Name: establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib
Uploaded: 2019-06-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Vi tackar den medlem av Advanced cancer translationella forskningsinstitut för deras tankeväckande kommentarer och Editage för deras hjälp med engelsk språk redigering. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (Grant Number: 16K09590 till T.Y.).

1. upprättande av tre oberoende afatinib-resistenta PC-9-cellinjer
<ol><li>Bestämning av den initiala exponeringskoncentrationen av afatinib för PC-9-celler med hjälp av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys
	<ol>
<li>Kultur PC-9 celler i tillväxtmedium som innehåller fetalt Nötkreaturserum (10%), penicillin (100 U/mL), och streptomycin (100 μg/mL) i en cell-kultur behandlas 10-cm skålen i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° c.</li>
		<li>Resuspend PC-9 cell...

<ol>
	<li>Chan, B. A., Hughes, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+therapy+for+non-small+cell+lung+cancer:+current+standards+and+the+promise+of+the+future.">Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future.</a> Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).</li><li>Mitsudomi, T., Yatabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+gene+and+related+genes+as+determinants+of+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+inhibitors+sensitivity+in+lung+cancer.">Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes as determinants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors sensitivity in lung cancer.</a> Cancer Science. 98 (12), 1817-1824 (2007).</li><li>Yamaoka, T., Kusumoto, S., Ando, K., Ohba, M., Ohmori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinase-targeted+cancer+therapy.">Receptor tyrosine kinase-targeted cancer therapy.</a> International Journal of Molecular Science. 19 (11), (2018).</li><li>Marshall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+implications+of+the+mechanism+of+epidermal+growth+factor+receptor+inhibitors.">Clinical implications of the mechanism of epidermal growth factor receptor inhibitors.</a> Cancer. 107 (6), 1207-1218 (2006).</li><li>Hirsh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+treatment-related+adverse+events+associated+with+egfr+tyrosine+kinase+inhibitors+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer.">Managing treatment-related adverse events associated with egfr tyrosine kinase inhibitors in advanced non-small-cell lung cancer.</a> Current Oncology. 18 (3), 126-138 (2011).</li><li>Arcila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebiopsy+of+lung+cancer+patients+with+acquired+resistance+to+EGFR+inhibitors+and+enhanced+detection+of+the+T790M+mutation+using+a+locked+nucleic+acid-based+assay.">Rebiopsy of lung cancer patients with acquired resistance to EGFR inhibitors and enhanced detection of the T790M mutation using a locked nucleic acid-based assay.</a> Clinical Cancer Research. 17 (5), 1169-1180 (2011).</li><li>Sequist, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+and+histological+evolution+of+lung+cancers+acquiring+resistance+to+EGFR+inhibitors.">Genotypic and histological evolution of lung cancers acquiring resistance to EGFR inhibitors.</a> Science Translational Medicine. 3 (75), 75ra26 (2011).</li><li>Yang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osimertinib+in+pretreated+T790M-positive+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+AURA+study+phase+II+extension+component.">Osimertinib in pretreated T790M-positive advanced non-small-cell lung cancer: AURA study phase II extension component.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (12), 1288-1296 (2017).</li><li>Chong, C. R., Janne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+to+overcome+resistance+to+EGFR-targeted+therapies+in+cancer.">The quest to overcome resistance to EGFR-targeted therapies in cancer.</a> Nature Medicine. 19 (11), 1389-1400 (2013).</li><li>Clynes, M., Redmond, A., Moran, E., Gilvarry, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+drug-resistance+in+variant+of+a+human+non-small+cell+lung+carcinoma+cell+line,+DLKP-A.">Multiple drug-resistance in variant of a human non-small cell lung carcinoma cell line, DLKP-A.</a> Cytotechnology. 10 (1), 75-89 (1992).</li><li>Yamaoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+afatinib+resistance+mechanisms+identified+in+lung+adenocarcinoma+harboring+an+EGFR+mutation.">Distinct afatinib resistance mechanisms identified in lung adenocarcinoma harboring an EGFR mutation.</a> Molecular Cancer Research. 15 (7), 915-928 (2017).</li><li>Liang, X. J., Shen, D. W., Garfield, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+of+membrane+proteins+associated+with+multidrug+resistance+in+cisplatin-resistant+cancer+cell+lines.">Mislocalization of membrane proteins associated with multidrug resistance in cisplatin-resistant cancer cell lines.</a> Cancer Research. 63 (18), 5909-5916 (2003).</li><li>Shen, D. W., Akiyama, S., Schoenlein, P., Pastan, I., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+high-level+cisplatin-resistant+cell+lines+established+from+a+human+hepatoma+cell+line+and+human+KB+adenocarcinoma+cells:+cross-resistance+and+protein+changes.">Characterisation of high-level cisplatin-resistant cell lines established from a human hepatoma cell line and human KB adenocarcinoma cells: cross-resistance and protein changes.</a> British Journal of Cancer. 71 (4), 676-683 (1995).</li><li>Murakami, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+I+study+of+continuous+afatinib+(BIBW+2992)+in+patients+with+advanced+non-small+cell+lung+cancer+after+prior+chemotherapy/erlotinib/gefitinib+(LUX-Lung+4).">Phase I study of continuous afatinib (BIBW 2992) in patients with advanced non-small cell lung cancer after prior chemotherapy/erlotinib/gefitinib (LUX-Lung 4).</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (4), 891-899 (2012).</li><li>Nukaga, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+EGFR+wild-type+alleles+in+non-small+cell+lung+cancer+cells+confers+acquired+resistance+to+mutation-selective+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitors.">Amplification of EGFR wild-type alleles in non-small cell lung cancer cells confers acquired resistance to mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 77 (8), 2078-2089 (2017).</li><li>Nakatani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+amplifications+mediate+resistance+to+rociletinib+and+osimertinib+in+acquired+afatinib-resistant+NSCLC+harboring+exon+19+deletion/T790M+in+EGFR.">EGFR amplifications mediate resistance to rociletinib and osimertinib in acquired afatinib-resistant NSCLC harboring exon 19 deletion/T790M in EGFR.</a> Molecualr Cancer Therapy. 18 (1), 112-126 (2019).</li><li>Piotrowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+underlies+the+emergence+of+EGFRT790+wild-type+clones+following+treatment+of+T790M-positive+cancers+with+a+third-generation+EGFR+inhibitor.">Heterogeneity underlies the emergence of EGFRT790 wild-type clones following treatment of T790M-positive cancers with a third-generation EGFR inhibitor.</a> Cancer Discovery. 5 (7), 713-722 (2015).</li><li>Ortiz-Cuaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+mechanisms+of+primary+and+acquired+resistance+to+third-generation+EGFR+inhibitors.">Heterogeneous mechanisms of primary and acquired resistance to third-generation EGFR inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 22 (19), 4837-4847 (2016).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGFR+T790M,+L792F,+and+C797S+mutations+as+mechanisms+of+acquired+resistance+to+afatinib+in+lung+cancer.">Characterization of EGFR T790M, L792F, and C797S mutations as mechanisms of acquired resistance to afatinib in lung cancer.</a> Molecular Cancer Therapy. 16 (2), 357-364 (2017).</li><li>Uchibori, K., Inase, N., Nishio, M., Fujita, N., Katayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mutation+accumulation+as+resistance+mechanism+emerging+in+first-line+osimertinib+treatment.">Identification of mutation accumulation as resistance mechanism emerging in first-line osimertinib treatment.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (7), 915-925 (2018).</li></ol>

Här beskrev vi en metod för att etablera tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer och karakteriserade dessa celler i jämförelse med föräldrarnas PC-9-celler. Genom stegvis dos öknings exponering förvärvade föräldra-PC-9-cellerna resistens mot afatinib under en period av 10-12 månader. Kliniskt är Resistensmekanismerna till EGFR TKIs heterogena, och därför, efter den initiala behandlingen med afatinib, var PC-9-celler indelade i tre oberoende P100-rätter och exponerade ytterligare för afatinib. Inledni...

Fem tyrosinkinashämmare, riktade mot epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR), inklusive gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib och osimertinib är för närvarande tillgängliga för behandling av patienter med EGFR-mutationspositiva icke-småcellig lung cancer (NSCLC). Under det senaste decenniet har terapier för sådana patienter genomgått en dramatisk utveckling med upptäckten av nya potentiella EGFR-TKIs. Bland patienter med lungadenocarcinom, identifieras somatiska mutationer i EGFR hos cirka 50% av Asiaten och 15% av kaukasiska patienter1. De vanligaste mutationer i EGFR är en L858R punktmutation i EGFR exon 21 och 15 bas par (BP) borttagningar i EGFR exon 192. Hos EGFR-mutationspositiva patienter med NSCLC förbättrar EGFR-TKIs responsfrekvensen och de kliniska resultaten jämfört med den tidigare standarden på platina-Doublet kemoterapi3.
Gefitinib och erlotinib var de första godkända småmolekylära hämmare och kallas i allmänhet för första generationens EGFR TKIs. Dessa EGFR TKIs blockerar tyrosinkinas aktivitet genom att konkurrera med ATP och reversibelt bindning till ATP bindningsställen4. Afatinib är en andra generationens EGFR TKI som oåterkalleligt och kovalent binder till tyrosinkinasdomänen av EGFR och karaktäriseras som en pan-Human EGFR-familjehämmare5.
Trots den dramatiska nyttan av dessa terapier hos patienter med NSCLC, förvärvad resistens är oundviklig. Den vanligaste resistensmekanismen mot första och andra generationens EGFR-tkis är uppkomsten av T790M-mutationen i EGFR exon 20, som finns i 50-70% av tumörproverna6,7,8. Andra resistensmekanismer inkluderar bypass-signaler (till MET, IGF1R, och HER2), omvandling till småcellig lungcancer, och induktion av epitelial till mesenkymala övergång, som inträffar prekliniskt och kliniskt9. Resistensmekanismerna till EGFR TKIs är heterogena. Genom att identifiera nya resistensmekanismer i prekliniska studier kan det vara möjligt att utveckla nya Therapeutics för att övervinna resistens. Optimala sekvens terapier som maximerar den kliniska nyttan för patienter måste överväga resistensmekanismer och terapeutiska mål.
Det är absolut nödvändigt att välja rätt föräldra cell linje, eftersom det är grunden för alla efterföljande experiment. Urvals strategierna inleds med klinisk relevans; Det är nödvändigt att välja en kemoterapi och strålning naiva cellinjer. Tidigare kemoterapeutiska och/eller strålningsbehandling kan inducera förändringen av resistens vägar och förändringar av uttrycket av läkemedelsresistens markörer. I denna studie, PC-9 celler, transporterar 15 BP borttagningar i EGFR exon 19, är anställda för etablering av förvärvad resistens mot afatinib. Denna cell linje härstammar från en japansk NSCLC patient, som inte fick tidigare kemoterapi och strålning.
Eftersom afatinib administreras oralt på daglig basis, kontinuerlig in vitro-behandling, där cellerna odlas ständigt i närvaro av afatinib skulle vara kliniskt relevant. Dosen av läkemedel som används i de olika stegen i experimentet måste optimeras för den valda föräldra cellen. En cytotoxicitetstest kan användas för att bestämma ett lämpligt läkemedels område, som bör vara jämförbar med den farmakokinetiska informationen av drogen.
Hela urvalsprocessen bibehålls hela populationen av celler som en enda grupp; kloning eller andra separationsmetoder används inte. Cellerna är först kontinuerligt utsätts för en låg nivå av drogen. Därefter, efter att cellerna anpassar sig för att växa i närvaro av drogen, dosen av drogen ökas långsamt till den slutliga optimala dosen av drogen10,11. Alternativt kan en puls läkemedelsadministrering eller mutagenes användas för att välja motstånds celler, som också utförs före läkemedelsbehandling 12,13. Tyvärr, fall där läkemedelsresistens inte utvecklas är i allmänhet inte rapporteras. Urvals strategierna utvecklas i syfte att försöka efterlikna cancer patienternas tillstånd för att återuppbygga kliniskt relevant resistens. Ibland, för att identifiera molekylära förändringar i samband med mekanismer för läkemedelsresistens, en hög läkemedelskoncentration används. Denna modell blir mindre kliniskt relevant.
Här beskriver vi en metod för att etablera tre oberoende afatinib-resistenta cellinjer från PC-9-celler som hartråkigt 15 BP-borttagningar i EGFR exon 19 samt den initiala karakteriseringen av afatinib-resistenta cellinjer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1120px;" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">afatinib</td>
			<td style="width:187px;">Selleck</td>
			<td style="width:353px;">S1011</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">anti-EGFR monoclonal antibody</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>4267S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">bicinchoninc acid assay</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>B9643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">cell-culture treated 10cm dish</td>
			<td style="width:187px;">Violamo</td>
			<td style="width:353px;">2-8590-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CELL BANKER1&#160;</td>
			<td style="width:187px;">TakaRa</td>
			<td style="width:353px;">CB011</td>
			<td>cryopreservation media</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">CellTiter 96</td>
			<td style="width:187px;">Promega</td>
			<td style="width:353px;">&#160;G4100</td>
			<td style="width:359px;">&#160;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay; Dye solution and Solubilization/Stop solution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">DMSO</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">043-07216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">ECL solution</td>
			<td style="width:187px;">Perkin Elmer</td>
			<td>NEL105001EA</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">FBS</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">26140-079</td>
			<td style="width:359px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">GeneAmp 5700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>fluorescence-based RT-PCR-detection system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GraphPad Prism v.7 software&#160;</td>
			<td>GraphPad, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>a statistical software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NanoDrop Lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo</td>
			<td></td>
			<td>spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Nonfat dry milk</td>
			<td style="width:187px;">cell signaling technology</td>
			<td>9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:187px;">gibco</td>
			<td style="width:353px;">15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P5726</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">Powerscan HT microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">&#160;Power SYBR Green master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SYBR Green master mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAamp DNA Mini kit</td>
			<td style="width:187px;">Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td></td>
			<td>PCR purification kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">RPMI-1640&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Wako</td>
			<td style="width:353px;">189-02025</td>
			<td>with L-Glutamine and Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">TBST powder</td>
			<td style="width:187px;">sigma</td>
			<td>T9039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:221px;">Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td>semi-dry t4ransfer apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:221px;">96 well microplate</td>
			<td style="width:187px;">Thermo</td>
			<td>130188</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and characterization of three afatinib-resistant lung adenocarcinoma pc-9 cell lines developed with increasing doses of afatinib

Förvärvad resistens mot molekylära mål hämmare är ett allvarligt problem i cancerbehandling. Lung cancer är fortfarande den vanligaste orsaken till cancerrelaterad död i de flesta länder. Upptäckten av "onkogen driver mutationer," såsom epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR)-aktiverande mutationer, och efterföljande utveckling av molekylära riktade medel av EGFR tyrosinkinashämmare (tkis) (gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib och osimertinib) har dramatiskt förändrat lungcancer behandlingen under de senaste decennierna. Emellertid, dessa läkemedel är fortfarande inte effektiva hos patienter med icke-småcellig lungcancer (NSCLC) redovisade EGFR-aktiverande mutationer. Efter förvärvad resistens är den systemiska progressionen av NSCLC fortfarande ett betydande hinder vid behandling av patienter med EGFR-mutationspositiv NSCLC. Här presenterar vi en stegvis dos upptrappnings metod för att etablera tre oberoende förvärvade afatinib-resistenta cellinjer från NSCLC PC-9-celler som hartråkigt EGFR-aktiverande mutationer av 15-bas par borttagningar i EGFR exon 19. Metoder för att karakterisera de tre oberoende cellinjer med afatinib-resistens presenteras kortfattat. De förvärvade Resistensmekanismerna till EGFR TKIs är heterogena. Därför måste flera cellinjer med förvärvad resistens mot EGFR-TKIs undersökas. Tio till tolv månader krävs för att få cellinjer med förvärvad resistens med hjälp av denna stegvis dosupptrappning metod. Upptäckten av nya mekanismer för förvärvad resistens kommer att bidra till att utveckla effektivare och säkrare terapeutiska strategier.

Schemat för att etablera tre afatinib-resistenscellinjer från PC-9-celler med hjälp av en stegvis dos öknings procedur visas i figur 1. Figur 2 visar en minskning av cellproliferation av föräldrarnas PC-9-celler eftersom koncentrationen av afatinib ökar, vilket indikerar att PC-9-celler är känsliga för exponering av afatinib. Figur 3 visar afatinib-motståndet hos de tre cellinjer. Ingen av...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib at JoVE.com

Establishment and Characterization of Three Afatinib-resistant Lung Adenocarcinoma PC-9 Cell Lines Developed with Increasing Doses of Afatinib

Etablering och karakterisering av tre afatinib-resistenta lung adenocarcinom PC-9 cellinjer som utvecklats med ökande doser av afatinib

En metod för att fastställa afatinib-resistens cellinjer från lung adenocarcinom PC-9 celler utvecklades, och resistenta celler karakteriserades. De resistenta cellerna kan användas för att undersöka epidermal tillväxtfaktorreceptor tyrosinkinashämmare-resistensmekanismer, gäller för patienter med icke-småcellig lungcancer.

Acquired resistance to molecular target inhibitors is a severe problem in cancer therapy. Lung cancer remains the leading cause of cancer-related death in ...

Studien av nya förvärvade resistensmekanismer kommer att bidra till utvecklingen av mer effektiva och säkra terapeutiska strategier hos patienter med cancer agent resistent och resectable cancer. Tyvärr rapporteras i allmänhet inte fall där läkemedelsresistensen inte utvecklas. Denna stegvis dos eskalering metod anses vara den mest tillförlitliga tekniken för att erhålla förvärvade-resistens celler.För att bestämma lämplig afatinib-resistens koncentration, kultur PC-9 celler i tillväxt medium i en 10-centimeter cell kultur-behandlade skålen vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Resuspend PC-9 celler på en fyra gånger-10-till-de-fyra celler per milliliter tillväxt medium koncentration, och placera cellerna på 50 mikroliter cell suspension per brunn i en 96-väl mikroplatta. Efter en inkubation över natten i inkubatorn för cellodling, behandla cellerna med 50 mikroliter av afatiniblösning per brunn, vid sex replikat av de angivna koncentrationerna, och efter en 96-timmars inkubation i cullingkulturens inkubator, tillsätt 15 mikroliter MTT-färgämne till varje brunn.Efter fyra timmar i cellodlingsinkubatorn, tillsätt 100 mikroliter solubilisering/stopplösning till varje brunn, och returnera plattan till inkubatorn över natten. Nästa morgon, mäta den optiska densiteten vid 570 nanometer på en mikroplatt läsare. För kontinuerlig afatinibexponering, odla PC-9 celler i P-100 rätter som innehåller 10 milliliter tillväxtmedium tills cellerna når subkonfluens.Överför subkonfluentkulturerna till tre nya P-100-rätter på nio milliliter tillväxtmedium per initial odlingsskål och återför cellerna till cellkulturinkubatorn. Nästa morgon, tillsätt 0,1 nanomolar, eller 1/10 av halv-maximal hämmande koncentration av afatinib, till varje uppsättning av tre kultur rätter. När de afatinib-behandlade cellerna blir subkonfluenta, använd en en-milliliter pipett för att noggrant blanda kulturerna, och överföra en milliliter celler från varje maträtt till nio milliliter av färskt tillväxtmedium i nya P-100 rätter.Lägg till 10%till 20%högre koncentrationer av afatinib till de nya kulturerna, öka afatinib koncentrationen genom stegvis dos eskalering varje gång kulturerna når delkonfluensi under en 10-till 12-månadersperiod. När en afatinibkoncentration av en mikromolar uppnås, utför MTT-analysen som visats för att bekräfta att cellerna har utvecklat afatinib-resistens. För att bestämma tillväxtkurvan för cellinjerna, kultur föräldra-PC-9 och de tre afatinib-resistenta cellinjerna i tillväxtmedium i cellkulturinkubatorn i 24 timmar.Resuspend cellerna från varje kultur på en fem gånger-10-till-den-tredje celler per milliliter av tillväxt medium koncentration, och säte 12 100-mikroliter replikerar av varje cellpopulation per brunn i en 96-väl mikroplatta. Utför sedan MTT-analysen på dagar noll, ett, två, tre, fem och sju av kultur som visats, och rita resultaten med hjälp av en lämplig statistisk analys program. För att identifiera förändringar i epidermal tillväxtfaktorreceptor, eller EGFR genomiskt DNA-uttryck, genom omvänd transkriptaspolymeraskedjaanalys, isolera genomiskt DNA från cellkulturen av intresse med hjälp av ett DNA-reningskit enligt tillverkarens anvisningar.Mät koncentrationen av 25-nanogram-mikroliter koncentrationer av det isolerade genomiska DNA på en spektrofotometer. Sedan förstärka 50 nanogram av genomiskt DNA med hjälp av en SYBR grön master mix, och analysera resultaten med hjälp av en fluorescens-baserade omvänd transkriptas polymeras kedjereaktion detekteringssystem. För att identifiera förändringar i EGFR genomiska DNA-uttryck genom sekvensering, förstärka genometiskt DNA med hjälp av specifika primers för EGFR exons 19 till 21.Sedan rena de förstärkta PCR-produkterna med hjälp av en PCR-reningssats enligt tillverkarens anvisningar, och sekvens amplikerna. För att identifiera förändringar i epidermal tillväxtfaktor receptor protein uttryck genom västra blot analys, behandla cellerna med afatinib i 24 timmar. Efter 24 timmar, tvätta cellkulturerna två gånger med fem milliliter iskall PBS per kultur per tvätt.Lysa cellerna i radioimmunoprecipitation assay buffert, kompletterad med 1%proteashämmare cocktail och fosfatas hämmare cocktail två och tre i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, samla in lysaterna genom centrifugeringen. Använd bicinchoninsyraanalysen för att bestämma proteinkoncentrationen av lysateproverna.Justera proteinproverna till 0,5, eller ett mikrogram per mikroliterkoncentrationer, i 4-X provbuffert, och koka proverna vid 96 grader Celsius i fem minuter. För västra blot analys av proverna, montera etanol-rengjorda glasplattor och distanser, och ladda formen med en 8%polyakrylamide gel med lämpliga experimentella kosttillskott. Medan gelen är polymeriserande, lägga stapling gel lösning till en lämplig mögel, sätt in kammen, och låt stapling gelen polymerisera i 20 till 30 minuter vid rumstemperatur.När båda gelerna har polymeriserat, placera dem i elektroforesapparaten och fyll tanken med löpbuffert. Ladda sedan en 20-till 30-mikroliter volym av varje proteinprov i varje brunn, och kör gelen på 180 volt. Stoppa elektroforesen efter cirka 60 minuter, när färgämnet fronten strömmar ut ur gelen, och tvätta gelen med tris-buffrad saltlösning, kompletterad med Tween, i en till två minuter.Överför proteinerna till ett polyvinylidenfluoridmembran genom halvtorrt blotting i en och 1/2 timme vid en konstant ström på 300 millias. Blockera membranet med 5%fettfri torr mjölk utspädd med trisbuffrad saltlösning plus Interpolerad lösning i en timme i rumstemperatur. Därefter sond membranet med lämpliga antikroppar av intresse vid fyra grader Celsius över natten.Nästa morgon, tvätta membranen med tre 10-minuters tvättar av färsk tris-buffrad saltlösning per tvätt innan du utsätter membranet för lämplig sekundär antikropp för en till en och 1/2 timme vid rumstemperatur. Tvätta sedan membranet fem gånger med färsk tris-buffrad saltlösning per tvätt och exponera membranet för förbättrad chemiluminescenslösning för signalvisualisering med hjälp av filmer. Här, den minskning som observerats i cellen spridning av föräldrarnas PC-9 celler som svar på ökande koncentrationer av afatinib illustreras, bekräftar att PC-9 celler är känsliga för afatinib exponering.Ingen av de tre afatinib-resistenta cellinjerna visar dock en dämpning av cellproliferation under afatinibexponering. Afatinib-resistenta cellinjer uppvisar betydligt långsammare tillväxt kurvor än föräldrarnas PC-9 celler. Afatinib-resistenta celler uttrycker betydligt högre nivåer av EGFR genomiskt DNA och EGFR-proteinuttryck än föräldrarnas PC-9-celler.EGFR-sekvensering visar att PC-9-celler uppvisar 15 baspars deletioner i EGFR exon 19 och vild typ EGFR i exon 20. Afatinib-resistent en och två celllinje celler, dock uppvisar en förstärkning av vilda typ EGFR exon 19. Afatinib-resistenta cellinje tre celler innehåller samma 15 bas par borttagningar i EGFR exon 19 som i PC-9 celler, men en punkt mutation i T790M observeras i EGFR exon 20.Celltillväxt kan bli ganska långsam när inhibitorkoncentrationen är nära IC-50-värde. Diskutera inte kultur, eftersom cellen kommer att fortsätta att föröka sig gradvis. Dessa strategier har utvecklats för att efterlikna de villkor under vilka cancerpatienter utveckla kliniskt-relevant resistens att bedöma förvärvade resistensmekanismer och att utveckla säkra och effektiva terapeutiska strategier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Om dubbla motstånd mot EGFR-TKI och träffade-TKI i lunga adenokarcinom celler In Vitro med en 2-stegs-dosupptrappning procedur

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Inrättandet av en Lung Colonization analys för cirkulerande tumör Cell visualisering i lungvävnad

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Ortotop Transplantation av syngena lunga adenokarcinom celler att studera PD-L1-uttryck

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Radio känslighet av cancer stamceller i Lung cancer cellinjer

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering och karakterisering av små tarm neuroendokrina tumör spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering och karakterisering av patient-derived bukspottskörteln ductal adenocarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Subculture and Cryopreservation of Esophageal Adenocarcinoma Organoids: Pros and Cons for Single Cell Digestion

Subkultur och kryokonservering av esofagusadenokarcinomorganoider: Fördelar och nackdelar för encellsförtunning

The lack of suitable translational research models reflecting primary disease to explore tumorigenesis and therapeutic strategies is a major obstacle in ...