya, menisküs, tendonlar, ve sinovyal membran.Eklem parçalanmasına izin tendonu ve sinovyal membran kesin. Femoral kondiles ortaya çıkarmak için menisküs çıkarın. Femoral kondiles yük yatak alanından explants izole etmek ve mümkün olduğunca subkondral kemiğe paralel ve yakın bir neşter ile keserek auriküler yüzeyden serbest bırakmak için üç milimetrelik biyopsi zımba kullanın.Hemen saklamak ve 50 mililitrelik tüp veya Petri çanak% 1 penisilin ve streptomisin içeren DMEM F12 glutimax kültür orta ekspertiz karıştırın. Doku culturing başlamak için, buharlaşma tarafından indüklenen varyasyonen en aza indirmek için çapraz olarak her grup içinde tüm kopyaları yerleştirerek bir laminar akış kaputunda steril bir 96 iyi plaka eksplantlar aktarın. Supernatant buharlaşmasını önlemek için kültür plakasının dış kuyularına PBS ekleyin.Daha sonra, ya kültür orta veya PBS explants üç kez yıkayın. Kültür ekspertiz 200 mikrolitre kültür ortamı nın her kuyuda 10 hafta boyunca bir kuvözde %5 karbondioksit le 37 derece ye kadar devam eder. Herhangi bir tedavi uygularken, ortamı değiştirmeden önce kültür ortamında seyreltme ile eksplant kuyularında istenen konsantrasyona bunları hazırlayın.Bir laminar akış başlık her iki ila üç günde bir kültür ortamı değiştirin. Supernatant'ı her kuyudan yavaşça çıkarın ve depolama için yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın. Hemen her kuyuya 200 mikrolitre taze kültür ortamı veya tedavi ekleyin.Eksplants orta değişim sırasında kurumasını izin vermeyin ve tüm ekstentler tamamen yeni ortamda batırılmış olduğundan emin olun. Yeni plakayı sızdırmaz bantla kapatın ve doku cirosu ve protein ekspresyonunun biyomarker analizi için eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bir resazurin testine başlamak için% 10 resazurin içeren kültür ortamı bir çözüm yapmak.Hasat supernatant daha önce açıklandığı gibi ve 37 derece santigrat üç saat veya supernatants mor dönüşene kadar% 10 resazurin çözeltisi eksantileri batırın. Daha sonra, siyah bir mikrotiter plaka için klimalı ve arka plan kontrol resazurin çözeltisi aktarın ve 540 nanometre ve 590 nanometre bir emisyon bir uyarma floresan ölçmek. Bundan sonra, resazurin tamamen dağıtmak ve kullanılırsa yeni kültür orta veya tedaviler eklemek için izin vermek için 5 ila 10 dakika yıkama orta explants batırın.Hücre canlılığının dolaylı bir ölçümü olarak metabolik aktiviteyi haftada bir kez ölçmeye devam edin. Bu çalışmada, büyükbaş tam derinlik eksültarı izole edilmiş, kültürlü ve tedavi edilir. Ekspertİzler tedavi için dört gruba ayrılır, Oncostatin M ve tümör nekroz faktörü alfa ile tedavi olanlar dahil olmak üzere, Oncostatin M ve GM 6001 ile tümör nekroz faktör alfa ile tedavi olanlar, insülin büyüme faktörü bir ile tedavi olanlar, ve tedavi olmadan bir kontrol.Metabolik aktivite dört grup için üç hafta boyunca nispeten istikrarlıdır. IGF-1'in artma eğilimi, O artı T gruplarının ise kontrole göre azalması eğilimi vardı. O artı T daha sonra o artı T aracılı kıkırdak bozulması araştırmak için kültür kuyuları haftada üç kez uygulanır.O artı T'nin tip iki kollajen bozulmasını 7.günden 21'e, aggrecan bozulmasını ise kontrol grubuna göre 3'ten 14'e yükselttiğin görülmektedir. GM 6001'in O artı T blokları ile birlikte O artı T aracılı C2M'nin serbest bırakılması, ancak 10. Büyüme faktörü gibi insülin bir anabolik stimülasyon modülleri kıkırdak ECM ciro nasıl araştırmak için sığır tam derinlik eksültörler için haftada üç kez uygulanır.IGF-1'in kıkırdak ekspları üzerindeki etkisi anabolik uyaranlar için beklendiği gibi tip iki kollajen oluşumu ölçümleri üzerinde gözlenmiştir. IGF-1 ile tedavi edilirken, Pro-C2 düzeyleri kontrol grubunda gözlenenlerden daha az azalır, IGF-1'in yedinci günden itibaren tip iki kollajen oluşumunu uyardığını gösterir. Ekspektörler zamanla bozulabilir ve bu nedenle farklı ortam değişim adımlarında eksültörleri kaybetmemek veya yok etmemek için tüm tedavi ve yıkama adımlarında dikkatli pipetleme çok önemlidir.Bu model kullanılarak oluşturulan sonuçlar tek başına olmamalı, ancak bulguları daha da doğrulamak için insan dokusunun yanı sıra hücresel ve yeni modellerde üretilen verilerle desteklenmelidir. Dokuda altta yatan mekanizmaya ışık tutmak için ve sadece sonuçları değil, gen ve protein ekspresyonu analizi, immünohistokimya veya diğer kalıcı moleküler biyoloji teknikleri gibi diğer moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak hem doku hem de süpernatants analiz etmek mümkündür.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Yeni Bir<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Fare Kalp için&gt; Kültür Yöntemi

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

c-FOS Protein Immünohistolojik Algılama: Belirli Fizyolojik Yanıtları ilgilendim Merkez Pathways bir Marker Olarak Faydalı Aracı<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Sığır Yumurtalık Korteks Doku Kültürü

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Oküler Mikrovasküler Anjiyogenezin Ex Vivo Koroid Filizlenme Satomu

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...