Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
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고급 암 번역 연구소 회원에게 영어 편집에 대한 그들의 사려 깊은 의견과 편집에 감사드립니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI (교부수 : 16K09590 ~ T.Y.)에 의해 지원되었습니다.

1. 독립형 아파티닙 내성 PC-9 세포주 3개 구축
<ol><li>3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테테라졸륨 브로마이드(MTT) 분석법을 사용하여 PC-9 세포에 대한 초기 아파티닙 노출 농도의 결정
	<ol>
<li>배양 PC-9 세포는 태아 소 혈청(10%), 페니실린(100 U/mL), 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 함유하는 성장 배지에서 세포 배양에서 5% CO2 인큐베이터에서 5% CO2 인큐베이터에서 처리하였다.</li>
...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

여기에서, 우리는 3개의 독립적인 afatinib 저항하는 세포주를 설치하는 방법을 기술하고 부모 PC-9 세포에 비교하여 이 세포를 특징으로 합니다. 단계적으로 복용량 에스컬레이션 노출에 의해, 부모 PC-9 세포의 기간 동안 afatinib에 저항을 획득 10-12 개월. 임상적으로, EGFR TKIs에 대한 저항 기전은 이질적이며, 따라서, 아파티닙을 사용하여 초기 처리 후, PC-9 세포를 3개의 독립적인 p100 요리로 나누어 아?...

5개의 티로신 키나아제 억제제, 표적표피 성장 인자 수용체(EGFR), 게피티닙, 에로티닙, 아파티닙, 다코미티닙, 및 오시메르티닙을 포함한 현재 EGFR 돌연변이 양성 비소세포 폐 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 암 (NSCLC). 지난 10 년간, 그 같은 환자를 위한 치료는 새로운 잠재적인 EGFR-TKIs의 발견과 극적인 발달을 겪었습니다. 폐 선암종 환자 중 EGFR의 체세포 돌연변이는 아시아인의 약 50 %와 백인 환자의 15 %에서 확인됩니다1. EGFR에서 가장 흔한 돌연변이는 EGFR 엑손(19)2에서EGFR 엑손 21 및 15 염기 쌍(bp) 삭제에서 L858R 점 돌연변이이다. NSCLC를 가진 EGFR 돌연변이 양성 환자에서, EGFR-TKIs는 백금 doublet 화학요법의이전 표준에 비해 반응 비율 및 임상 결과를 향상합니다 3.
Gefitinib 및 에로티닙은 최초로 승인된 소분자 억제제였으며 일반적으로 1세대 EGFR TKIs로 지칭된다. 이러한 EGFR TKIs는 ATP와 경쟁하여 티로신 키나아제 활성을 차단하고 ATP 결합 부위에 가역적으로 결합한다4. 아파티닙은 EGFR의 티로신 키나아제 도메인에 비가역적이고 공유적으로 결합하는 2세대 EGFR TKI이며 범인간 EGFR 패밀리 억제제5로서특징이 있다.
NSCLC를 가진 환자에 있는 이 치료의 극적인 이득에도 불구하고, 취득한 저항은 불가피합니다. 1 세대 및 2 세대 EGFR TKIs에 대한 가장 일반적인 저항 메커니즘은 EGFR exon 20에서 T790M 돌연변이의 출현이며, 이는 종양 샘플 6,7,8의50-70 %에 존재한다. 다른 저항 기전은 우회 신호 (MET, IGF1R 및 HER2), 소세포 폐암으로의 변환, 및 전임상 및 임상적으로 발생하는 상피-중간엽 전이의 유도를 포함한다. EGFR TKIs에 대한 저항 메커니즘은 이기종이다. 전임상 연구에서 새로운 내성 메커니즘을 식별함으로써, 내성을 극복하기 위해 새로운 치료법을 개발할 수 있다. 환자에게 임상적 이점을 극대화하는 최적의 서열 요법은 내성 메커니즘 및 치료 적 표적을 고려해야 한다.
그것은 모든 후속 실험의 기초이기 때문에, 올바른 부모의 세포줄을 선택하는 것이 필수적이다. 선택 전략은 임상 적 관련성으로 시작됩니다. 화학 요법과 방사선 순진한 세포줄을 선택할 필요가 있습니다. 이전 화학요법 및/또는 방사성 치료는 내성 경로의 변경 및 약물 내성 마커의 발현의 변화를 유도할 수 있다. 본 연구에서, EGFR 엑슨 19에서 15 bp 삭제를 운반하는 PC-9 세포는, afatinib에 취득한 저항의 설치를 위해 이용됩니다. 이 세포주 세포주 환자는 일본 NSCLC 환자에서 유래하였고, 이들은 이전에 화학요법과 방사선을 받지 않았다.
아파티닙은 매일 구두로 투여되기 때문에, 세포가 아파티닙의 존재 내에서 지속적으로 배양되는 체외 내 치료는 임상적으로 관련이 있을 것이다. 실험의 다양한 단계에서 사용되는 약물의 투여량은 선택된 부모 세포주에 대해 최적화되어야 한다. 세포 독성 분석법은 약물의 약물 동력학 정보와 비교되어야하는 적합한 약물 범위를 결정하는 데 사용될 수 있습니다.
선택 과정 전반에 걸쳐, 세포의 전체 집단은 단일 그룹으로 유지된다; 복제 또는 기타 분리 방법은 사용되지 않습니다. 세포는 먼저 약물의 낮은 수준에 지속적으로 노출됩니다. 이어서, 세포가 약물의 존재 속에서 성장하도록 적응한 후, 약물의 투여량은 약물의 최종 최적 용량으로 서서히 증가한다10,11. 대안적으로, 펄스 약물 투여 또는 돌연변이 발생은 약물 치료(12,13)이전에 수행되는 저항성 세포를 선택하는데 사용될 수 있다. 불행히도 약물 내성이 발병하지 않는 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 선택 전략은 임상적으로 관련된 저항을 재건하기 위한 암 환자의 조건을 모방하는 것을 목표로 개발됩니다. 때로는 약물 내성의 메커니즘과 관련된 분자 변화를 식별하기 위해 높은 약물 농도가 사용됩니다. 이 모델은 임상적으로 관련성이 낮아집니다.
여기서, 우리는 EGFR 엑손(19)에서 15bp 의 탈착을 수용하는 PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 afatinib 내성 세포주를 확립하는 방법뿐만 아니라 아파티닙 내성 세포주들의 초기 특성화를 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

분자 표적 억제제에 대한 획득된 내성은 암 치료에 심각한 문제이다. 폐암은 대부분의 국가에서 암 관련 죽음의 주요 원인 남아 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)-활성화 돌연변이와 같은"종양발생 드라이버 돌연변이"의 발견, EGFR 티로신 키나아제 억제제(TKIs)의 분자 표적제의 후속 개발(gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, 및 osimertinib) 최근 수십 년 동안 극적으로 변경 된 폐암 치료. 그러나, 이들 약물은 EGFR-활성화 돌연변이를 운반하는 비소세포 폐암(NSCLC)을 가진 환자에서 여전히 효과적이지 않다. 후천성 저항에 이어, NSCLC의 전신 진행은 EGFR 돌연변이 양성 NSCLC를 가진 환자 를 치료하는 데 중요한 장애물로 남아 있다. 여기서, 우리는 EGFR 엑손 19에서 EGFR 쌍 삭제의 EGFR 활성화 돌연변이를 품고 있는 NSCLC PC-9 세포로부터 3개의 독립적인 획득된 afatinib 내성 세포주를 확립하기 위한 단계적 투여량 에스컬레이션 방법을 제시한다. 3개의 독립적인 afatinib 저항 세포주를 특성화하는 방법은 간략하게 제시된다. EGFR TKIs에 대한 획득된 저항 메커니즘은 이기종이다. 따라서 EGFR-TKIs에 대한 후천성 저항성을 가진 다중 세포주를 검사해야 합니다. 10 12 개월이 단계별 복용량 에스컬레이션 접근 방식을 사용 하 여 획득 된 저항세포를 얻을 필요. 새로운 취득한 저항 기계장치의 발견은 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다.

단계적 투여량-에스컬레이션 절차를 사용하여 PC-9 세포로부터 3개의 아파티닙 내성 세포주를 확립하기 위한 스키마는 도1에 나타내고 있다. 도 2는 아파티닙의 농도가 증가함에 따라 부모PC-9 세포의 세포 증식의 감소를 나타내며, 이는 PC-9 세포가 아파티닙 노출에 민감하다는 것을 나타낸다. 도 3은 3개의 ?...

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Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

아파티닙 내성 폐 선암 종 PC-9 세포주 의 설립 및 특성은 아파티닙의 증가 복용량으로 개발

폐 선암종 PC-9 세포로부터 아파티닙 내성 세포주를 확립하는 방법이 개발되었고, 내성 세포가 특징지어졌다. 내성 세포는 비소세포 폐암 환자에게 적용되는 표피 성장인자 수용체 티로신 키나아제 억제제 내성 메커니즘을 조사하는데 사용될 수 있다.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

새로운 획득한 저항 기계장치의 연구 결과는 내성 암 내성 및 절제성 암을 가진 환자에 있는 더 효과적이고 안전한 치료 전략의 발달에 기여할 것입니다. 불행히도 약물 내성이 발달하지 못한 경우는 일반적으로 보고되지 않습니다. 이 단계적 투여량 에스컬레이션 방법은 획득 저항 세포를 얻기위한 가장 신뢰할 수있는 기술로 간주됩니다.적절한 아파티닙 저항 농도를 결정하기 위해, 배양 PC-9 세포는 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 10센티미터 세포 배양 처리 접시에서 성장 배지에서. 성장 중간 농도의 밀리리터 당 4 배-10-4 세포에서 PC-9 세포를 다시 중단하고, 96 웰 마이크로 플레이트에서 잘 세포 현탁액의 50 마이크로 리터에 세포를 시트. 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 인큐베이션 을 한 후, 50 마이크로리터의 아파티니브 용액을 잘 처리하고, 6개의 표시 농도의 복제에서, 컬 배양 인큐베이터에서 96시간 배양 후, MTT 염료 15마이크로리터를 각각 잘 첨가한다.세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후, 각 웰에 100마이크로리터의 용용성/스톱 용액을 추가하고 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이터로 되돌리십시오. 다음 날에는 마이크로플레이트 판독기에서 570나노미터의 광학 밀도를 측정합니다. 지속적인 아파티닙 노출을 위해, 세포가 수렴에 도달할 때까지 성장 배지의 10 밀리리터를 포함하는 P-100 접시에 있는 배양 PC-9 세포.초기 배양식당 9밀리리터의 3개의 새로운 P-100 접시로 하위 배양을 옮기고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 다음 날 아침, 3개의 배양 요리의 각 세트에 afatinib의 반 최대 억제 농도의 0.1 나노 몰라, 또는 1/10을 추가합니다. 아파티닙 처리 된 세포가 하위 conconfluent될 때, 철저하게 배양을 혼합하기 위해 1 밀리리터 파이펫을 사용하고, 새로운 P-100 요리에서 신선한 성장 매체의 9 밀리리터에 각 접시에서 세포의 1 밀리리터를 전송합니다.새로운 배양에 10%에서 20% 더 높은 농도의 아파티닙농도를 추가하여, 배양이 10~12개월 동안 수렴에 도달할 때마다 단계적 용량 에스컬레이션에 의한 아파티닙 농도를 증가시다. 1개의 micromolar의 afatinib 농도가 도달하면, 세포가 아파티닙 저항을 개발했다는 것을 확인하기 위하여 입증된 대로 MTT 분석기를 수행합니다. 세포주에 대한 성장 곡선을 결정하기 위해, 배양 부모 PC-9 및 세포 배양 인큐베이터에서 성장 배지에서 3개의 아파티닙 내성 세포주 24시간.각 배양에서 세포를 성장 중간 농도의 밀리리터당 5배-10-3세포로 재보중단하고, 96웰 마이크로플레이트에서 각 세포 집단의 12 100마이크로리터 복제를 시트한다. 그런 다음 0일, 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 동안 MTT 분석을 시연한 대로 수행하고 적절한 통계 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 결과를 플롯합니다. 표피 성장 인자 수용체 또는 EGFR 게놈 DNA 발현의 변화를 규명하기 위해, 역전사 폴리머라제 사슬 분석에 의하여, 제조업체의 지시에 따라 DNA 정화 키트를 사용하여 관심 있는 세포 배양으로부터 게놈 DNA를 분리한다.분광계에서 격리된 게놈 DNA의 25나노그램 마이크로리터 농도의 농도를 측정합니다. 그런 다음 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 50 나노그램의 게놈 DNA를 증폭시키고 형광계 역실사 중 폴리머라제 중합체 연쇄 반응 검출 시스템을 사용하여 결과를 분석한다. EGFR 게놈 DNA 발현의 체질을 시퀀싱하여 식별하려면 EGFR 엑슨 19 에서 21까지 특정 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭시한다.그런 다음 제조업체의 지시에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 증폭된 PCR 제품을 정화하고 앰플리턴을 시퀀싱합니다. 서양 얼룩 분석에 의한 표피 성장 인자 수용체 단백질 발현의 변화를 식별하려면 24시간 동안 아파티닙으로 세포를 치료한다. 24시간 후, 세척당 배양당 5밀리리터의 얼음-차가운 PBS로 세포 배양을 2회 세척합니다.방사선 면역 강수량 분석 버퍼에서 세포를 lyse, 1 %의 프로테아제 억제제 칵테일과 인산 염 억제제 칵테일 2 및 3 섭씨 4도에서 30 분 보충. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 용액을 수집합니다. 용액 샘플의 단백질 농도를 결정하기 위해 bicinchoninic acid 분석기를 사용합니다.단백질 샘플을 마이크로리터 농도당 0.5 또는 마이크로그램 1개, 4-X 샘플 버퍼로 조정하고 샘플을 섭씨 96도에서 5분간 끓입니다. 시료의 서쪽 블롯 분석을 위해 에탄올 세척 유리 플레이트와 스페이서를 조립하고 적절한 실험 용 보충제로 8 % 폴리 아크릴 라미드 젤로 금형을적재합니다. 겔이 중합되는 동안, 적절한 금형에 스태킹 젤 용액을 추가하고 빗을 삽입하고 스태킹 젤이 실온에서 20~30분 동안 중합되도록 합니다.두 젤이 중합되면 전기 전구 장치에 배치하고 탱크를 실행 버퍼로 채웁니다. 그런 다음 각 단백질 샘플의 20-30 마이크로리터 부피를 각 우물에 적재하고 180볼트에서 젤을 실행합니다. 약 60분 후에 전기전도를 멈추고, 염료 전면이 젤에서 흘러 나오면, 트웬으로 보충된 삼중 완충식식염으로 젤을 1~2분 간 세척합니다.단백질을 폴리비닐리덴 불소 막에 반건조 블로팅으로 1시간 1/2시간 동안 300밀리암페어의 일정한 전류로 전달한다. 실온에서 1시간 동안 트리스 버퍼식식염수와 트위엔 용액으로 희석된 5% 무지방 건조 우유로 멤브레인을 차단합니다. 다음으로, 하룻밤 사이에 4도에서 관심있는 적절한 항체로 멤브레인을 조사하십시오.다음 날 아침, 실온에서 1~1/2시간 동안 적절한 이차 항체에 멤브레인을 노출하기 전에 세척당 신선한 트리스 버퍼링 식염수 3개를 세척하여 멤브레인을 세척합니다. 그런 다음 세척당 신선한 트리스 버퍼식식염수로 멤브레인을 5번 세척하고 필름을 사용하여 신호 시각화를 위한 향상된 화학 발광 용액에 멤브레인을 노출시킵니다. 여기서, 아파티닙의 농도 증가에 대응하여 부모 PC-9 세포의 세포 증식에서 관찰되는 감소가 도시되고, PC-9 세포가 아파티닙 노출에 민감하다는 것을 확인한다.그러나, 3개의 아파티닙 저항하는 세포주 중 어느 것도 아파티닙 노출 하에서 세포 증식의 억제를 보여주지 않는다. Afatinib 내성 세포주 부모 PC-9 세포보다 크게 느린 성장 곡선을 나타낸다. 아파티닙 내성 세포는 부모 PC-9 세포보다 EGFR 게놈 DNA 및 EGFR 단백질 발현의 상당히 높은 수준을 표현한다.EGFR 시퀀싱은 PC-9 세포가 EGFR 엑슨(19)에서 15개의 염기 쌍 삭제, 그리고 엑슨(20)의 야생형 EGFR을 나타낸다는 것을 보여준다. 아파티닙 내성 1세포와 2개의 세포주 세포는, 그러나, 야생형 EGFR 엑온 19의 증폭을 나타낸다. 아파티닙 내성 세포주 3세포는 PC-9 세포와 같이 EGFR 엑슨 19에서 동일한 15개의 염기쌍 삭제를 함유하고 있으나, T790M의 포인트 돌연변이는 EGFR 엑슨 20에서 관찰된다.억제제 농도가 IC-50 값에 가까우면 세포 성장이 매우 느려질 수 있습니다. 세포가 점진적으로 확산되기 때문에 문화에 대해 논의하지 마십시오. 이러한 전략은 암 환자가 획득 한 저항 메커니즘을 평가하고 안전하고 효과적인 치료 전략을 개발하기 위해 임상 관련 저항을 개발하는 조건을 모방하기 위해 개발되었다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

연구

암 연구학

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

폐암 세포줄에 있는 암 줄기 세포의 방과성

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

식도 선암종 오가노이드의 하위 배양 및 동결 보존 : 단일 세포 소화를위한 장단점

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...