Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
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Nous remercions le membre de l'Institut avancé de recherche translationnelle sur le cancer pour ses commentaires réfléchis et son édition pour son aide à l'édition de la langue anglaise. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (numéro de subvention: 16K09590 à T.Y.).

1. Création de trois lignes cellulaires PC-9 indépendantes résistantes à l'Afatinib
<ol><li>Détermination de la concentration initiale d'exposition d'afatinib pour des cellules de PC-9 utilisant le 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- du bromure de diphenyltetrazolium (MTT) d'assay
	<ol>
<li>Cellules PC-9 de culture dans le milieu de croissance contenant le sérum bovin foetal (10%), la pénicilline (100 U/mL), et la streptomycine (100 g/mL) dans un plat de 10 cm traité par culture cellulaire dans u...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. 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J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Ici, nous avons décrit une méthode pour établir trois lignées cellulaires indépendantes résistantes à l'afatinib et caractérisé ces cellules par rapport aux cellules PC-9 parentales. Par l'exposition progressive d'escalade de dose, les cellules parentales de PC-9 ont acquis la résistance à l'afatinib sur une période de 10-12 mois. Cliniquement, les mécanismes de résistance aux ItNI EGFR sont hétérogènes, et donc, après le traitement initial avec l'afatinib, les cellules PC-9 ont été divisées en trois...

Cinq inhibiteurs de la tyrosine kinase, ciblant le récepteur épidermique du facteur de croissance (EGFR), y compris le gefitinib, l'erlotinib, l'afatinib, le dacomitinib et l'osimertinib sont actuellement disponibles pour traiter les patients atteints de poumon non à petites cellules non à petites cellules mutation EGFR cancer (NSCLC). Au cours de la dernière décennie, les thérapies pour de tels patients ont subi le développement dramatique avec la découverte de nouveaux EGFR-TKIs potentiels. Parmi les patients atteints d'adénocarcinome pulmonaire, des mutations somatiques dans l'EGFR sont identifiées chez environ 50 % des patients asiatiques et 15 % des patients caucasiens1. Les mutations les plus communes dans EGFR sont une mutation de point de L858R dans egFR exon 21 et 15 suppressions de paire de base (bp) dans l'exon d'EGFR 192. Chez les patients egFR mutation-positifs avec NSCLC, EGFR-TKIs améliorer les taux de réponse et les résultats cliniques par rapport à la norme précédente de la chimiothérapie de doublet de platine3.
Le gefitinib et l'erlotinib ont été les premiers inhibiteurs approuvés de petites molécules et sont généralement appelés TKIs EGFR de première génération. Ces EGFR TKIs bloquent l'activité tyrosine kinase en rivalisant avec l'ATP et en se liant de manière réversible aux sites de liaison ATP4. Afatinib est un TKI EGFR de deuxième génération qui se lie de façon irréversible et covalente au domaine de la tyrosine kinase de l'EGFR et se caractérise comme un inhibiteur panhumain de la famille EGFR5.
En dépit de l'avantage dramatique de ces thérapies dans les patients présentant NSCLC, la résistance acquise est inévitable. Le mécanisme de résistance le plus commun contre les TKIs EGFR de première et deuxième génération est l'émergence de la mutation T790M dans l'exon 20 d'EGFR, qui est présent dans 50-70% des échantillons de tumeur6,7,8. D'autres mécanismes de résistance incluent des signaux de déviation (au MET, à l'IGF1R, et au HER2), la transformation au cancer dupoumon à petites cellules, et l'induction de la transition épithéliale-à-mesenchymal, qui se produisent précliniquement et médicalement 9. Les mécanismes de résistance aux TCI EGFR sont hétérogènes. En identifiant de nouveaux mécanismes de résistance dans les études précliniques, il peut être possible de développer de nouvelles thérapies pour surmonter la résistance. Les thérapies optimales de séquence qui maximisent l'avantage clinique aux patients doivent considérer les mécanismes de résistance et la cible thérapeutique.
Il est impératif de choisir la bonne lignée cellulaire parentale, car c'est la base de toutes les expériences ultérieures. Les stratégies de sélection commencent par une pertinence clinique; il est nécessaire de choisir une ligne cellulaire naïve de chimiothérapie et de rayonnement. Le traitement chimiothérapeutique et/ou radiatif antérieur peut induire l'altération des voies de résistance et les changements de l'expression des marqueurs de résistance aux médicaments. Dans cette étude, les cellules PC-9, portant des suppressions de 15 bp dans egFR exon 19, sont employées pour l'établissement de la résistance acquise à l'afatinib. Cette lignée cellulaire a été dérivée d'un patient japonais de NSCLC, qui n'a pas reçu la chimiothérapie et le rayonnement antérieurs.
Parce que l'afatinib est administré par voie orale sur une base quotidienne, le traitement in vitro continu, où les cellules sont cultivées en permanence en présence d'afatinib serait cliniquement pertinent. La dose de médicaments utilisés dans les différentes étapes de l'expérience doit être optimisée pour la lignée cellulaire parentale sélectionnée. Un test de cytotoxicité peut être utilisé pour déterminer une gamme de médicaments approprié, qui devrait être comparable à l'information pharmacocinétique du médicament.
Tout au long du processus de sélection, toute la population de cellules est maintenue en un seul groupe; le clonage ou d'autres méthodes de séparation ne sont pas utilisés. Les cellules sont d'abord continuellement exposées à un faible niveau de la drogue. Par la suite, après que les cellules s'adaptent pour se développer en présence du médicament, la dose du médicament est lentement augmentée à la dose optimale finale du médicament10,11. Alternativement, une administration de drogue de pouls ou mutagénèse peut être employée pour sélectionner des cellules de résistance, qui sont également exécutées avant le traitement de drogue 12,13. Malheureusement, les cas où la résistance aux médicaments ne se développe pas ne sont généralement pas signalés. Les stratégies de sélection sont développées dans le but d'essayer d'imiter les conditions des patients cancéreux pour reconstruire la résistance médicalement pertinente. Parfois, pour identifier les changements moléculaires associés aux mécanismes de résistance aux médicaments, une forte concentration de médicaments est utilisée. Ce modèle devient moins pertinent sur le plan clinique.
Ici, nous décrivons une méthode pour établir trois lignées cellulaires indépendantes afatinib-résistantes des cellules DE PC-9 abritant 15 suppressions de bp dans l'exon 19 d'EGFR aussi bien que la caractérisation initiale des lignes cellulaires afatinib-résistantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

La résistance acquise aux inhibiteurs moléculaires de cible est un problème grave dans la thérapie de cancer. Le cancer du poumon demeure la principale cause de décès liés au cancer dans la plupart des pays. La découverte de « mutations de conducteur oncogènes »,telles que les mutations épidermiques de facteur de croissance (EGFR) activant, et le développement suivant des agents moléculaires ciblés des inhibiteurs de la kinase de tyrosine d'EGFR (TKIs) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, et osimertinib) ont considérablement modifié le traitement du cancer du poumon au cours des dernières décennies. Cependant, ces médicaments ne sont toujours pas efficaces chez les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) porteurs de mutations activantes EGFR. Après résistance acquise, la progression systémique de NSCLC demeure un obstacle significatif en traitant des patients présentant le NSCLC mutation-positif d'EGFR. Ici, nous présentons une méthode progressive d'escalade de dose pour établir trois lignées cellulaires afatinib-résistantes acquises indépendantes des cellules PC-9 de NSCLC hébergeant des mutations EGFR-activant des suppressions de paire s'édifiantdansdansdans eegFR exon 19. Des méthodes pour caractériser les trois lignées cellulaires indépendantes d'afatinib-résistance sont brièvement présentées. Les mécanismes de résistance acquis aux TCI EGFR sont hétérogènes. Par conséquent, plusieurs lignées cellulaires ayant une résistance acquise à l'EGFR-TKIs doivent être examinées. Dix à douze mois sont nécessaires pour obtenir des lignées cellulaires avec une résistance acquise en utilisant cette approche d'escalade de dose progressive. La découverte de nouveaux mécanismes de résistance acquis contribuera à l'élaboration de stratégies thérapeutiques plus efficaces et plus sûres.

Le schéma pour établir trois lignées cellulaires de résistance à l'afatinib à partir de cellules PC-9 à l'aide d'une procédure d'escalade de la dose progressive est montré dans la figure 1. La figure 2 montre une diminution de la prolifération cellulaire des cellules PC-9 parentales à mesure que la concentration d'afatinib augmente, ce qui indique que les cellules PC-9 sont sensibles à l'exposition à l'afatinib. <str...

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Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Établissement et caractérisation de trois lignées cellulaires résistantes à l'adénocarciane pulmonaire résistante à l'afatinib PC-9 développées avec des doses croissantes d'Afatinib

Une méthode pour établir des lignes cellulaires afatinib-résistance des cellules PC-9 d'adénocarcinome de poumon a été développée, et des cellules résistantes ont été caractérisées. Les cellules résistantes peuvent être employées pour étudier les mécanismes épidermiques de récepteur de kinase de kinase de facteur de croissance de facteur de facteur de tyrosine, applicables pour des patients présentant le cancer du poumon de non-petite cellule.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

L’étude de nouveaux mécanismes de résistance acquis contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques plus efficaces et plus sûres chez les patients atteints d’un cancer résistant aux agents cancéraux et résécable. Malheureusement, les cas où la résistance aux médicaments ne s’est pas développé ne sont généralement pas signalés. Cette méthode d’escalade de la dose stepwise est considérée comme la technique la plus fiable pour obtenir des cellules de résistance acquise.Pour déterminer la concentration appropriée de résistance à l’afatinib, culture pc-9 cellules dans le milieu de croissance dans un plat de 10 centimètres de culture cellulaire traitée à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Resuspendez les cellules PC-9 à une concentration moyenne de quatre fois 10 à 4 par millilitre de concentration moyenne de croissance, et placez les cellules à 50 microlitres de suspension cellulaire par puits dans une microplaque de 96 puits. Après une incubation d’une nuit dans l’incubateur de culture cellulaire, traiter les cellules avec 50 microlitres de solution d’afatinib par puits, à six répétitions des concentrations indiquées, et après une incubation de 96 heures dans l’incubateur de culture de réforme, ajouter 15 microlitres de colorant MTT à chaque puits.Après quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, ajouter 100 microlitres de solution solubilisation/arrêt à chaque puits, et remettre la plaque à l’incubateur pendant la nuit. Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 570 nanomètres sur un lecteur de microplaque. Pour une exposition continue à l’afatinib, culture pc-9 cellules dans les plats P-100 contenant 10 millilitres de milieu de croissance jusqu’à ce que les cellules atteignent la sous-confluence.Transférer les cultures subconfluentes dans trois nouveaux plats P-100 de neuf millilitres de milieu de croissance par plat de culture initial, et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, ajouter 0,1 nanomolaire, soit 1/10 de la concentration inhibitrice semi-maximale de l’afatinib, à chaque ensemble de trois plats de culture. Lorsque les cellules traitées à l’afatinib deviennent subconfluentes, utilisez une pipette d’un millilitre pour bien mélanger les cultures et transférez un millilitre de cellules de chaque plat à neuf millilitres de milieu de croissance frais dans les nouveaux plats P-100.Ajouter des concentrations d’afatinib de 10 % à 20 % plus élevées aux nouvelles cultures, augmentant la concentration d’afatinib par escalade de la dose stepwise chaque fois que les cultures atteignent la sous-confluence sur une période de 10 à 12 mois. Quand une concentration d’afatinib d’un micromolaire est atteinte, exécutez l’essai de MTT comme démontré pour confirmer que les cellules ont développé l’afatinib-résistance. Déterminer la courbe de croissance des lignées cellulaires, la culture parentale PC-9 et les trois lignées cellulaires résistantes à l’afatinib dans le milieu de croissance dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.Resuspendez les cellules de chaque culture à une concentration moyenne de cinq fois 10 à 3 par millilitre de concentration moyenne de croissance, et placez 12 répliques de 100 microlitres de chaque population cellulaire par puits dans une microplaque de 96 puits. Effectuez ensuite l’analyse MTT les jours zéro, un, deux, trois, cinq et sept de la culture comme démontré, et tracer les résultats à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié. Pour identifier les altérations du récepteur du facteur de croissance épidermique, ou expression de l’ADN génomique EGFR, par l’analyse inverse de la chaîne de polymése transcriptase, isoler l’ADN génomique de la culture cellulaire d’intérêt à l’aide d’un kit de purification de l’ADN selon les instructions du fabricant.Mesurer la concentration de concentrations de 25 nanogrammes-microlitres de l’ADN génomique isolé sur un spectrophotomètre. Ensuite, amplifiez 50 nanogrammes d’ADN génomique à l’aide d’un mélange maître vert SYBR, et analysez les résultats à l’aide d’un système de détection de réaction en chaîne de transcriptase inverse à base de fluorescence. Pour identifier les altérations de l’expression génomique de l’ADN EGFR par séquençage, amplifiez l’ADN génomique à l’aide d’amorces spécifiques pour les exons EGFR 19 à 21.Ensuite, purifier les produits PCR amplifiés à l’aide d’un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant, et séquencer les amplicons. Pour identifier des changements dans l’expression épidermique de protéine de récepteur de facteur de croissance par l’analyse occidentale de tache, traitez les cellules avec l’afatinib pendant 24 heures. Après 24 heures, laver les cultures cellulaires deux fois avec cinq millilitres de PBS glacé par culture par lavage.Lyse les cellules dans le tampon d’essai de radioimmunoprecipitation, complété avec le cocktail inhibiteur de protéase de 1% et le cocktail d’inhibiteurs de phosphatase deux et trois pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, recueillir les lysates par centrifugation. Utilisez l’analyse de l’acide bicinchoninique pour déterminer la concentration en protéines des échantillons de lysate.Ajustez les échantillons de protéines à 0,5, ou un microgramme par concentration de microlitres, dans un tampon d’échantillon de 4 X, et faites bouillir les échantillons à 96 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour l’analyse occidentale des taches des échantillons, assemblez des plaques de verre et des entretriers nettoyés à l’éthanol, et chargez le moule avec un gel polyacrylamide de 8 % avec les suppléments expérimentaux appropriés. Pendant que le gel est polymérisant, ajoutez la solution de gel d’empilage à un moule approprié, insérez le peigne, et permettez au gel d’empilage de polymériser pendant 20 à 30 minutes à température ambiante.Lorsque les deux gels sont polymérisés, placez-les dans l’appareil d’électrophoresis et remplissez le réservoir d’un tampon en marche. Chargez ensuite un volume de 20 à 30 microlitres de chaque échantillon de protéines dans chaque puits et exécutez le gel à 180 volts. Arrêter l’électrophorèse après environ 60 minutes, une fois que le front de teinture s’écoule du gel, et laver le gel avec tris tamponné salin, complété par du tween, pendant une à deux minutes.Transférer les protéines sur une membrane de fluorure polyvinylidene par ballonnement semi-sec pendant une heure et demie à un courant constant de 300 milliampes. Bloquez la membrane avec du lait sec non gras dilué avec une solution saline tris-tamponnée plus tween pendant une heure à température ambiante. Ensuite, sondez la membrane avec les anticorps appropriés d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain matin, lavez les membranes avec trois lavages de 10 minutes de solution saline fraîche tamponnée par lavage avant d’exposer la membrane à l’anticorps secondaire approprié pendant une à une heure et demie à température ambiante. Lavez ensuite la membrane cinq fois avec de la solution saline fraîche tamponnée par lavage et exposez la membrane à une solution améliorée de chimioluminescence pour la visualisation du signal à l’aide de films. Ici, la diminution observée dans la prolifération cellulaire des cellules parentales PC-9 en réponse à l’augmentation des concentrations d’afatinib est illustrée, confirmant que les cellules PC-9 sont sensibles à l’exposition à l’afatinib.Cependant, aucune des trois lignées cellulaires résistantes à l’afatinib ne démontre une suppression de la prolifération cellulaire sous exposition à l’afatinib. Les lignées cellulaires résistantes à l’afatinib présentent des courbes de croissance significativement plus lentes que les cellules parentales PC-9. Les cellules résistantes à l’afatinib expriment des niveaux significativement plus élevés d’ADN génomique EGFR et d’expression des protéines EGFR que les cellules parentales PC-9.Le séquençage EGFR démontre que les cellules PC-9 présentent 15 suppressions de paires de base dans l’exon 19 d’EGFR, et le type sauvage EGFR dans l’exon 20. Cependant, les cellules de la lignée cellulaire résistantes à l’afatinib présentent une amplification de type sauvage EGFR exon 19. Les cellules résistantes à l’afatinib trois cellules contiennent les mêmes 15 suppressions de paire de base dans l’exon 19 d’EGFR que dans les cellules PC-9, mais une mutation ponctuelle dans T790M est observée dans l’exon 20 d’EGFR.La croissance cellulaire peut devenir assez lente lorsque la concentration de l’inhibiteur est proche de la valeur IC-50. Ne discutez pas de culture, car la cellule continuera à proliférer progressivement. Ces stratégies ont été élaborées pour imiter les conditions dans lesquelles les patients atteints de cancer développent une résistance cliniquement pertinente pour évaluer les mécanismes de résistance acquis et pour développer des stratégies thérapeutiques sûres et efficaces.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules In Vitro avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Recherche

Recherche en cancérologie

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilité des cellules souches cancéreuses dans les lignées cellulaires du cancer du poumon

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Établissement et caractérisation des sphéroïdes neuroendocrines de la petite intestin

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolement et caractérisation des modèles organoïdes du bassin adénoïque du pancréas dérivé par le patient

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Sous-culture et cryoconservation des organoïdes de l’adénocarcinome œsophagien: avantages et inconvénients de la digestion unicellulaire

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...