Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Vi takker medlemmet af Advanced Cancer translationelle Research Institute for deres tankevækkende kommentarer og Editage for deres hjælp med engelsk sprog redigering. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (tilskudsnummer: 16K09590 til T.Y.).

1. etablering af tre uafhængige Afatinib-resistente PC-9 cellelinjer
<ol><li>Bestemmelse af den initiale eksponeringskoncentration afatinib for PC-9-celler ved hjælp af 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-analyse
	<ol>
<li>Kultur PC-9 celler i vækstmedium indeholdende føtal kvægserum (10%), penicillin (100 U/mL), og streptomycin (100 μg/mL) i en celle-kultur behandlet 10 cm parabol i en 5% CO2 inkubator ved 37 °c.</li>
		<li>Resuspendere PC-9 celler ved 4 ...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Her beskrev vi en metode til etablering af tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer og karakteriserede disse celler i forhold til forældre-PC-9-celler. Ved trinvise dosiseskalerende eksponering erhvervede de forældre baserede PC-9-celler resistens over for afatinib i en periode på 10-12 måneder. Klinisk, resistensmekanismerne til EGFR TKIs er heterogene, og derfor, efter den indledende behandling med afatinib, PC-9 celler blev opdelt i tre uafhængige P100 retter og eksponeret yderligere for afatinib. I først...

Fem tyrosinkinasehæmmere, der er rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), herunder Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib, er i øjeblikket tilgængelige til behandling af patienter med EGFR-mutation-positiv ikke-småcellet lunge kræft (NSCLC). I løbet af det seneste årti har terapier for sådanne patienter gennemgået en dramatisk udvikling med opdagelsen af nye potentielle EGFR-TKIs. Blandt patienter med lungeadenokarcinom er somatiske mutationer i EGFR identificeret hos ca. 50% af de asiatiske og 15% af de kaukasiske patienter1. De mest almindeligt forekommende mutationer i EGFR er en L858R point mutation i EGFR exon 21 og 15 base pair (BP) sletninger i EGFR exon 192. Hos EGFR-mutation-positive patienter med NSCLC forbedrer EGFR-TKIs responsraterne og de kliniske resultater sammenlignet med den tidligere platin-dobbelt-Doublet-kemoterapi3.
Gefitinib og erlotinib var de første godkendte små molekyle inhibitorer og omtales almindeligvis som første generations-EGFR-TKIs. Disse EGFR TKIs blokere tyrosinkinase aktivitet ved at konkurrere med ATP og reversibelt binding til ATP bindingssteder4. Afatinib er en anden generation af EGFR TKI, som uigenkaldeligt og kovalent binder sig til EGFR 's tyrosinkinase-domæne og er karakteriseret som en pan-menneskelig EGFR-familie hæmmer5.
På trods af den dramatiske fordel af disse terapier hos patienter med NSCLC, erhvervet resistens er uundgåelig. Den mest almindeligt modstands mekanisme mod første-og andengenerations EGFR tkis er fremkomsten af T790M-mutationen i EGFR exon 20, som er til stede i 50-70% af tumor prøverne6,7,8. Andre resistensmekanismer omfatter bypass-signaler (til at opfylde, IGF1R, og HER2), omdannelse til småcellet lungekræft, og induktion af epitel-til-mesenchymal overgang, som forekommer præklinisk og klinisk9. Resistensmekanismerne til EGFR TKIs er heterogene. Ved at identificere nye resistensmekanismer i prækliniske undersøgelser, det kan være muligt at udvikle nye Therapeutics at overvinde resistens. Optimale sekvens terapier, der maksimerer den kliniske fordel for patienter skal overveje resistensmekanismer og terapeutiske mål.
Det er bydende nødvendigt at vælge den rigtige forældre cellelinje, da det er grundlaget for alle de efterfølgende eksperimenter. Udvælgelses strategierne begynder med klinisk relevans; Det er nødvendigt at vælge en kemoterapi og stråling naive cellelinje. Tidligere kemoterapeutisk og/eller strålebehandling kan medføre ændring af resistens veje og ændringer i ekspression af resistensmarkører. I denne undersøgelse anvendes PC-9-celler, der transporterer 15 BP-sletninger i EGFR exon 19, til etablering af erhvervet resistens over for afatinib. Denne cellelinje blev afledt af en japansk NSCLC patient, der ikke fik tidligere kemoterapi og stråling.
Da afatinib administreres oralt på daglig basis, vil kontinuerlig in vitro-behandling, hvor cellerne konstant dyrkes i nærværelse af afatinib, være klinisk relevante. Den dosis af lægemidler, der anvendes i de forskellige trin af eksperimentet, skal optimeres for den valgte forældre cellelinje. En cytotoksicitet analyse kan anvendes til bestemmelse af et egnet stof område, som bør være sammenlignelig med de farmakokinetiske oplysninger af lægemidlet.
Under hele udvælgelsesprocessen opretholdes hele populationen af celler som en enkelt gruppe. kloning eller andre separations metoder anvendes ikke. Cellerne er først kontinuerligt udsat for et lavt niveau af lægemidlet. Efterfølgende, når cellerne tilpasse sig til at vokse i nærværelse af stoffet, dosis af lægemidlet er langsomt steget til den endelige optimale dosis af lægemidlet10,11. Alternativt kan en puls Drug-Administration eller mutagenese anvendes til udvælgelse af resistens celler, som også udføres før behandling med lægemidler 12,13. Desværre er tilfælde, hvor lægemiddelresistens ikke udvikler, generelt ikke indberettet. Udvælgelses strategierne er udviklet med det formål at forsøge at efterligne betingelserne for kræftpatienter til genopbygning af klinisk relevant resistens. Nogle gange, for at identificere molekylære ændringer i forbindelse med mekanismer af lægemiddelresistens, en høj stof koncentration anvendes. Denne model bliver mindre klinisk relevant.
Her beskriver vi en metode til at etablere tre uafhængige afatinib-resistente cellelinjer fra PC-9-celler, der harkedeligt 15 BP-sletninger i EGFR exon 19 samt den indledende karakterisering af de afatinib-resistente cellelinjer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

Erhvervet resistens over for molekylære målhæmmere er et alvorligt problem i kræftbehandling. Lungekræft er fortsat den hyppigste årsag til kræft relateret død i de fleste lande. Opdagelsen af "oncogenic driver mutationer", såsom epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)-aktiverende mutationer, og efterfølgende udvikling af molekylære målrettede agenter af EGFR Tyrosinkinasehæmmere (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib og osimertinib) har i de seneste årtier dramatisk ændret lungekræft behandling. Men, disse lægemidler er stadig ikke effektiv hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) transporterer EGFR-aktiverende mutationer. Efter erhvervet resistens er den systemiske progression af NSCLC fortsat en væsentlig hindring for behandling af patienter med EGFR-mutation-positiv NSCLC. Her præsenterer vi en trinvis dosisoptrapning metode til etablering af tre uafhængige erhvervede afatinib-resistente cellelinjer fra NSCLC PC-9 celler husly EGFR-aktiverende mutationer af 15-base par sletninger i EGFR exon 19. Metoder til karakterisering af de tre uafhængige afatinib-resistens cellelinjer præsenteres kortvarigt. De erhvervede resistensmekanismer til EGFR TKIs er heterogene. Derfor skal flere cellelinjer med erhvervet resistens over for EGFR-TKIs undersøges. Ti til tolv måneder er forpligtet til at opnå cellelinjer med erhvervet resistens ved hjælp af denne trinvise dosisoptrapning tilgang. Opdagelsen af nye erhvervede resistensmekanismer vil bidrage til udviklingen af mere effektive og sikre terapeutiske strategier.

Skemaet til oprettelse af tre afatinib-modstands cellelinjer fra PC-9-celler ved hjælp af en trinvis dosis eskaleringsprocedure er vist i figur 1. Figur 2 viser et fald i celle spredningen i forældrenes PC-9-celler, da koncentrationen af afatinib øges, hvilket indikerer, at PC-9-celler er følsomme over for afatinib-eksponeringen. Figur 3 viser afatinibresistens for de tre cellelinjer. Ingen af de...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering og karakterisering af tre Afatinib-resistente lunge adenokarcinom PC-9 cellelinjer udviklet med stigende doser Afatinib

En metode til at etablere afatinib-resistens cellelinjer fra lunge adenokarcinom PC-9 celler blev udviklet, og resistente celler blev karakteriseret. De resistente celler kan bruges til at undersøge epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinase hæmmer-resistensmekanismer, der gælder for patienter med ikke-småcellet lungekræft.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Studiet af nye erhvervede resistensmekanismer vil bidrage til udviklingen af mere effektive og sikre terapeutiske strategier hos patienter med kræftagentresistent og resectable kræft. Desværre, tilfælde, hvor resistens mod medicin undladt at udvikle er generelt ikke rapporteret. Denne trinvise dosiseskaleringsmetode betragtes som den mest pålidelige teknik til opnåelse af erhvervede resistensceller.For at bestemme den passende afatinib-resistens koncentration, kultur PC-9 celler i vækstmedium i en 10-centimeter celle kultur-behandlet fad ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Resuspend pc-9 celler på en fire gange-10-til-de-fire celler pr milliliter vækst medium koncentration, og sæde cellerne på 50 mikroliter af celle suspension per brønd i en 96-godt mikroplade. Efter en overnight inkubation i cellekultur inkubatoren, behandle cellerne med 50 mikroliter af afatinib opløsning pr brønd, på seks replikater af de angivne koncentrationer, og efter en 96-timers inkubation i cull kultur inkubator, tilføje 15 mikroliter af MTT farvestof til hver brønd.Efter fire timer i cellekulturinkubatoren tilsættes 100 mikroliter opløselse/stopopløsning til hver brønd, og pladen returneres til rugemaskinen natten over. Næste morgen måles den optiske tæthed ved 570 nanometer på en mikropladelæser. Ved kontinuerlig afatinib eksponering skal pc-9-cellerne dyrkes i P-100-retter, der indeholder 10 milliliter vækstmedium, indtil cellerne når subconfluency.Overfør de subkontingente kulturer i tre nye P-100 retter med ni milliliter vækstmedium pr. indledende kulturskål, og vend cellerne tilbage til cellekulturkubvøsen. Den næste morgen, tilsættes 0,1 nanomolar, eller 1/10 af den halvmaksimale hæmmende koncentration af afatinib, til hvert sæt af tre kulturretter. Når de afatinib-behandlede celler bliver underforbrug, skal du bruge en en-milliliter pipette til grundigt at blande kulturerne, og overføre en milliliter celler fra hver skål til ni milliliter frisk vækstmedium i nye P-100 retter.Tilsæt 10% til 20% højere koncentrationer af afatinib til de nye kulturer, øge afatinib koncentration ved trinvis dosis eskalering hver gang kulturerne nå subconfluency over en 10-til 12-måneders periode. Når en afatinib koncentration af en mikromolar er nået, udføreS MTT-analysen som påvist for at bekræfte, at cellerne har udviklet afatinib-resistens. For at bestemme vækstkurven for cellelinjerne, kultur forældre PC-9 og de tre afatinib-resistente cellelinjer i vækstmedium i cellekultur inkubatoren i 24 timer.Resuspend cellerne fra hver kultur på en fem gange-10-til-den-tredje celler pr milliliter vækst medium koncentration, og sæde 12 100-mikroliter replikerer af hver cellepopulation pr brønd i en 96-godt mikroplade. Derefter udføre MTT assay på dage nul, en, to, tre, fem og syv af kultur som påvist, og plotte resultaterne ved hjælp af en passende statistisk analyse software program. At identificere ændringer i epidermal vækstfaktor receptor, eller EGFR genomisk DNA udtryk, ved omvendt transskriptionase polymerase kæde analyse, isolere genomisk DNA fra cellekultur af interesse ved hjælp af en DNA rensning kit i henhold til producentens anvisninger.Koncentrationen af 25-nanogram-mikroliterkoncentrationer af det isolerede genomiske DNA måles på et spektrofotometer. Derefter forstærke 50 nanogram genomisk DNA ved hjælp af en SYBR grøn master mix, og analysere resultaterne ved hjælp af en fluorescens-baserede omvendt transskription polymerase kædereaktion detektionssystem. For at identificere ændringer i EGFR-genomisk DNA-udtryk ved sekventering skal det genomiske DNA ved hjælp af specifikke primere for EGFR exons 19 til 21 forstærkes.Derefter rense de forstærkede PCR produkter ved hjælp af en PCR rensning kit i henhold til producentens anvisninger, og sekvens amplicons. For at identificere ændringer i epidermal vækstfaktor receptor protein udtryk ved vestlige blot analyse, behandle cellerne med afatinib i 24 timer. Efter 24 timer vaskes cellekulturerne to gange med fem milliliter iskold PBS pr. kultur pr. vask.Lyse cellerne i radioimmunoprecipitation assay buffer, suppleret med 1% protease hæmmer cocktail og fosfatase hæmmere cocktail to og tre i 30 minutter ved fire grader Celsius. Ved inkubationens afslutning opsamres lysaterne ved centrifugering. Brug den bicinchoninsyreanalyse til at bestemme proteinkoncentrationen af lysatprøverne.Proteinprøverne justeres til 0,5 eller et mikrogram pr. mikroliterkoncentrationer i 4-X prøvebuffer, og prøverne koges ved 96 grader Celsius i fem minutter. For vestlige blot analyse af prøverne, samle ethanol-renset glasplader og afstandstagere, og indlæse formen med en 8% polyarylamid gel med passende eksperimentelle kosttilskud. Mens gelen polymeriseres, skal du tilføje stablingsgelopløsning til en passende form, indsætte kammen og lade stablingsgelen polymerisere i 20 til 30 minutter ved stuetemperatur.Når begge geler har polymeriseret, placere dem i elektroforese apparat og fylde tanken med kører buffer. Derefter indlæses en 20-til 30-mikrolitervolumen af hver proteinprøve i hver brønd, og kør gelen ved 180 volt. Stop elektroforese efter ca 60 minutter, når farvestoffet front strømmer ud af gelen, og vask gelen med tris-buffered saltvand, suppleret med Tween, i et til to minutter.Proteinerne overføres til en polyvinyliden fluoridmembran ved semitør blotting i en og 1/2 time ved en konstant strøm på 300 milliampere. Bloker membranen med 5% fedtfri tør mælk fortyndet med tris-buffered saltvand plus Tween opløsning i en time ved stuetemperatur. Dernæst sonde membranen med passende antistoffer af interesse ved fire grader Celsius natten over.Næste morgen vaskes membranerne med tre 10-minutters vask af frisk tris-buffered saltvand pr vask, før membranen udsættes for det relevante sekundære antistof i en til en og 1/2 time ved stuetemperatur. Vask derefter membranen fem gange med frisk tris-bufferet saltvand pr vask og udsætte membranen til forbedret chemiluminescens løsning for signal visualisering ved hjælp af film. Her illustreres faldet i cellespredningen af forældre-PC-9-celler som reaktion på stigende koncentrationer af afatinib, hvilket bekræfter, at PC-9-celler er følsomme over for afatinib eksponering.Ingen af de tre afatinib-resistente cellelinjer viser imidlertid en undertrykkelse af celleproliferedning under afatinib eksponering. Afatinib-resistente cellelinjer udviser betydeligt langsommere vækstkurver end forældrenes PC-9 celler. Afatinib-resistente celler udtrykker betydeligt højere niveauer af EGFR-genomisk DNA og EGFR-proteinudtryk end forældres PC-9-celler.EGFR-sekvensering viser, at PC-9-celler udviser 15 basisparsletninger i EGFR exon 19 og vildtype EGFR i exon 20. Afatinib-resistente en og to cellelinjeceller udviser imidlertid en forstærkning af vild type EGFR exon 19. Afatinib-resistente cellelinje tre celler indeholder de samme 15 base par sletninger i EGFR exon 19 som i PC-9 celler, men en punktmutation i T790M er observeret i EGFR exon 20.Cellevækst kan blive ret langsom, når inhibitorkoncentrationen er tæt på IC-50 værdi. Må ikke diskutere kultur, som cellen vil fortsætte med at formere sig gradvist. Disse strategier blev udviklet for at efterligne de tilstande, hvorunder kræftpatienter udvikler klinisk relevant resistens til at vurdere erhvervede resistensmekanismer og udvikle sikre og effektive terapeutiske strategier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Oprettelse af dobbelt modstand mod EGFR-TKI og MØDTE TKI i lunge adenocarcinom celler In Vitro med en 2-trins dosis-eskalering Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Udvikling af en menneskelig prækliniske Model af Osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter Co kulturperler med bryst kræft cellelinjer

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Etablering af en lunge kolonisering Assay for Cirkulerende Tumor Cell visualisering i lungevæv

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation af Syngeneic lunge adenocarcinom celler at studere PD-L1 udtryk

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Røntgen følsomhed af kræft stamceller i lungekræft cellelinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...