Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Мы благодарим члена Института передовых исследований рака за их вдумчивые комментарии и Editage за их помощь в редактировании английского языка. Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI (грант номер: 16K09590 до T.Y.).

1. Создание трех независимых Afatinib устойчивых PC-9 сотовых линий
<ol><li>Определение первоначальной концентрации воздействия афатиниба для клеток ПК-9 с использованием 3-(4,5-диметилтиазол-2-yl)-2,5- дифениллеттразолий бромид (МТТ)
	<ol>
<li>Культура PC-9 клеток в среде роста, содержащей сыворо...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Здесь мы описали метод создания трех независимых афатиниб-устойчивых клеточных линий и охарактеризовали эти клетки по сравнению с родительскими клетками PC-9. Пошагово облучение дозы, родительские клетки PC-9 приобрели устойчивость к afatinib в течение 10-12 месяцев. Клинически, механизмы сопр...

Пять ингибиторов тирозина киназы, ориентированные на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), в том числе гефитиниб, эрлотиниб, афатиниб, дакомитиниб и осимертиниб в настоящее время доступны для лечения пациентов с EGFR мутацией-положительной немелкоклеточной легкой рака (NSCLC). За последнее десятилетие, терапии для таких пациентов претерпели драматические разработки с открытием новых потенциальных EGFR-TKIs. Среди пациентов с аденокарциномой легких соматические мутации в ЭГФР выявлены примерно у50% азиатских и 15% кавказских пациентов 1. Наиболее распространенными мутациями в EGFR являются мутация точки L858R в EGFR exon 21 и 15 базовых парах (bp) удаления в EGFR exon 192. В EGFR мутационно-положительных пациентов с NSCLC, EGFR-TKIs улучшить скорость ответа и клинические исходы по сравнению с предыдущим стандартом платиновой химиотерапии дублет3.
Gefitinib и эрлотиниб были первыми утвержденными ингибиторами малых молекул и, как правило, называются EGFR TKIs первого поколения. Эти EGFR ТКИ блокируют активность тирозина киназы, конкурируя с АТФ и обратимо связывая с ат-плехаумом4. Afatinib является второе поколение EGFR TKI, что необратимо и ковалентно связывается с тиразин киназы области EGFR и характеризуется как пан-человеческого ингибитора семьи EGFR5.
Несмотря на драматическую пользу этих методов лечения у пациентов с NSCLC, приобретенная резистентность неизбежна. Наиболее распространенным механизмом сопротивления против первого и второго поколения EGFR TKIs является появление мутации T790M в EGFRexon 20, которая присутствует в 50-70% образцов опухоли 6,7,8. Другие механизмы сопротивления включают сигналы шунтирования (к MET, IGF1R, и HER2), преобразование в мелкоклеточный рак легких, и индукции эпителиального к мезенхимальному переходу, который происходит до клинически и клинически9. Механизмы сопротивления ЭГФР ТКИ неоднородны. Путем определять новые механизмы сопротивления в доклинических изучениях, может быть по возможности начать новые терапии для того чтобы отжать сопротивление. Оптимальная последовательность терапии, которые максимизируют клиническую пользу для пациентов должны рассмотреть механизмы сопротивления и терапевтической цели.
Крайне важно выбрать правильную родительскую клеточную линию, так как она является основой всех последующих экспериментов. Стратегии отбора начинаются с клинической значимости; необходимо выбрать химиотерапию и лучевую наивную клеточную линию. Предыдущая химиотерапевтическая и/или радиационная обработка может вызвать изменение путей сопротивления и изменения выражения маркеров лекарственной резистентности. В этом исследовании, PC-9 клетки, несущие 15 bp удаления в EGFR exon 19, используются для создания приобретенных устойчивость к afatinib. Эта клеточная линия была получена от японского пациента NSCLC, который не получил предварительной химиотерапии и радиации.
Потому что afatinib вводится устно на ежедневной основе, непрерывное лечение в пробирке, где клетки культивируются постоянно в присутствии afatinib будет клинически актуальным. Доза препаратов, используемых в различных этапах эксперимента, должна быть оптимизирована для родительской клеточной линии выбранной. Для определения подходящего лекарственного диапазона можно использовать цитотоксический асссс, который должен быть сопоставим с фармакокинетической информацией препарата.
На протяжении всего процесса отбора вся популяция клеток поддерживается как единая группа; клонирование или другие методы разделения не используются. Клетки сначала постоянно подвергаются воздействию низкого уровня препарата. Впоследствии, после того, как клетки адаптируются к росту в присутствии препарата, дозу препарата медленно увеличивается до конечной оптимальной дозы препарата10,11. Кроме того, пульс препарата-администрации или мутагенеза могут быть использованы для выбора клеток резистентности, которые также выполняются до медикаментозного лечения 12,13. К сожалению, случаи, когда лекарственная устойчивость не развивается, как правило, не сообщаются. Стратегии отбора разрабатываются с целью имитации условий онкологических больных для восстановления клинически релевантной резистентности. Иногда для выявления молекулярных изменений, связанных с механизмами лекарственной устойчивости, используется высокая концентрация препарата. Эта модель становится менее клинически актуальной.
Здесь мы описываем метод создания трех независимых афатиниб-устойчивых клеточных линий из клеток PC-9, укрывающих 15 bp удаления в EGFR exon 19, а также первоначальную характеристику устойчивых к афатинибным клеточным линиям.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

Приобретенная устойчивость к молекулярным ингибиторам целей является серьезной проблемой в терапии рака. Рак легких остается основной причиной смерти, связанной с раком, в большинстве стран. Открытие "онкогенных мутаций драйвера", таких как рецепторэпидермального фактора роста (EGFR)-активирующие мутации, и последующее развитие молекулярных целевых агентов ингибиторов тирозина киназы EGFR (TKIs) (гефитиниб, эрлотиниб, afatinib, dacomitinib, и osimertinib) резко изменили лечение рака легких в последние десятилетия. Тем не менее, эти препараты по-прежнему не эффективны у пациентов с немелкоклеточным раком легких (NSCLC), несущими EGFR-активирующие мутации. После приобретенной резистентности, системное прогрессирование NSCLC остается значительным препятствием в лечении пациентов с мутацией-положительным И ЕНФР NSCLC. Здесь мы представляем пошаговый метод эскалации дозы для создания трех независимых приобретенных афатиниб-устойчивых клеточных линий из NSCLC PC-9 клеток укрывательство EGFR-активирующих мутаций 15-базовых удаляний пары в EGFR exon 19. Кратко представлены методы характеристики трех независимых линий клеток сопротивления афатиниба. Приобретенные механизмы сопротивления ЭГФР ТКИ неоднородны. Поэтому необходимо изучить несколько клеточных линий с приобретенным сопротивлением EGFR-TKIs. Десять-двенадцать месяцев, необходимых для получения клеточных линий с приобретенным сопротивлением, используя этот шаг подход эскалации дозы. Открытие новых механизмов приобретенного сопротивления будет способствовать разработке более эффективных и безопасных терапевтических стратегий.

Схема для создания трех афатиниб-резистентных клеточных линий из клеток PC-9 с помощью поэтапной процедуры эскалации дозы показана на рисунке 1. На рисунке 2 показано снижение пролиферации клеток родительских клеток PC-9 по мере увеличени?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Создание и характеристика трех Afatinib-устойчивых легких аденокарциномы PC-9 Сотовые линии, разработанные с увеличением дозы Afatinib

Разработан метод установления клеточных линий афатиниб-сопротивления из клеток легких Аденокарциномы ПК-9, и были охарактеризованы устойчивые клетки. Устойчивые клетки могут быть использованы для исследования эпидермального фактора роста рецептора тирозина киназы ингибитор-резистентность механизмов, применимых для пациентов с немелкоклеточным раком легких.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Изучение новых механизмов приобретенной резистентности будет способствовать разработке более эффективных и безопасных терапевтических стратегий у пациентов с устойчивыми к раку и ресекаблемым раком. К сожалению, случаи, когда лекарственная устойчивость не развивалась, как правило, не сообщаются. Этот метод эскалации дозы stepwise считается наиболее надежным методом для получения клеток приобретенного сопротивления.Для определения соответствующей концентрации афатиниб-сопротивления, культура PC-9 клеток в среде роста в 10-сантиметровой клеточной культуры обработанных блюдо при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Resuspend PC-9 клетки в четыре раза-10-четыре клетки на миллилитр роста средней концентрации, и место клеток на 50 микролитров клеточной подвески на колодец в 96-ну микроплета. После ночной инкубации в инкубаторе клеточной культуры, лечить клетки с 50 микролитров раствора afatinib на колодец, на шесть репликаций указанных концентраций, и после 96-часовой инкубации в инкубаторе культуры отбраковки, добавить 15 микролитров красителя MTT к каждой хорошо.После четырех часов в инкубаторе культуры клеток, добавить 100 микролитров раствора solubilization/stop к каждой хорошо, и вернуть пластину в инкубатор на ночь. На следующее утро измерьте оптическую плотность на уровне 570 нанометров на считыватель микроплатформ. Для непрерывного воздействия афатиниба, культуры PC-9 клеток в P-100 блюда, содержащие 10 миллилитров среды роста, пока клетки не достигнут субвлияния.Перенесите субвлияние культур в три новых блюда P-100 из девяти миллилитров среды роста на одно начальное блюдо культуры и верните клетки в инкубатор клеточной культуры. На следующее утро добавьте 0,1 наномоляра, или 1/10 половины максимальной ингибирующей концентрации афатиниба, к каждому набору из трех культурных блюд. Когда клетки, обработанные афатинибом, станут субвлиятельными, используйте одноми миллилитровую пипетку, чтобы тщательно смешать культуры, и перенесите один миллилитр клеток из каждого блюда в девять миллилитров свежей среды роста в новых блюдах P-100.Добавьте от 10%до 20%более высоких концентраций afatinib к новым культурам, увеличивая концентрацию afatinib stepwise эскалацией дозы each time культуры достигают subconfluency над 10-к 12-месячным периодом. Когда концентрация afatinib одного микромолара достигнута, выполните анализ MTT, как попродемонстрировано, чтобы подтвердить, что клетки разработали афатиниб-сопротивление. Для определения кривой роста клеточных линий, культуры родительского PC-9 и трех устойчивых к афатинибу клеточных линий в среде роста в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 часов.Resuspend клетки от каждой культуры в пять раз-10-к-третьей клетки на миллилитр роста средней концентрации, и место 12 100-микролитр репликации каждой популяции клеток на колодец в 96-ну микроплета. Затем выполните анализ MTT на нулевом, одном, двух, трех, пяти и семи культурных днях, как было продемонстрировано, и свяжите результаты с помощью соответствующей программы статистического анализа. Для выявления изменений в рецепторе эпидермального фактора роста, или экспрессии геномной ДНК EGFR, путем обратного анализа цепи транскриптазы, изолируйте геномную ДНК от клеточной культуры, представляющих интерес, используя комплект для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя.Измерьте концентрацию 25-нанограммовых микролитровых концентраций изолированной геномной ДНК на спектрофотометре. Затем усилить 50 нанограммов геномной ДНК с помощью SYBR зеленый мастер смеси, и анализировать результаты с помощью флуоресценции основе обратной транскриптазы полимеразы системы обнаружения цепной реакции. Чтобы определить изменения в экспрессии геномной ДНК EGFR путем секвенирования, усилить геномную ДНК с помощью конкретных грунтовок для EGFR экзонов 19 до 21.Затем очистить усиленные продукты ПЦР с помощью комплекта очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, и последовательности amplicons. Для выявления изменений в экспрессии белка рецептора фактора эпидермального роста с помощью западного анализа помарки, лечить клетки с afatinib в течение 24 часов. После 24 часов, мыть клеточные культуры два раза с пятью миллилитров ледяной PBS на культуру за стирку.Lyse клетки в радиоиммунопреципиентации анализ буфера, дополненный 1%protease ингибитор коктейль и ингибиторы фосфатазы коктейль два и три в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию. В конце инкубации собирайте лизы путем центрифугации. Используйте анализ бицинхониновой кислоты для определения концентрации белка лизатных образцов.Отрегулируйте образцы протеина до 0.5, или одного микрограмма в концентрации микролитара, в буфере образца 4-X, и отварить образцы на 96 градусах Celsius на 5 минут. Для западного анализа помарки образцов, собрать этанол очищенные стеклянные пластины и промеченные, и загрузить плесень с 8%полиакриламид гель с соответствующими экспериментальными добавками. В то время как гель полимеризуется, добавьте решение для укладки геля в соответствующую форму, вставьте гребень и дайте гель для укладки полимеризировать в течение 20-30 минут при комнатной температуре.Когда оба геля полимеризуются, поместите их в электрофорезный аппарат и заполните бак бегущим буфером. Затем загрузите один 20-30-микролитровый объем каждого образца белка в каждую хорошо, и запустить гель на 180 вольт. Остановите электрофорез примерно через 60 минут, как только краситель фронт вытекает из геля, и мыть гель с трис-буфер соленый раствор, дополненный Tween, в течение одной-двух минут.Перенесите белки на поливинилиновую фторсодержатую мембрану полусухой блотой в течение одного и 1/2 часов при постоянном токе 300 миллиампер. Заблокив мембрану 5%несжиренным сухим молоком, разбавленным трис-буферным солевым раствором плюс раствор Tween в течение одного часа при комнатной температуре. Далее, зонд мембраны с соответствующими антителами интереса на четыре градуса по Цельсию в одночасье.На следующее утро, мыть мембраны с тремя 10-минутные моет свежие трис-буферный солевой раствор на стирку, прежде чем подвергать мембрану соответствующие вторичные антитела в течение одного к одному и 1 / 2 часа при комнатной температуре. Затем промыть мембрану пять раз со свежим трис-буфером солевого раствора на стирку и подвергать мембрану повышенной химилюминесценции раствор для визуализации сигнала с помощью пленок. Здесь иллюстрируется снижение, наблюдаемое в клетках пролиферации родительских клеток PC-9 в ответ на повышение концентрации афатиниба, подтверждающее, что клетки PC-9 чувствительны к воздействию афатиниба.Тем не менее, ни одна из трех устойчивых к афатинибу клеточных линий не демонстрирует подавления пролиферации клеток при воздействии афатиниба. Устойчивые к Афатинибу клеточные линии демонстрируют значительно более медленные кривые роста, чем родительские клетки PC-9. Устойчивые к Афатинибу клетки выражают значительно более высокие уровни экспрессии геномной ДНК EGFR и белка EGFR, чем родительские клетки PC-9.Секвенирование EGFR показывает, что клетки PC-9 обладают 15 базовыми парой удалений в EGFR exon 19 и диким типом EGFR в exon 20. Afatinib устойчивых одной и двух клеток линии клеток, однако, демонстрируют усиление дикого типа EGFR exon 19. Устойчивые к Афатинибу клеточные линии три клетки содержат те же 15 базовых парных удалений в EGFR exon 19, что и в клетках PC-9, но точеная мутация в T790M наблюдается в EGFR exon 20.Рост клеток может стать довольно медленным, когда концентрация ингибитора близка к значению IC-50. Не обсуждай культуру, так как клетка будет продолжать размножаться постепенно. Эти стратегии были разработаны для имитации условий, при которых онкологические больные развивают клинически-релевантную устойчивость для оценки приобретенных механизмов устойчивости и разработки безопасных и эффективных терапевтических стратегий.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Создание двойного сопротивления EGFR-тки и встретились тки в легких аденокарциномы клетки In Vitro дозы 2-шаг эскалации процедуры

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Развитие человека доклинических модели Osteoclastogenesis от периферической крови моноциты совместно культивируемых с линии клеток рака молочной железы

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Создание колонизации Assay легких для циркулирующих визуализации опухолевых клеток в тканях легких

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Мезенхимальных стволовых клеток изолированно от ткани пульпы и культуры совместно с раковых клеток, чтобы изучить их взаимодействия

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Создание и характеристика малого кишечника нейроэндокринных опухолевых сфероидов

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...