Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

نشكر عضو معهد أبحاث الترجمة المتقدمة للسرطان على تعليقاته المدروسة وتحريره على مساعدتهم في تحرير اللغة الإنجليزية. وقد دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة: 16K09590 إلى T.Y.).

1. إنشاء ثلاثة خطوط خلية مستقلة مقاومة للأفاتينيب PC-9
<ol><li>تحديد التركيز الأولي للتعرض للأفاتينيب لخلايا PC-9 باستخدام الفحص 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
	<ol>
<li>ثقافة خلايا PC-9 في وسط النمو تحتوي على مصل البقر الجنيني (10٪)، البنسلين (100 U/mL)، والعقدية (100 ميكروغرام / مل) في خلية الثقافة عل...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

هنا، وصفنا طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب وتميزت هذه الخلايا بالمقارنة مع الخلايا الأبوية PC-9. من خلال التعرض لتصعيد الجرعة التدريجية، اكتسبت خلايا PC-9 الأبوية مقاومة لafatinib على مدى فترة 10-12 شهرا. سريريا، آليات المقاومة لEGFR TKIs غير متجانسة، وبالتالي، بعد العلاج ا...

خمسة مثبطات كيناز التيروزين, استهداف مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR), بما في ذلك gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, وosimertinib متاحة حاليا لعلاج المرضى الذين يعانون من الطفرة EGFR إيجابية الرئة غير الصغيرة الخلية السرطان (NSCLC). على مدى العقد الماضي، شهدت العلاجات لهؤلاء المرضى تطورا كبيرا مع اكتشاف إمكانات جديدة EGFR-TKIs. بين المرضى الذين يعانون من سرطان الغدة الدرقية في الرئة، يتم تحديد الطفرات الجسدية في EGFR في ما يقرب من 50٪ من الآسيويين و 15٪ من المرضى القوقازيين1. الطفرات الأكثر شيوعا في EGFR هي طفرة نقطة L858R في EGFR exon 21 و 15 زوج قاعدة (BP) الحذف في EGFR exon 192. في المرضى الإيجابية الطفرة EGFR مع NSCLC، EGFR-TKIs تحسين معدلات الاستجابة والنتائج السريرية مقارنة مع المعيار السابق للعلاج الكيميائي البلاتين doublet3.
وكان جيفيتينيب وإرلوتينيب أول مثبطات جزيء صغيرة معتمدة ويشار إليها عموما ً باسم الجيل الأول من المعارف التقليدية غير التقليدية. هذه EGFR TKIs كتلة نشاط كيناز التيروزين من خلال التنافس مع ATP وملزمة عكسها لمواقع الربط ATP4. Afatinib هو الجيل الثاني من EGFR TKI التي ترتبط بشكل لا رجعة فيه وبشكل مشترك إلى مجال كيناز التيروزين من EGFR ويتميز بأنه مثبط الأسرة EGFR عموم الإنسان5.
على الرغم من الفائدة الكبيرة من هذه العلاجات في المرضى الذين يعانون من NSCLC، اكتسبت مقاومة أمر لا مفر منه. آلية المقاومة الأكثر شيوعا ضد الجيل الأول والثاني EGFR TKIs هو ظهور طفرة T790M في EGFR exon 20، وهوموجود في 50-70٪ من عينات الورم 6،7،8. وتشمل آليات المقاومة الأخرى إشارات الالتفافية (إلى MET، IGF1R، وHER2)، والتحول إلى سرطان الرئة الخلية الصغيرة، وتحريض الانتقال الظهاري إلى mesenchymal، والتي تحدث قبل سريريا وسريريا9. إن آليات المقاومة للمعارف التقليدية في إطار القانون الدولي غير متجانسة. من خلال تحديد آليات المقاومة الجديدة في الدراسات ما قبل السريرية، قد يكون من الممكن تطوير علاجات جديدة للتغلب على المقاومة. يجب أن تراعي علاجات التسلسل الأمثل التي تحقق أقصى قدر من الفائدة السريرية للمرضى آليات المقاومة والهدف العلاجي.
لا بد من اختيار خط الخلية الأبوية الصحيح، كما هو أساس جميع التجارب اللاحقة. تبدأ استراتيجيات الاختيار بالأهمية السريرية؛ من الضروري اختيار خط الخلايا السذاجة العلاج الكيميائي والإشعاعي. قد يؤدي العلاج الكيميائي و/أو الإشعاعي السابق إلى تغيير مسارات المقاومة وتغييرات التعبير عن علامات مقاومة الأدوية. في هذه الدراسة، يتم استخدام خلايا PC-9، التي تحمل 15 نقطة أساس الحذف في EGFR exon 19، لإنشاء مقاومة المكتسبة لafatinib. تم اشتقاق هذا الخط الخلوي من مريض ياباني من NSCLC، الذي لم يتلق العلاج الكيميائي والإشعاعي المسبق.
لأن afatinib تدار شفويا على أساس يومي، والعلاج المستمر في المختبر، حيث يتم زراعة الخلايا باستمرار في وجود afatinib ستكون ذات الصلة سريريا. يجب تحسين جرعة الأدوية المستخدمة في مختلف خطوات التجربة لخط الخلية الأبوية المختارة. ويمكن استخدام فحص السمية الخلوية لتحديد مجموعة مناسبة من المخدرات، والتي ينبغي أن تكون قابلة للمقارنة مع المعلومات الدوائية للدواء.
وطوال عملية الاختيار، يتم الاحتفاظ بمجموع عدد الخلايا كمجموعة واحدة؛ لا يتم استخدام الاستنساخ أو أساليب الفصل الأخرى. تتعرض الخلايا أولا باستمرار إلى مستوى منخفض من المخدرات. في وقت لاحق ، بعد أن تتكيف الخلايا لتنمو في وجود الدواء ، يتم زيادة جرعة الدواء ببطء إلى الجرعة المثلى النهائية من الدواء10،11. بدلا من ذلك، يمكن استخدام نبض إدارة المخدرات أو الطفرات لاختيار خلايا المقاومة، والتي يتم تنفيذها أيضا قبل العلاج من المخدرات 12،13. ولسوء الحظ، لا يتم الإبلاغ عموما عن الحالات التي تفشل فيها مقاومة المخدرات في التطور. يتم تطوير استراتيجيات الاختيار بهدف محاولة تقليد ظروف مرضى السرطان لإعادة بناء المقاومة ذات الصلة سريريا. في بعض الأحيان ، لتحديد التغيرات الجزيئية المرتبطة بآليات مقاومة المخدرات ، يتم استخدام تركيز عالي للأدوية. يصبح هذا النموذج أقل أهمية سريريا.
هنا، ونحن نصف طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب من خلايا PC-9 التي تحتوي على 15 نقطة في الثانية حذف في EGFR exon 19، فضلا عن التوصيف الأولي لخطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

المقاومة المكتسبة لمثبطات الهدف الجزيئي هي مشكلة خطيرة في علاج السرطان. ولا يزال سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في معظم البلدان. اكتشاف "طفرات السائق الأنسيجينية"، مثل مستقبلات عاملنمو البشرة (EGFR) - تنشيط الطفرات، والتطور اللاحق للعوامل المستهدفة الجزيئية من مثبطات كيناز التيروزين EGFR (TKIs) (gefitinib، erlotinib، afatinib, dacomitinib, وosimertinib) قد غيرت بشكل كبير علاج سرطان الرئة في العقود الأخيرة. ومع ذلك، لا تزال هذه الأدوية غير فعالة في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) تحمل EGFR-تفعيل الطفرات. بعد المقاومة المكتسبة، لا يزال التقدم المنهجي لNSCLC عقبة كبيرة في علاج المرضى الذين يعانون من الطفرة الإيجابية EGFR NSCLC. هنا، نقدم طريقة تصعيد الجرعة التدريجية لإنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقلة مقاومة للأفاتينيب المكتسبة من خلايا NSCLC PC-9 التي تأوي طفرات EGFR-تفعيل من 15 قاعدة حذف الزوج في EGFR exon 19. يتم عرض طرق لتوصيف خطوط الخلايا الثلاثة المستقلة المقاومة للعفاتينيب لفترة وجيزة. إن آليات المقاومة المكتسبة للمعارف التقليدية في إطار الـ EGFR غير متجانسة. ولذلك، يجب فحص خطوط الخلايا المتعددة التي لها مقاومة مكتسبة للمعارف التقليدية في مصر. هناك حاجة إلى عشرة إلى اثني عشر شهرا للحصول على خطوط الخلايا مع المقاومة المكتسبة باستخدام هذا النهج تصعيد الجرعة stepwise. وسيسهم اكتشاف آليات جديدة للمقاومة المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية أكثر فعالية وأمانا.

يظهر في الشكل 1مخطط إنشاء ثلاثة خطوط خلايا مقاومة للأفاتينيب من خلايا PC-9 باستخدام إجراء تصعيد الجرعة التدريجية . ويبين الشكل 2 انخفاضاً في انتشار الخلايا في خلايا PC-9 الأبوية مع زيادة تركيز الأفاتينيب، مما يشير إلى أن خلايا PC-9 حساسة للتعرض ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

إنشاء وتوصيف ثلاثة خطوط الخلايا المضادة للأدينوسرطان الرئة مقاومة للأفاتينب PC-9 مع جرعات متزايدة من Afatinib

تم تطوير طريقة لإنشاء خطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب من خلايا سرطان الغدة الرئوية PC-9، وتميزت الخلايا المقاومة. يمكن استخدام الخلايا المقاومة للتحقيق في مستقبلات عامل النمو البشرة التيروزين كيناز آليات مقاومة مثبطات، تنطبق على المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

وستسهم دراسة آليات المقاومة المكتسبة الجديدة في تطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية وأماناً في المرضى الذين يعانون من السرطان المقاوم لعامل السرطان والسرطان القابل للاستئصال. ولسوء الحظ، لا يتم الإبلاغ عموما عن الحالات التي فشلت فيها مقاومة للأدوية. ويعتبر هذا الأسلوب تصعيد الجرعة خطوة الأسلوب الأكثر موثوقية للحصول على خلايا المقاومة المكتسبة.لتحديد التركيز المناسب afatinib المقاومة، والخلايا PC-9 الثقافة في متوسطة النمو في طبق 10 سم خلية المعالجة ثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. Resuspend خلايا PC-9 في أربع مرات-10-إلى-4 خلايا لكل ملليلتر من النمو التركيز المتوسط, ومقعد الخلايا في 50 ميكرولترات من تعليق الخلية في بئر في 96-جيدا microplate. بعد حضانة بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية ، وعلاج الخلايا مع 50 ميكرولترات من محلول afatinib في البئر ، في ستة تكرارات من التركيزات المشار إليها ، وبعد حضانة 96 ساعة في حاضنة ثقافة القتل ، إضافة 15 ميكرولترات من صبغة MTT إلى كل بئر.بعد أربع ساعات في حاضنة ثقافة الخلية، إضافة 100 ميكرولترات من solubilization / وقف حل لكل بئر، والعودة لوحة إلى الحاضنة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قياس الكثافة البصرية في 570 نانومتر على قارئ microplate. للتعرض المستمر afatinib، ثقافة PC-9 الخلايا في أطباق P-100 تحتوي على 10 ملليلتر من متوسط النمو حتى الخلايا تصل إلى عدم التوافق.نقل الثقافات دون التوافق في ثلاثة أطباق P-100 جديدة من تسعة ملليلتر من متوسط النمو لكل طبق ثقافة أولية، وإعادة الخلايا إلى حاضنة ثقافة الخلية. في صباح اليوم التالي، إضافة 0.1 نانوموللار، أو 1/10 من تركيز مثبط نصف القصوى من afatinib، إلى كل مجموعة من ثلاثة أطباق الثقافة. عندما تصبح الخلايا المعالجة بالخلايا غير ذاتية الفلورة، استخدم ماصة من ملليلتر واحدة لخلط الثقافات تمامًا، ونقل ملليلتر واحد من الخلايا من كل طبق إلى تسعة ملليلترات من متوسط النمو الطازج في أطباق P-100 الجديدة.إضافة 10٪ إلى 20٪ أعلى تركيزات من afatinib إلى الثقافات الجديدة، وزيادة تركيز afatinib عن طريق تصعيد الجرعة خطوة في كل مرة الثقافات تصل إلى دون الثقاة على مدى فترة 10-12 شهرا. عندما يتم الوصول إلى تركيز afatinib من ميكرومولار واحد، وإجراء اختبار MTT كما ثبت للتأكد من أن الخلايا قد وضعت afatinib-المقاومة. لتحديد منحنى النمو لخطوط الخلية، ثقافة الأم PC-9 وثلاثة خطوط الخلايا مقاومة afatinib في متوسط النمو في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة.Resuspend الخلايا من كل ثقافة في خمس مرات 10-إلى الثلث الخلايا لكل ملليلتر من النمو التركيز المتوسط, والمقعد 12 100 ميكرولتر يكرر من كل مجموعة الخلايا في بئر في 96 جيدا microplate. ثم قم بإجراء اختبار MTT في الأيام صفر، واحد، اثنين، ثلاثة، خمسة، وسبعة من الثقافة كما هو موضح، ومؤامرة النتائج باستخدام برنامج تحليل إحصائي مناسب. لتحديد التعديلات في مستقبلات عامل النمو البشرة، أو تعبير الحمض النووي الجينومي EGFR، عن طريق عكس تحليل سلسلة البوليميراز transcriptase، عزل الحمض النووي الجينومي من ثقافة الخلية ذات الاهتمام باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.قياس تركيز تركيز 25 نانوغرام ميكرولتر من الحمض النووي الجينوم معزولة على مقياس الطيف. ثم تضخيم 50 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي باستخدام مزيج سيد أخضر SYBR، وتحليل النتائج باستخدام نظام اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على الفلورسينس. لتحديد التعديلات في تعبير الحمض النووي الجينومي EGFR عن طريق التسلسل، تضخيم الحمض النووي الجينوم باستخدام التمهيديات محددة لEGFR exons 19 إلى 21.ثم تنقية منتجات PCR تضخيم باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، وتسلسل amplicons. لتحديد التعديلات في البشرة عامل النمو مستقبلات البروتين التعبير عن طريق تحليل البقعة الغربية، علاج الخلايا مع afatinib لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، وغسل الثقافات الخلية مرتين مع خمسة ملليلتر من الجليد البارد PBS لكل ثقافة في غسل.Lyse الخلايا في العازلة فحص المناعة الشعاعية، تستكمل مع 1٪ protease المانع كوكتيل ومثبطات الفوسفاتاز كوكتيل اثنين وثلاثة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وجمع lysates عن طريق الطرد المركزي. استخدام مقايسة حمض bicinchoninic لتحديد تركيز البروتين من عينات lysate.ضبط عينات البروتين إلى 0.5، أو ميكروغرام واحد لكل تركيزات ميكرولتر، في 4-X عينة العازلة، ويغلي العينات في 96 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتحليل لطخة الغربية من العينات، وتجميع الألواح الزجاجية تنظيف الإيثانول والفواصل، وتحميل القالب مع هلام بوليكريلاميد 8٪ مع المكملات التجريبية المناسبة. في حين أن هلام هو البلمرة، إضافة محلول هلام التراص إلى قالب مناسب، إدراج المشط، والسماح للجل التراص البلمرة لمدة 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.عندما يكون كل من المواد الهلامية بالمبلمرة، ووضعها في الجهاز الكهربائي وملء خزان مع تشغيل العازلة. ثم قم بتحميل حجم واحد من 20 إلى 30 ميكرولتر لكل عينة بروتين في كل بئر ، وتشغيل الجل بسرعة 180 فولت. وقف الكهرباء بعد حوالي 60 دقيقة، مرة واحدة في الجبهة صبغ يتدفق من هلام، وغسل هلام مع محلول ملحي tris المخزنة، وتستكمل مع توين، لمدة دقيقة إلى دقيقتين.نقل البروتينات على غشاء فلوريد بولي فينيلايدين عن طريق النشاف شبه الجافة لمدة ساعة واحدة و 1/2 في تيار ثابت من 300 مللي amp. كتلة الغشاء مع 5٪ الحليب الجاف غير الدهنية المخفف مع محلول ملحي tris-buffered بالإضافة إلى محلول توين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، تحقق في الغشاء مع الأجسام المضادة المناسبة ذات الاهتمام عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.في صباح اليوم التالي، اغسل الأغشية بثلاثة غسلات لمدة 10 دقائق من محلول ملحي جديد مخزن بالتريز في كل غسل قبل تعريض الغشاء للأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة ساعة إلى واحدة وساعة ونصف في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الغشاء خمس مرات مع الملح الطازج tris المخزنة في غسل وفضح الغشاء إلى حل chemiluminescence المحسنة لتصور إشارة باستخدام الأفلام. هنا، يتضح الانخفاض الملاحظ في انتشار الخلايا من الخلايا PC-9 الأبوية استجابة لتركيزات متزايدة من afatinib، مما يؤكد أن خلايا PC-9 حساسة للتعرض afatinib.ومع ذلك، لا يظهر أي من خطوط الخلايا الثلاثة المقاومة لـ afatinib قمع انتشار الخلايا تحت التعرض لـ afatinib. خطوط الخلايا المقاومة لـ Afatinib تعرض منحنيات نمو أبطأ بكثير من خلايا PC-9 الأبوية. الخلايا المقاومة لـ Afatinib تعبر عن مستويات أعلى بكثير من الحمض النووي الجينومي EGFR وتعبير بروتين EGFR من الخلايا PC-9 الأبوية.تسلسل EGFR يوضح أن PC-9 خلايا معرض 15 حذف زوج قاعدة في EGFR exon 19، والبرية نوع EGFR في exon 20. Afatinib مقاومة واحد واثنين من الخلايا الخلية الخلية الخلايا، ومع ذلك، يحمل تضخيم من نوع البرية EGFR exon 19. Afatinib مقاومة الخلية خط ثلاث خلايا تحتوي على نفس 15 حذف زوج قاعدة في EXON EGFR 19 كما هو الحال في خلايا PC-9، ولكن لوحظ طفرة نقطة في T790M في EXON EGFR 20.نمو الخلايا يمكن أن تصبح بطيئة جدا عندما يكون تركيز المانع قريبة من IC-50 قيمة. لا تناقش الثقافة، حيث أن الخلية ستستمر في الانتشار تدريجياً. وقد تم تطوير هذه الاستراتيجيات لمحاكاة الظروف التي يتطور فيها مرضى السرطان مقاومة ذات صلة سريريا لتقييم آليات المقاومة المكتسبة ووضع استراتيجيات علاجية آمنة وفعالة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

إنشاء المقاومة المزدوج EGFR TKI واجتمع TKI في الرئة غدية الخلايا في المختبر بإجراء الخطوة 2-تصعيد للجرعة

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

الحساسية الإشعاعية للخلايا الجذعية السرطانية في خطوط خلايا سرطان الرئة

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

العزلة وتوصيف المرضي المستمدة من البنكرياس اقنيه الغدد السرطانية الأورام العضوية

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

تحليل السكان الجانبية في خطوط الخلايا السرطانية الصلبة

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

الزراعة الفرعية والحفظ بالتبريد للسرطان الغدي المريئي العضوي: إيجابيات وسلبيات لهضم الخلية الواحدة

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...