Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
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Wir danken dem Mitglied des Advanced Cancer Translational Research Institute für ihre nachdenklichen Kommentare und Editage für ihre Unterstützung bei der englischsprachigen Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI (Zuschussnummer: 16K09590 an T.Y.) unterstützt.

1. Aufbau von drei unabhängigen Afatinib-resistenten PC-9-Zelllinien
<ol><li>Bestimmung der anfänglichen Afatinib-Expositionskonzentration für PC-9-Zellen mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Test
	<ol>
<li>Kultur-PC-9-Zellen im Wachstumsmedium, die fetales Rinderserum (10%), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 g/ml) in einer 10 cm großen Zellkultur in einem 5% CO2-Inkubator bei 37 °C behandelten Zellkultur-Schale enthalten.</li>
		<li>PC-9-Z...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. 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J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Hier beschrieben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien und charakterisierten diese Zellen im Vergleich zu elterlichen PC-9-Zellen. Durch schrittweise Dosiseskalationsexposition erhielten die elterlichen PC-9-Zellen über einen Zeitraum von 10-12 Monaten eine Resistenz gegen Afatinib. Klinisch sind die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs heterogen, so dass PC-9-Zellen nach der Erstbehandlung mit Afatinib in drei unabhängige p100-Gerichte unterteilt und afatinib weiter au...

Fünf Tyrosinkinase-Inhibitoren, die auf epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) abzielen, einschließlich Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib, sind derzeit für die Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positiver nicht-kleinzelliger Lunge verfügbar. Krebs (NSCLC). In den letzten zehn Jahren haben sich Therapien für solche Patienten mit der Entdeckung neuer potenzieller EGFR-TKIs dramatisch entwickelt. Bei Patienten mit Lungenadenokarzinom wurden somatische Mutationen in EGFR bei etwa 50%der asiatischen und 15% der kaukasischen Patienten 1 identifiziert. Die häufigsten Mutationen in EGFR sind eine L858R-Punktmutation bei EGFR exon 21 und 15 Base pair (bp) Deletionen in EGFR exon 192. Bei EGFR-Mutations-positiven Patienten mit NSCLC verbessern EGFR-TKIs die Ansprechraten und klinischen Ergebnisse im Vergleich zum vorherigen Standard der Platin-Doppelchemotherapie3.
Gefitinib und Erlotinib waren die ersten zugelassenen kleinen Molekülinhibitoren und werden im Allgemeinen als EGFR-TKIs der ersten Generation bezeichnet. Diese EGFR TKIs blockieren die Tyrosinkinase-Aktivität, indem sie mit ATP konkurrieren und reversibel an ATP-Bindungsstellen binden4. Afatinib ist ein EGFR-TKI der zweiten Generation, das irreversibel und kovalent an die Tyrosinkinase-Domäne von EGFR bindet und als panhumaner EGFR-Familieninhibitor5charakterisiert ist.
Trotz des dramatischen Nutzens dieser Therapien bei Patienten mit NSCLC ist eine erworbene Resistenz unvermeidlich. Der häufigste Resistenzmechanismus gegen EGFR-TKIs der ersten und zweiten Generation ist die Entstehung der T790M-Mutation in EGFR exon20, die in 50-70% der Tumorproben 6,7,8vorhanden ist. Andere Resistenzmechanismen sind Bypass-Signale (zu MET, IGF1R und HER2), Transformation zu kleinzelligem Lungenkrebs und Induktion epitheliaal-mesenchymaler Übergang, die vorklinisch und klinisch9auftreten. Die Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Durch die Identifizierung neuartiger Resistenzmechanismen in präklinischen Studien kann es möglich sein, neuartige Therapeutika zu entwickeln, um Resistenzen zu überwinden. Optimale Sequenztherapien, die den klinischen Nutzen für die Patienten maximieren, müssen die Resistenzmechanismen und das therapeutische Ziel berücksichtigen.
Es ist zwingend notwendig, die richtige elterliche Zelllinie zu wählen, da sie die Grundlage aller nachfolgenden Experimente ist. Die Auswahlstrategien beginnen mit klinischer Relevanz; es ist notwendig, eine Chemotherapie und Bestrahlung naive Zelllinie zu wählen. Vorherige chemotherapeutische und/oder strahlungstechnische Behandlung kann die Veränderung der Resistenzwege und Veränderungen der Expression von Arzneimittelresistenzmarkern induzieren. In dieser Studie werden PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 tragen, für die Etablierung der erworbenen Resistenz gegen Afatinib eingesetzt. Diese Zelllinie wurde von einem japanischen NSCLC-Patienten abgeleitet, der keine vorherige Chemotherapie und Bestrahlung erhielt.
Da Afatinib täglich oral verabreicht wird, wäre eine kontinuierliche In-vitro-Behandlung, bei der die Zellen ständig in Gegenwart von Afatinib kultiviert werden, klinisch relevant. Die Dosis der Medikamente, die in den verschiedenen Schritten des Experiments verwendet werden, muss für die ausgewählte Elternzelllinie optimiert werden. Zur Bestimmung eines geeigneten Arzneimittelbereichs kann ein Zytotoxizitätstest verwendet werden, der mit den pharmakokinetischen Informationen des Arzneimittels vergleichbar sein sollte.
Während des gesamten Auswahlprozesses wird die gesamte Zellgesamtheit als eine einzige Gruppe beibehalten. Klonen oder andere Trennmethoden werden nicht verwendet. Die Zellen werden zunächst kontinuierlich einem niedrigen Niveau des Medikaments ausgesetzt. Anschließend, nachdem sich die Zellen anpassen, um in Gegenwart des Medikaments zu wachsen, wird die Dosis des Medikaments langsam auf die endgültige optimale Dosis des Medikaments10,11erhöht. Alternativ kann eine Pulsmedikamenten-Verabreichung oder Mutagenese zur Auswahl von Resistenzzellen verwendet werden, die auch vor der medikamentösen Behandlung durchgeführt werden 12,13. Leider werden Fälle, in denen sich die Arzneimittelresistenz nicht entwickelt, in der Regel nicht gemeldet. Die Selektionsstrategien werden mit dem Ziel entwickelt, die Bedingungen von Krebspatienten für den Wiederaufbau klinisch relevanter Resistenzen nachzuahmen. Manchmal wird eine hohe Arzneimittelkonzentration verwendet, um molekulare Veränderungen im Zusammenhang mit Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu identifizieren. Dieses Modell wird weniger klinisch relevant.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung von drei unabhängigen afatinibresistenten Zelllinien aus PC-9-Zellen, die 15 bp Deletionen in EGFR exon 19 enthalten, sowie die anfängliche Charakterisierung der afatinibresistenten Zelllinien.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

Erworbene Resistenz gegen molekulare Zielhemmer ist ein ernstes Problem in der Krebstherapie. Lungenkrebs ist in den meisten Ländern nach wie vor die häufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Die Entdeckung von "onkogenen Treibermutationen", wie epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)-aktivierende Mutationen, und die anschließende Entwicklung molekularer gezielter Wirkstoffe von EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) (Gefitinib, Erlotinib, Afatinib, Dacomitinib und Osimertinib) haben die Lungenkrebsbehandlung in den letzten Jahrzehnten dramatisch verändert. Diese Medikamente sind jedoch immer noch nicht wirksam bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die EGFR-aktivierende Mutationen tragen. Nach erworbener Resistenz bleibt das systemische Fortschreiten von NSCLC ein erhebliches Hindernis bei der Behandlung von Patienten mit EGFR-Mutation-positivem NSCLC. Hier stellen wir eine stufenweise Dosiseskalationsmethode zur Etablierung von drei unabhängigen erworbenen Afatinib-resistenten Zelllinien aus NSCLC PC-9-Zellen vor, die EGFR-aktivierende Mutationen von 15-Basen-Paar-Deletionen in EGFR exon 19 enthalten. Methoden zur Charakterisierung der drei unabhängigen afatinib-widerstandsgebundenen Zelllinien werden kurz vorgestellt. Die erworbenen Resistenzmechanismen gegen EGFR-TKIs sind heterogen. Daher müssen mehrere Zelllinien mit erworbener Resistenz gegen EGFR-TKIs untersucht werden. Zehn bis zwölf Monate sind erforderlich, um Zelllinien mit erworbenem Widerstand mit diesem schrittweisen Dosiseskalationsansatz zu erhalten. Die Entdeckung neuartiger resistenzmechanismen wird zur Entwicklung wirksamerer und sicherer therapeutischer Strategien beitragen.

Das Schema zur Einrichtung von drei Afatinib-Resistenz-Zelllinien aus PC-9-Zellen mit einem schrittweisen Dosis-Eskalationsverfahren ist in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt eine Abnahme der Zellproliferation von elterlichen PC-9-Zellen, da die Konzentration von Afatinib erhöht ist, was darauf hindeutet, dass PC-9-Zellen empfindlich auf Afatinib-Exposition reagieren. Abbildung 3 zeigt die Af...

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Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablierung und Charakterisierung von drei Afatinib-resistenten Lungenadenokarzinom PC-9 Zelllinien entwickelt mit zunehmenden Dosen von Afatinib

Es wurde ein Verfahren zur Etablierung von Afatinib-Resistenz-Zelllinien aus Lungenadenokarzinom-PC-9-Zellen entwickelt und resistente Zellen charakterisiert. Die resistenten Zellen können verwendet werden, um epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Inhibitor-Resistenz-Mechanismen zu untersuchen, anwendbar für Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Die Untersuchung neuartiger erworbener Resistenzmechanismen wird zur Entwicklung wirksamerer und sichererer therapeutischer Strategien bei Patienten mit krebserkranken und resezierbarem Krebs beitragen. Leider werden Fälle, in denen sich die Arzneimittelresistenz nicht entwickelt hat, in der Regel nicht gemeldet. Diese schrittweise Dosiseskalationsmethode gilt als die zuverlässigste Technik zur Gewinnung erworbener Resistenzzellen.Um die geeignete Afatinib-Resistenzkonzentration zu bestimmen, kulturieren PC-9-Zellen in Wachstumsmedium in einem 10-Zentimeter-Zellkultur-behandelten Gericht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Setzen Sie die PC-9-Zellen bei einer viermal-10-zu-den-vier-Zellen pro Milliliter Wachstumsmedium Konzentration aus, und setzen Sie die Zellen auf 50 Mikroliter Zellsuspension pro Brunnen in einer 96-Well-Mikroplatte. Nach einer nächtlichen Inkubation im Zellkultur-Inkubator die Zellen mit 50 Mikrolitern Afatinib-Lösung pro Brunnen, bei sechs Replikationen der angegebenen Konzentrationen und nach einer 96-stündigen Inkubation im Inkubator der Keulungskultur 15 Mikroliter MTT-Farbstoff zu jedem Brunnen hinzufügen.Nach vier Stunden im Zellkultur-Inkubator 100 Mikroliter Löslichkeit/Stop-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte über Nacht an den Inkubator zurückgeben. Messen Sie am nächsten Morgen die optische Dichte auf einem Mikroplattenleser mit 570 Nanometern. Für eine kontinuierliche Afatinib-Exposition, Kultur PC-9-Zellen in P-100-Schalen mit 10 Milliliter Wachstumsmedium, bis die Zellen Subkonfluenz erreichen.Übertragen Sie die subkonfluenten Kulturen in drei neue P-100-Gerichte mit neun Millilitern Wachstumsmedium pro anfänglichem Kulturgericht und geben Sie die Zellen an den Zellkultur-Inkubator zurück. Am nächsten Morgen 0,1 Nanomolar oder 1/10 der halbmaximalen hemmenden Konzentration von Afatinib zu jedem Satz von drei Kulturgerichten hinzufügen. Wenn die mit Afatinib behandelten Zellen subkonfluent werden, verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um die Kulturen gründlich zu mischen, und übertragen Sie einen Milliliter Zellen von jeder Schale auf neun Milliliter frisches Wachstumsmedium in neuen P-100-Gerichten.Fügen Sie den neuen Kulturen 10% bis 20% höhere Konzentrationen von Afatinib hinzu, wodurch die Afatinib-Konzentration durch schrittweise Dosiseskalation jedes Mal erhöht wird, wenn die Kulturen über einen Zeitraum von 10 bis 12 Monaten subkonfluenz erreichen. Wenn eine Afatinib-Konzentration eines Mikromolaren erreicht wird, führen Sie den MTT-Assay durch, um zu bestätigen, dass die Zellen eine Afatinib-Resistenz entwickelt haben. Um die Wachstumskurve für die Zelllinien zu bestimmen, Kultur Eltern PC-9 und die drei afatinib-resistenten Zelllinien in Wachstumsmedium im Zellkultur-Inkubator für 24 Stunden.Setzen Sie die Zellen aus jeder Kultur bei einer fünfmal-10-bis-dritten Zelle pro Milliliter Wachstumsmedium Konzentration aus, und setzen Sie sich 12 100-Mikroliter pro Bohrkörper pro Bohrkörper in einer 96-Well-Mikroplatte. Führen Sie dann den MTT-Test an den Tagen Null, eins, zwei, drei, fünf und sieben der Kultur aus, wie gezeigt, und zeichnen Sie die Ergebnisse mithilfe eines geeigneten Softwareprogramms für statistische Analysen auf. Um Veränderungen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors oder der genomischen DNA-Expression EGFR durch Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenanalyse zu identifizieren, isolieren Sie genomische DNA aus der Zellkultur, die von Interesse ist, indem Sie ein DNA-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers verwenden.Messen Sie die Konzentration von 25-Nanogramm-Mikroliter-Konzentrationen der isolierten genomischen DNA auf einem Spektralphotometer. Verstärken Sie dann 50 Nanogramm genomischer DNA mit einem SYBR-Grün-Master-Mix und analysieren Sie die Ergebnisse mit einem fluoreszenzbasierten Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktions-Detektionssystem. Um Veränderungen der genomischen DNA-Expression von EGFR durch Sequenzierung zu identifizieren, verstärken Sie die genomische DNA mit spezifischen Primern für egFR-Exons 19 bis 21.Reinigen Sie dann die verstärkten PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, und sequenzieren Sie die Amplicons. Um Veränderungen in der epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Protein-Expression durch Western-Blot-Analyse zu identifizieren, behandeln Sie die Zellen mit Afatinib für 24 Stunden. Waschen Sie nach 24 Stunden die Zellkulturen zwei Mal mit fünf Millilitern eiskaltem PBS pro Kultur pro Waschgang.Lyse die Zellen in Radioimmunpräzipitierstas-Assay-Puffer, ergänzt mit 1%Protease-Hemmer-Cocktail und Phosphatase-Inhibitoren Cocktail zwei und drei für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Lysate durch Zentrifugation sammeln. Verwenden Sie den Bicinchoninsäure-Assay, um die Proteinkonzentration der Lysatproben zu bestimmen.Stellen Sie die Proteinproben auf 0,5 oder ein Mikrogramm pro Mikroliter konzentrationen im 4-X-Probenpuffer ein, und kochen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 96 Grad Celsius. Für die Western-Blot-Analyse der Proben, ethanolgereinigte Glasplatten und Abstandshalter montieren und die Form mit einem 8%Polyacrylamid-Gel mit den entsprechenden experimentellen Ergänzungen beladen. Während das Gel polymerisiert, stapeln Gellösung zu einer geeigneten Form hinzufügen, legen Sie den Kamm, und lassen Sie das Stapelgel für 20 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren.Wenn beide Gele polymerisiert sind, legen Sie sie in das Elektrophoresegerät und füllen Sie den Tank mit Laufpuffer. Dann laden Sie ein 20-bis 30-Mikroliter Volumen jeder Proteinprobe in jeden Brunnen und führen Sie das Gel bei 180 Volt. Stoppen Sie die Elektrophorese nach ca. 60 Minuten, sobald die Farbstofffront aus dem Gel fließt, und waschen Sie das Gel mit tris-gepufferter Salin, ergänzt durch Tween, für ein bis zwei Minuten.Übertragen Sie die Proteine auf eine Polyvinylidenfluoridmembran durch halbtrockenes Blotting für eine und 1/2 Stunden bei einem konstanten Strom von 300 Milliampere. Blockieren Sie die Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch, die mit tris-gepufferter Salin- und Tween-Lösung verdünnt wird, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes sondieren Sie die Membran mit den entsprechenden Antikörpern von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Morgen die Membranen mit drei 10-minütigen Waschungen frischer Tris-gepufferter Saline pro Wäsche waschen, bevor sie die Membran für ein bis ein s/2 Stunden bei Raumtemperatur dem entsprechenden Sekundärantikörper aussetzen. Waschen Sie die Membran dann fünfmal mit frischer Tris-gepufferter Salin pro Waschgang und setzen Sie die Membran einer verbesserten Chemilumineszenzlösung zur Signalvisualisierung mit Filmen aus. Hier wird die beobachtete Abnahme der Zellproliferation von elterlichen PC-9-Zellen als Reaktion auf die Erhöhung der Konzentrationen von Afatinib veranschaulicht, was bestätigt, dass PC-9-Zellen empfindlich auf Afatinib-Exposition reagieren.Keine der drei afatinibresistenten Zelllinien zeigt jedoch eine Unterdrückung der Zellproliferation unter Afatinib-Exposition. Afatinib-resistente Zelllinien weisen deutlich langsamere Wachstumskurven auf als elterliche PC-9-Zellen. Afatinib-resistente Zellen drücken signifikant höhere Konzentrationen der genomischen EGFR-DNA und der EGFR-Proteinexpression aus als elternde PC-9-Zellen.Die EGFR-Sequenzierung zeigt, dass PC-9-Zellen 15 Basenpaarlöschungen in EGFR exon 19 und Wildtyp EGFR in exon 20 aufweisen. Afatinib-resistente Ein- und Zweizelllinienzellen weisen jedoch eine Verstärkung des Wildentyps EGFR exon 19 auf. Afatinib-resistente Zelllinie drei Zellen enthalten die gleichen 15 Basenpaar Deletionen in EGFR Exon 19 wie in PC-9-Zellen, aber eine Punktmutation in T790M wird in EGFR exon 20 beobachtet.Das Zellwachstum kann recht langsam werden, wenn die Inhibitorkonzentration nahe dem IC-50-Wert liegt. Diskutieren Sie nicht über Kultur, da sich die Zelle nach und nach weiter ausbreiten wird. Diese Strategien wurden entwickelt, um die Bedingungen nachzuahmen, unter denen Krebspatienten klinisch relevante Resistenzen entwickeln, um erworbene Resistenzmechanismen zu bewerten und sichere und wirksame therapeutische Strategien zu entwickeln.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Doppelte Resistenz gegen EGFR-TKI und traf TKI etablieren in Lunge Adenokarzinom Zellen In Vitro mit einem 2-stufigen Dosiseskalation Verfahren

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Forschung

Krebsforschung

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopen Transplantation von Phänomen Lungenzellen Adenokarzinom, PD-L1 Ausdruck zu studieren

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale Stammzellen isoliert von Pulpagewebe und Kokultur mit Krebszellen ihre Interaktionen zu untersuchen

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Strahlenempfindlichkeit von Krebsstammzellen in Lungenkrebszelllinien

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Pankreas-Ductal Adenokarzinom-Organoidmodellen

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analyse der Seitenpopulation in soliden Tumorzelllinien

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur und Kryokonservierung von Ösophagus-Adenokarzinom-Organoiden: Vor- und Nachteile für die Einzelzellverdauung

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...