Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
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Agradecemos ao membro do Instituto avançado de pesquisa translacional de câncer por seus comentários pensativos e Editage para sua assistência com a edição de idioma inglês. Este trabalho foi apoiado por JSPS KAKENHI (número da subvenção: 16K09590 a

1. criação de três linhas de células PC-9 resistentes ao Afatinib independentes
<ol><li>Determinação da concentração inicial de exposição de afatinib para células PC-9 utilizando o ensaio de 3-(4, 5-dimetilthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)
	<ol>
<li>Cultura PC-9 células em meio de crescimento contendo soro fetal bovino (10%), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma célula-cultura tratada 10-cm prato em uma incubadora de CO2 de 5% a 37 ° c.</li>
		<li...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independentes do afatinib-resistentes e caracterizamos estas pilhas por comparação às pilhas PC-9 parentais. Por exposição Stepwise da escalada de dose, as pilhas PC-9 parentais adquiriram a resistência ao afatinib durante um período de 10-12 meses. Clinicamente, os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos e, portanto, após o tratamento inicial com afatinib, as células PC-9 foram divididas em três pratos P100 independ...

Cinco inibidores da tirosina quinase, que visam o receptor do fator de crescimento epidérmico (TFGE), incluindo Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib estão atualmente disponíveis para o tratamento de doentes com pulmão de células não pequenas com mutação EGFR cancro (NSCLC). Durante a década passada, as terapias para tais pacientes sofreram o desenvolvimento dramático com a descoberta de EGFR-TKIs novo potencial. Entre os pacientes com adenocarcinoma de pulmão, mutações somáticas na Tfge são identificadas em aproximadamente 50% da Ásia e 15% dos pacientes caucasianos1. As mutações mais comuns no EGFR são uma mutação de ponto L858R em exon EGFR 21 e 15 eliminações de par base (BP) no exon EGFR 192. Em doentes com mutação positiva EGFR com NSCLC, o EGFR-TKIs melhora as taxas de resposta e os resultados clínicos em comparação com o padrão anterior de quimioterapia de dúvida de platina3.
Gefitinib e erlotinib foram os primeiros inibidores da molécula pequena aprovados e são geralmente referidos como TKIs de primeira geração de EGFR. Esses EGFR TKIs bloqueiam a atividade da tirosina quinase competindo com ATP e vinculando reversivelmente a sites de associação de ATP4. O afatinib é um EGFR de segunda geração TKI que se liga irreversivelmente e covalentemente ao domínio da tirosina quinase do EGFR e é caracterizado como um inibidor da família EGFR Pan-humano5.
Apesar do benefício dramatical destas terapias nos pacientes com NSCLC, a resistência adquirida é inevitável. O mecanismo de resistência mais comum contra a EGFR tkis de primeira e segunda geração é o surgimento da mutação T790M no EGFR exon 20, que está presente em 50-70% das amostras tumorais6,7,8. Outros mecanismos de resistência incluem sinais de bypass (para MET, IGF1R e HER2), transformação para câncer de pulmão de pequenas células e indução de transição epitelial-mesenquimais, que ocorrem pré-clinicamente e clinicamente9. Os mecanismos de resistência aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Ao identificar novos mecanismos de resistência em estudos pré-clínicos, pode ser possível desenvolver terapêutica inovadora para superar a resistência. As terapias ideais da seqüência que maximizam o benefício clínico aos pacientes devem considerar os mecanismos da resistência e o alvo terapêutico.
É imperativo escolher a linha de célula parental direita, porque é a base de todos os experimentos subseqüentes. As estratégias de seleção começam com relevância clínica; é necessário escolher uma linha celular ingênua de quimioterapia e radiação. O tratamento quimioterapêutico e/ou radiativo prévio pode induzir a alteração de vias de resistência e alterações da expressão de marcadores de resistência a fármacos. Neste estudo, as células PC-9, que transportam 15 deleções BP no exon 19 do EGFR, são empregadas para o estabelecimento de resistência adquirida ao afatinib. Esta linha de pilha foi derivada de um paciente japonês de NSCLC, que não recebesse a quimioterapia e a radiação prévia.
Uma vez que o afatinib é administrado por via oral numa base diária, o tratamento in vitro contínuo, onde as células são cultivadas constantemente na presença de afatinib, seria clinicamente relevante. A dose de medicamentos utilizados nas várias etapas do experimento deve ser otimizada para a linha celular parental selecionada. Um ensaio de citotoxicidade pode ser utilizado para determinar uma gama de fármacos adequado, que deve ser comparável à informação farmacocinética da droga.
Ao longo do processo de seleção, toda a população de células é mantida como um único grupo; clonagem ou outros métodos de separação não são utilizados. As células são primeiro continuamente expostos a um baixo nível da droga. Subseqüentemente, depois que as pilhas se adaptarem para crescer na presença da droga, a dose da droga é aumentada lentamente à dose óptima final da medicina10,11. Alternativamente, um pulso de administração de drogas ou mutagenese pode ser usado para a seleção de células de resistência, que também são realizadas antes do tratamento medicamentoso 12,13. Infelizmente, casos em que a resistência à droga não se desenvolve geralmente não são relatados. As estratégias de seleção são desenvolvidas com o objetivo de tentar imitar as condições dos pacientes oncológicos para reconstruir a resistência clinicamente relevante. Às vezes, para identificar alterações moleculares associadas a mecanismos de resistência a fármacos, é utilizada uma alta concentração de fármacos. Este modelo torna-se menos clinicamente relevante.
Aqui, nós descrevemos um método para estabelecer três linhas de pilha independente afatinib-resistentes das pilhas PC-9 que abrigando deleções de 15 BP no exon 19 de EGFR assim como a caracterização inicial das linhas de pilha afatinib-resistentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

A resistência adquirida aos inibidores do alvo molecular é um problema severo na terapia de cancro. O câncer de pulmão continua sendo a principal causa de morte relacionada ao câncer na maioria dos países. A descoberta de "mutações do condutor oncogênico", tais como o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR)-ativando mutações, e o desenvolvimento subsequente de agentes moleculares alvejados de inibidores da tirosina quinase de EGFR (tkis) (Gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib e osimertinib) modificaram dramaticamente o tratamento do cancro do pulmão nas últimas décadas. No entanto, essas drogas ainda não são eficazes em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) portadoras de Mutações ativadoras de EGFR. Após a resistência adquirida, a progressão sistémica do NSCLC continua a ser um obstáculo significativo no tratamento de doentes com CPNPC com mutação EGFR positiva. Aqui, nós apresentamos um método Stepwise do escalonamento de dose para estabelecer três linhas de pilha de afatinib-resistentes adquiridas independentes das pilhas de NSCLC PC-9 que abrigando mutações EGFR-ativando de deleções do par 15-base em EGFR exon 19. Os métodos para caracterizar as três linhas de pilha independentes do afatinib-resistência são apresentados momentaneamente. Os mecanismos de resistência adquiridos aos TKIs do EGFR são heterogêneos. Conseqüentemente, as linhas de pilha múltiplas com resistência adquirida a EGFR-TKIs devem ser examinadas. Dez a doze meses são exigidos para obter as linhas de pilha com resistência adquirida usando esta aproximação Stepwise da escalada de dose. A descoberta de novos mecanismos de resistência adquiridos contribuirá para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais efetivas e seguras.

O esquema para estabelecer três linhas celulares de resistência à afatinib de células PC-9 usando um procedimento de escalonamento de dose Stepwise é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra uma diminuição da proliferação celular de células PC-9 parentais, pois a concentração de afatinib é aumentada, indicando que as células PC-9 são sensíveis à exposição ao afatinib. A Figura 3 mos...

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Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Estabelecimento e caracterização de três linhagens de células PC-9 de adenocarcinoma de pulmão resistentes ao Afatinib desenvolvidas com doses crescentes de Afatinib

Um método para estabelecer linhas de pilha da afatinib-resistência das pilhas do adenocarcinoma do pulmão PC-9 foi desenvolvido, e as pilhas resistentes foram caracterizadas. As células resistentes podem ser usadas para investigar mecanismos de resistência a inibidores da tirosina quinase do receptor de fator de crescimento epidérmico, aplicáveis para pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

O estudo de novos mecanismos de resistência adquiridos contribuirá para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes e seguras em pacientes com câncer resistente ao agente cancerígeno e ressecáveis. Infelizmente, os casos em que a resistência às drogas não se desenvolveu geralmente não são relatados. Este método de escalonamento de dose stepwise é considerado a técnica mais confiável para a obtenção de células de resistência adquirida.Para determinar a concentração adequada de resistência ao afatinib, cultura células PC-9 em meio de crescimento em um prato tratado de cultura celular de 10 centímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Resuspenque as células PC-9 em quatro células de quatro a quatro por mililitro de concentração média de crescimento, e acontece as células a 50 microliters de suspensão celular por poço em uma microplata de 96 poços. Após uma incubação durante a noite na incubadora de cultura celular, trate as células com 50 microliters de solução de afatinibe por poço, a seis réplicas das concentrações indicadas, e após uma incubação de 96 horas na incubadora de cultura de cull, adicione 15 microliters de corante MTT a cada poço.Após quatro horas na incubadora de cultura celular, adicione 100 microliters de solução de solubilização/parada a cada poço, e devolva a placa à incubadora durante a noite. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 570 nanômetros em um leitor de microplacões. Para exposição contínua ao afatinib, cultura células PC-9 em pratos P-100 contendo 10 mililitros de meio de crescimento até que as células atinjam a subconfluência.Transfira as culturas subconfluentes em três novos pratos P-100 de nove mililitros de meio de crescimento por prato de cultura inicial, e devolva as células para a incubadora de cultura celular. Na manhã seguinte, adicione 0,1 nanomolar, ou 1/10 da concentração inibitória semi-máxima de afatinib, a cada conjunto de três pratos culturais. Quando as células tratadas com afatinib se tornarem subconfluentes, use uma pipeta de um mililitro para misturar completamente as culturas, e transfira um mililitro de células de cada prato para nove mililitros de meio de crescimento fresco em novos pratos P-100.Adicione concentrações de afatinibe de 10% a 20% maiores às novas culturas, aumentando a concentração de afatinibe por escalonamento de dose passo a passo cada vez que as culturas atingem a subconfluência durante um período de 10 a 12 meses. Quando uma concentração de afatinib de um micromolar é atingida, realize o ensaio MTT como demonstrado para confirmar que as células desenvolveram resistência afatinib. Para determinar a curva de crescimento das linhas celulares, cultura parental PC-9 e as três linhas celulares resistentes ao afatinib em meio de crescimento na incubadora de cultura celular por 24 horas.Resuspend as células de cada cultura em uma célula cinco vezes 10-10-para-o-terço por mililitro de concentração média de crescimento, e assento 12 100-microliter replica de cada população celular por poço em uma microplato de 96 poços. Em seguida, realize o ensaio MTT nos dias zero, um, dois, três, cinco e sete da cultura como demonstrado, e plote os resultados usando um programa de análise estatística apropriado. Para identificar alterações no receptor do fator de crescimento epidérmico, ou expressão de DNA genômico EGFR, por análise da cadeia de polimerase de transcriptase reversa, isole o DNA genômico da cultura celular de interesse usando um kit de purificação de DNA de acordo com as instruções do fabricante.Meça a concentração de 25 concentrações de nanograma-microliter do DNA genômico isolado em um espectrofotômetro. Em seguida, amplie 50 nanogramas de DNA genômico usando uma mistura mestre verde SYBR, e analise os resultados usando um sistema de detecção de reação em cadeia de transcriptase reversa baseado em fluorescência. Para identificar alterações na expressão de DNA genômico EGFR por sequenciamento, amplie o DNA genômico usando primers específicos para exons EGFR 19 a 21.Em seguida, purifique os produtos PCR amplificados usando um kit de purificação PCR de acordo com as instruções do fabricante e sequencie os amplicons. Para identificar alterações na expressão de proteína do receptor do fator de crescimento epidérmico pela análise da mancha ocidental, trate as células com afatinibe por 24 horas. Depois de 24 horas, lave as culturas celulares duas vezes com cinco mililitros de PBS gelado por cultura por lavagem.Lyse as células em tampão de ensaio radioimunoprecipitação, complementado com coquetel inibidor de 1%protease e inibidores de fosfatase coquetel dois e três por 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, recolhe os lises por centrifugação. Use o ensaio de ácido bicinchonínico para determinar a concentração proteica das amostras de lisato.Ajuste as amostras de proteínas para 0,5, ou um micrograma por concentrações de microliter, em tampão de amostra de 4 X, e ferva as amostras a 96 graus Celsius por cinco minutos. Para a análise das manchas ocidentais das amostras, monte placas de vidro e espaçadores limpos com etanol e carregue o molde com um gel de poliacrilamida de 8% com os suplementos experimentais apropriados. Enquanto o gel estiver polimerizando, adicione a solução de gel de empilhamento a um molde apropriado, insira o pente e deixe o gel de empilhamento polimerizar por 20 a 30 minutos à temperatura ambiente.Quando ambos os géis tiverem polimerizados, coloque-os no aparelho de eletroforese e encha o tanque com tampão de corrida. Em seguida, carregue um volume de 20 a 30 microliter de cada amostra de proteína em cada poço, e execute o gel a 180 volts. Pare a eletroforese após aproximadamente 60 minutos, uma vez que a frente de corante flua para fora do gel, e lave o gel com soro fisiológico tris-tampão, complementado com Tween, por um a dois minutos.Transfira as proteínas para uma membrana de flúor de polivinida por manchas semi-secas por uma e meia hora em uma corrente constante de 300 miliamperes. Bloqueie a membrana com leite seco 5% sem gordura diluído com solução salina tris-tamponada mais Tween por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, teste a membrana com os anticorpos apropriados de interesse a quatro graus Celsius durante a noite.Na manhã seguinte, lave as membranas com três lavagens de 10 minutos de soro fisiológico fresco por lavagem antes de expor a membrana ao anticorpo secundário apropriado por uma a uma e 1/2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, lave a membrana cinco vezes com soro fisiológico fresco por lavagem e exponha a membrana à solução aprimorada de chemiluminescência para visualização de sinais usando filmes. Aqui, ilustra-se a diminuição observada na proliferação celular das células pc-9 parentais em resposta ao aumento das concentrações de afatinibe, confirmando que as células PC-9 são sensíveis à exposição ao afatinibe.No entanto, nenhuma das três linhas celulares resistentes ao afatinib demonstra uma supressão da proliferação celular sob exposição afatinibe. As linhas celulares resistentes ao afatinib apresentam curvas de crescimento significativamente mais lentas do que as células pc-9 parentais. As células resistentes ao afatinib expressam níveis significativamente mais elevados de DNA genômico EGFR e expressão proteica EGFR do que as células pc-9 parentais.O sequenciamento EGFR demonstra que as células PC-9 exibem 15 exclusões de pares de base no EGFR exon 19, e do tipo selvagem EGFR no exon 20. As células de linha de células resistentes afatinib, no entanto, exibem uma amplificação do exon EGFR tipo selvagem 19. As células da linha de células resistentes ao afatinib contêm as mesmas exclusões de par de 15 bases em exon 19 EGFR como em células PC-9, mas uma mutação de ponto em T790M é observada no exon EGFR 20.O crescimento celular pode se tornar bastante lento quando a concentração do inibidor está perto do valor IC-50. Não discuta cultura, pois a célula continuará a proliferar gradualmente. Essas estratégias foram desenvolvidas para imitar as condições em que os pacientes com câncer desenvolvem resistência clinicamente relevante para avaliar mecanismos de resistência adquiridos e desenvolver estratégias terapêuticas seguras e eficazes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Estabelecimento de dupla resistência de EGFR-TKI e conheci-TKI em Lung Adenocarcinoma células In Vitro com um procedimento passo-2 Dose-escalada

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Pesquisa do câncer

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radiosensibilidade de células-tronco cancerosas em linhas celulares de câncer de pulmão

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolamento e caracterização de modelos organóides de adenocarcinoma ductatopansa pâncreas derivados do paciente

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subcultura e Criopreservação de Organoides Adenocarcinoma Esofágico: Prós e Contras para Digestão Celular Única

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...