Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

We danken het lid van het Advanced Cancer Translational Research Institute voor hun doordachte commentaren en Editage voor hun hulp bij het bewerken van Engelse taal. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (subsidie nummer: 16K09590 tot T.Y.).

1. oprichting van drie onafhankelijke Afatinib-resistente PC-9 cellijnen
<ol><li>Bepaling van de initiële blootstellingsconcentratie voor afatinib voor PC-9-cellen met behulp van de 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test
	<ol>
<li>Cultuur PC-9 cellen in groeimedium met foetaal runderserum (10%), penicillaire (100 U/mL) en streptomycine (100 μg/mL) in een cel-cultuur behandeld 10 cm schaal in een incubator van 5% CO2 bij 37 °c.</li>
		<li>Respendeer PC-9 cel...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Hier hebben we een methode beschreven voor het instellen van drie onafhankelijke afatinib-resistente cellijnen en deze cellen gekarakteriseerd door vergelijking met ouder PC-9-cellen. Door stapsgewijze blootstelling aan de dosisescalatie hebben de ouder PC-9-cellen gedurende een periode van 10-12 maanden resistentie tegen afatinib verworven. Klinisch zijn de resistentiemechanismen voor EGFR-Tki's heterogeen, en daarom werden PC-9-cellen na de eerste behandeling met afatinib verdeeld in drie onafhankelijke P100 gerechten ...

Vijf tyrosinekinaseremmers, gericht op epidermale groeifactor receptor (EGFR), waaronder gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib en osimertinib, zijn momenteel beschikbaar voor de behandeling van patiënten met EGFR-mutatie-positieve niet-kleincellige Long kanker (NSCLC). De afgelopen tien jaar hebben therapieën voor dergelijke patiënten een dramatische ontwikkeling ondergaan met de ontdekking van nieuwe mogelijke EGFR-TKIs. Bij patiënten met Long adenocarcinoom worden somatische mutaties in EGFR geïdentificeerd bij ongeveer 50% van de Aziatische en 15% van de blanke patiënten1. De meest voorkomende mutaties in EGFR zijn een L858R puntmutatie in EGFR Exon 21 en 15 base pair (BP) verwijderingen in EGFR Exon 192. Bij EGFR-mutatie-positieve patiënten met NSCLC verbeteren EGFR-TKIs de responspercentages en klinische uitkomsten in vergelijking met de vorige standaard van Platinum Doublet chemotherapie3.
Gefitinib en erlotinib waren de eerste goedgekeurde kleine molecuul remmers en worden in het algemeen aangeduid als eerste generatie EGFR-Tki's. Deze EGFR TKIs blok tyrosine kinase activiteit door te concurreren met ATP en omkeerbaar binding aan ATP binding sites4. Afatinib is een EGFR TKI van de tweede generatie die onherroepelijk en covalent bindt aan het tyrosine kinase domein van EGFR en wordt gekarakteriseerd als een pan-humane EGFR-familie remmer5.
Ondanks het dramatisch voordeel van deze therapieën bij patiënten met NSCLC, is verworven resistentie onvermijdelijk. Het meest voorkomende Resistentiemechanisme tegen de eerste en tweede generatie EGFR-tkis is de opkomst van de T790M-mutatie in EGFR Exon 20, die aanwezig is in 50-70% van de tumormonsters6,7,8. Andere weerstand mechanismen omvatten bypass-signalen (om te voldoen aan, IGF1R, en HER2), transformatie naar kleincellige longkanker, en inductie van de epitheliale-naar-mesenchymale overgang, die pre-klinisch en klinisch9optreden. De resistentiemechanismen voor EGFR-TKIs zijn heterogeen. Door het identificeren van nieuwe resistentiemechanismen in preklinische studies, kan het mogelijk zijn om nieuwe therapieën te ontwikkelen om resistentie te overwinnen. Optimale sequentie therapieën die het klinisch voordeel voor patiënten maximaliseren, moeten rekening houden met de resistentiemechanismen en het therapeutische doel.
Het is noodzakelijk om de juiste ouderlijke cellijn te kiezen, omdat het de basis is van alle daaropvolgende experimenten. De selectie strategieën beginnen met klinische relevantie; het is noodzakelijk om te kiezen voor een chemotherapie en straling naïeve cellijn. Eerdere chemotherapeutische en/of radiatieve behandeling kan de verandering van resistentie trajecten en veranderingen van de expressie van resistentie markers voor geneesmiddelen induceren. In deze studie worden PC-9-cellen, die 15 BP-verwijderingen in EGFR Exon 19 dragen, gebruikt voor de vaststelling van verworven resistentie tegen afatinib. Deze cellijn werd afgeleid van een Japanse NSCLC-patiënt, die geen eerdere chemotherapie en straling kreeg.
Omdat afatinib dagelijks oraal wordt toegediend, is een continue in vitro behandeling, waarbij de cellen voortdurend in aanwezigheid van afatinib worden gekweekt, klinisch relevant. De dosis geneesmiddelen die in de verschillende stappen van het experiment worden gebruikt, moet worden geoptimaliseerd voor de geselecteerde bovenliggende cellijn. Een cytotoxiciteits test kan worden gebruikt voor het bepalen van een geschikt geneesmiddelen bereik, dat vergelijkbaar moet zijn met de farmacokinetische informatie van het geneesmiddel.
Gedurende het hele selectieproces wordt de hele populatie cellen gehandhaafd als één groep; klonen of andere scheidingsmethoden worden niet gebruikt. De cellen worden eerst voortdurend blootgesteld aan een laag niveau van het geneesmiddel. Vervolgens, nadat de cellen zich aanpassen om te groeien in de aanwezigheid van het medicijn, wordt de dosis van het medicijn langzaam verhoogd tot de uiteindelijke optimale dosis van het geneesmiddel10,11. Als alternatief kan een Pulse Drug-Administration of mutagenese worden gebruikt voor het selecteren van resistentie cellen, die ook worden uitgevoerd voorafgaand aan medicamenteuze behandeling 12,13. Helaas worden gevallen waarin de resistentie tegen geneesmiddelen niet wordt ontwikkeld, meestal niet gerapporteerd. De selectie strategieën zijn ontwikkeld met als doel de voorwaarden van kankerpatiënten na te bootsen voor de wederopbouw van klinisch relevante resistentie. Soms, om moleculaire veranderingen in verband met mechanismen van de resistentie van de drug te identificeren, een hoge concentratie van het geneesmiddel wordt gebruikt. Dit model wordt minder klinisch relevant.
Hier beschrijven we een methode voor het instellen van drie onafhankelijke afatinib-resistente cellijnen van PC-9-cellen die 15 BP-verwijderingen in EGFR Exon 19 en de initiële karakterisering van de afatinib-resistente cellijnen verharten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

Verworven resistentie tegen moleculaire doelwit remmers is een ernstig probleem in de kankertherapie. Longkanker blijft de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde dood in de meeste landen. De ontdekking van "oncogene bestuurders mutaties," zoals epidermale groeifactor receptor (EGFR)-activerende mutaties, en latere ontwikkeling van moleculaire doelstoffen van EGFR-tyrosine kinase remmers (tkis) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib en osimertinib) hebben de behandeling van longkanker in de afgelopen decennia drastisch veranderd. Deze geneesmiddelen zijn echter nog steeds niet effectief bij patiënten met niet-kleincellige longkanker (NSCLC) die EGFR-activerende mutaties uitvoeren. Na verworven resistentie blijft de systemische progressie van NSCLC een significant obstakel bij de behandeling van patiënten met EGFR-mutatie-positieve NSCLC. Hier presenteren we een stapsgewijze dosisescalatie methode voor het instellen van drie onafhankelijke verworven afatinib-resistente cellijnen van NSCLC PC-9-cellen die harkotteren EGFR-activerende mutaties van 15-basepaar verwijderingen in EGFR Exon 19. Methoden voor het karakteriseren van de drie onafhankelijke afatinib-resistentie cellijnen worden kort gepresenteerd. De verworven resistentiemechanismen voor EGFR-TKIs zijn heterogeen. Daarom moeten meerdere cellijnen met verworven resistentie tegen EGFR-TKIs worden onderzocht. Tien tot twaalf maanden zijn nodig om cellijnen met verworven resistentie te verkrijgen met behulp van deze stapsgewijze dosisescalatie aanpak. De ontdekking van nieuwe verworven resistentiemechanismen zal bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere en veilige therapeutische strategieën.

Het schema voor het instellen van drie afatinib-resistentie cellijnen van PC-9-cellen met behulp van een stapsgewijze dosis-escalatieprocedure wordt weergegeven in Figuur 1. Figuur 2 toont een afname van de celproliferatie van ouder PC-9-cellen naarmate de concentratie van afatinib toeneemt, wat aangeeft dat PC-9-cellen gevoelig zijn voor blootstelling aan afatinib. Figuur 3 toont de afatinib-resiste...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Oprichting en karakterisering van drie Afatinib-resistente Long adenocarcinoom PC-9 cellijnen ontwikkeld met toenemende doses van Afatinib

Een methode voor het vaststellen van afatinib-resistentie cellijnen van Long adenocarcinoom PC-9 cellen werd ontwikkeld, en resistente cellen werden gekarakteriseerd. De resistente cellen kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van epidermale groeifactor receptor tyrosine kinase remmer-resistentiemechanismen, toepasbaar voor patiënten met niet-kleincellige longkanker.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

De studie van nieuwe verworven resistentiemechanismen zal bijdragen aan de ontwikkeling van effectievere en veiligere therapeutische strategieën bij patiënten met kankermiddelresistente en resectable kanker. Helaas worden gevallen waarin resistentie tegen geneesmiddelen zich niet ontwikkeld, over het algemeen niet gemeld. Deze stapsgewijze dosisescalatiemethode wordt beschouwd als de meest betrouwbare techniek voor het verkrijgen van verworven resistentiecellen.Om de juiste afatinib-weerstandsconcentratie te bepalen, kweekt pc-9 cellen in groeimedium in een met cellen gekweekte schaal van 10 centimeter behandelde schotel bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Resuspend de PC-9 cellen op een vier-keer-10-to-the-four cellen per milliliter van de groei medium concentratie, en plaats de cellen op 50 microliter van cel suspensie per put in een 96-well microplate. Behandel de cellen na een nachtelijke incubatie in de incubator van de celkweek de cellen met 50 microliters afatinib-oplossing per put, bij zes replica's van de aangegeven concentraties en na een incubatie van 96 uur in de broedcultuurbrocubator, voeg 15 microliters MTT-kleurstof toe aan elke put.Na vier uur in de celcultuur incubator, voeg 100 microliter van oplosmiddel / stop oplossing aan elke put, en de plaat terug te keren naar de incubator 's nachts. Meet de volgende ochtend de optische dichtheid op 570 nanometer op een microplatelezer. Voor continue blootstelling aan afatinib, cultuur PC-9 cellen in P-100 schotels met 10 milliliter groeimedium totdat de cellen subconfluency bereiken.Breng de subconfluent culturen in drie nieuwe P-100 gerechten van negen milliliter groeimedium per initiële cultuur schotel, en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator. De volgende ochtend voegt u 0,1 nanomolar, of 1/10 van de half-maximale remmende concentratie van afatinib, toe aan elke set van drie kweekgerechten. Wanneer de met afatinib behandelde cellen subconfluent worden, gebruik dan een pipet van één milliliter om de culturen grondig te mengen en één milliliter cellen van elk gerecht over te brengen naar negen milliliter vers groeimedium in nieuwe P-100-gerechten.Voeg 10% tot 20% hogere concentraties van afatinib toe aan de nieuwe culturen, waardoor de afatinibconcentratie wordt verhoogd door stapsgewijze dosisescalatie telkens wanneer de culturen subconfluency bereiken over een periode van 10 tot 12 maanden. Wanneer een afatinibconcentratie van één micromolar wordt bereikt, voert u de MTT-test uit, zoals aangetoond dat de cellen afatinib-resistentie hebben ontwikkeld. Om de groeicurve voor de cellijnen te bepalen, cultuur ouderlijke PC-9 en de drie afatinib-resistente cellijnen in groeimedium in de celcultuur incubator voor 24 uur.Resuspend de cellen van elke cultuur op een vijf-keer-10-tot-de-derde cellen per milliliter van de groei medium concentratie, en stoel 12 100-microliter repliceert van elke celpopulatie per goed in een 96-well microplaat. Voer vervolgens de MTT-test uit op dag nul, één, twee, drie, vijf en zeven van de cultuur, zoals aangetoond, en plot de resultaten met behulp van een geschikt statistisch analysesoftwareprogramma. Om veranderingen in epidermale groeifactorreceptor, of EGFR genomic DNA-expressie, te identificeren door omgekeerde transcriptase polymerase ketenanalyse, isoleren genomisch DNA van de celcultuur van belang met behulp van een DNA-zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant.Meet de concentratie van 25 nanogram-microliter concentraties van het geïsoleerde genomische DNA op een spectrofotometer. Versterk vervolgens 50 nanogram genomisch DNA met behulp van een SYBR groene mastermix en analyseer de resultaten met behulp van een op fluorescentie gebaseerd reverse transcriptase polymerase chain reaction detection system. Om veranderingen in EGFR genomic DNA-expressie te identificeren door sequencing, verbouw het genomische DNA met behulp van specifieke primers voor EGFR exons 19 tot 21.Zuiver vervolgens de versterkte PCR-producten met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant en volg de amplicons. Om veranderingen in epidermale groeifactor receptor eiwitexpressie door westerse vlek analyse te identificeren, behandel de cellen met afatinib gedurende 24 uur. Na 24 uur, was de cel culturen twee keer met vijf milliliter ijskoude PBS per cultuur per wasbeurt.Lyse de cellen in radio-immuunsypation assay buffer, aangevuld met 1%proteaseremmer cocktail en fosforremmers cocktail twee en drie gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel aan het einde van de incubatie de lysaten door centrifugatie. Gebruik de bicinchoninic zuurtest om de eiwitconcentratie van de lysaatmonsters te bepalen.Pas de eiwitmonsters aan op 0,5, of één microgram per microliterconcentraties, in 4-X monsterbuffer, en kook de monsters vijf minuten op 96 graden Celsius. Voor westerse vlek analyse van de monsters, monteren ethanol gereinigde glasplaten en afstandhouders, en laad de mal met een 8%polyacrylamide gel met de juiste experimentele supplementen. Terwijl de gel polymeriseert, voeg stapelen gel oplossing om een geschikte mal, voeg de kam, en laat de stapelen gel te polymeriseren voor 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur.Wanneer beide gels gepolymeriseerd zijn, plaatst u ze in het elektroforeseapparaat en vult u de tank met een lopende buffer. Laad vervolgens een volume van 20 tot 30 microliter van elk eiwitmonster in elke put en voer de gel uit op 180 volt. Stop de elektroforese na ongeveer 60 minuten, zodra de kleurstof voorkant stroomt uit de gel, en was de gel met tris-gebufferde zoutoplossing, aangevuld met Tween, gedurende een tot twee minuten.Breng de eiwitten op een polyvinylidenenfluoridemembraan door semi-droge blotting gedurende een en 1/2 uur bij een constante stroom van 300 milliampère. Blokkeer het membraan met 5%vetvrije droge melk verdund met tris-gebufferde zoutoplossing plus Tween-oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur. Vervolgens sonde het membraan met de juiste antilichamen van belang op vier graden Celsius 's nachts.De volgende ochtend was je de membranen met drie wasbeurten van 10 minuten verse tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt voordat je het membraan één tot één en 1/2 uur bij kamertemperatuur blootstelt aan het juiste secundaire antilichaam. Was vervolgens het membraan vijf keer met verse tris-gebufferde zoutoplossing per wasbeurt en stel het membraan bloot aan verbeterde chemiluminescentieoplossing voor signaalvisualisatie met behulp van films. Hier wordt de waargenomen afname in de celproliferatie van ouderlijke PC-9-cellen in reactie op toenemende concentraties van afatinib geïllustreerd, wat bevestigt dat PC-9-cellen gevoelig zijn voor blootstelling aan afatinib.Geen van de drie afatinib-resistente cellijnen toont echter een onderdrukking van celproliferatie onder blootstelling aan afatinib aan. Afatinib-resistente cellijnen vertonen aanzienlijk tragere groeicurven dan ouderlijke PC-9-cellen. Afatinib-resistente cellen drukken aanzienlijk hogere niveaus van EGFR genomic DNA en EGFR eiwitexpressie uit dan ouderlijke PC-9 cellen.EGFR-sequencing toont aan dat PC-9-cellen 15 base pair-verwijderingen vertonen in EGFR exon 19 en wild type EGFR in exon 20. Afatinib-resistente een en twee cellijncellen vertonen echter een versterking van het wilde type EGFR exon 19. Afatinib-resistente cellijn drie cellen bevatten dezelfde 15 base pair deleties in EGFR exon 19 als in PC-9 cellen, maar een puntmutatie in T790M wordt waargenomen in EGFR exon 20.Celgroei kan vrij traag worden wanneer de remmerconcentratie dicht bij IC-50-waarde ligt. Bespreek geen cultuur, omdat de cel zich geleidelijk zal blijven vermenigvuldigen. Deze strategieën werden ontwikkeld om de omstandigheden na te bootsen waaronder kankerpatiënten klinisch relevante resistentie ontwikkelen om verworven resistentiemechanismen te beoordelen en om veilige en effectieve therapeutische strategieën te ontwikkelen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Tot oprichting van dubbele weerstand tegen EGFR-TKI en ONTMOETTE-TKI in Lung adenocarcinoom cellen In Vitro met een 2-step dosis-escalatie-Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic transplantatie van Syngeneic Long adenocarcinoom cellen te bestuderen van PD-L1 expressie

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio sensitiviteit van kanker stamcellen in longkanker cellijnen

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse van zijpopulatie in vaste tumorcellijnen

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subcultuur en cryopreservatie van oesofageaal adenocarcinoom organoïden: voor- en nadelen voor eencellige spijsvertering

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...