Este protocolo demonstra a utilidade do sistema organoide intestinal derivado de células-tronco para modelar a invasão epitelial por patógenos entericos, e a modificação deste processo usando citocinas. A micro-injeção permite que o patógeno de interesse seja entregue diretamente na cavidade lúmenal do organoide, replicando mais de perto o processo de infecção in vivo. Este método poderia ser aplicado ao estudo de diferentes patógenos entéricos ou citocinas alternativas de interesse.

Sugiro concluir um teste do procedimento com fenol vermelho apenas para dominar a técnica de micro-injeção antes do uso de patógenos. No segundo dia, comece a diferenciação mudando a mídia para 10 mililitros de meio de cultura de células-tronco, complementados com fatores de crescimento. No sexto dia, mude a mídia para 10 mililitros de mídia RPMI-B27, complementada com seis micromolar CHIR99021, além de três ácidos retinóicos micromolar para começar a padronizar o endodermo posterior ao hindgut.

No dia 10 de diferenciação, incorpore o hindgut na matriz de membrana do porão. Primeiro, remova a mídia da placa hindgut e lave a placa com DPPS livre de magnésio de cálcio uma vez. Adicione cinco mililitros de solução de colagenase à placa e incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Em seguida, inativar a colagemnase adicionando cinco mililitros da mídia de crescimento da base organoide à placa. As células hindgut devem estar flutuando neste momento. Colete a suspensão traseira em um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, centrífuga a 240 vezes-G por um minuto. Após a centrifugação, pipeta fora do supernante, adicione 10 mililitros da mídia de crescimento da base organoide, desmemeta o hindgut em pedaços menores por pipetação suavemente, e centrífuga novamente em 95 vezes-G por um minuto. Lave as células na mídia de crescimento da base organoide duas vezes.

Resuspengue as células em 300 a 500 microliters do meio de crescimento base, e adicione aproximadamente 100 microliters desta solução a 1,5 mililitros da matriz de membrana do porão. Coloque uma placa de 24 poços em um aquecedor a 37 graus Celsius. e localizá-lo 60 microliters da mistura de matriz de células hindgut em um poço da placa de 24 poços.

Deixe-o definir brevemente e verifique a densidade sob um microscópio. Depois de detectar o resto da matriz na placa de 24 poços, incubar a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 800 microliters da mídia de crescimento base contendo fatores de crescimento a cada poço da placa de 24 poços.

Para passar organoides, primeiro remova a mídia deles, e substitua-a por 500 microliters por poço da solução de elevação celular. Incubar a quatro graus Celsius por 40 a 50 minutos, momento em que os organoides devem estar flutuando na solução. Pipeta suavemente os organoides e a solução de elevação celular em tubos cônicos de 15 mililitros, tentando não quebrar os organoides.

Depois de permitir que os organoides se contentem por três a cinco minutos, remova o sobrenatante e as células únicas. Resuspenque os organoides em cinco mililitros do meio de crescimento base, e pipete-os suavemente para lavar. Centrifugar a 95 vezes-G por dois minutos.

Em seguida, configure a placa de 24 poços em um aquecedor de placa a 37 graus Celsius dentro do capô, e remova o sobrenatante da pelota organoide. Em seguida, usando uma pipeta P1000, resuspend os organoides em 300 a 500 microliters da mídia de crescimento base para quebrar os organoides em pedaços menores. Coloque aproximadamente 100 microliters dos organoides em 1,5 mililitros da matriz de membrana do porão e pipeta brevemente para misturar.

Localmente 60 microliters da matriz de membrana do porão em um poço da placa de 24 poços. Depois de deixá-lo solidificar por 30 segundos, verifique a densidade sob o microscópio. Depois de detectar o resto da matriz em uma placa de 24 poços, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, sobreponha-a com 800 microliters do meio de crescimento base com fatores de crescimento de acordo com o manuscrito.

Para ensaios de microinjeção com pré-estimulação iLEG-22 humana recombinante, adicione il-22 humano recombinante à mídia cultural a uma concentração final de 100 nanogramas por mililitro 18 horas antes das injeções. Carregue a placa de micro-injeção contendo organoides no estágio do microscópio, remova a tampa e coloque os organoides em foco, pronto para a injeção começar. Ligue o injetor e as estações de controle de braço.

Certifique-se de que o injetor está configurado para uma pressão de 600 quilopascals e um tempo de injeção de 0,5 segundos. Se ele ainda não estiver afastado do estágio do microscópio, gire o braço de injeção para ter certeza de que está e remova sua cabeça de aperto. Carregue a ponta da broca com 10 microlitadores do inóculo, segurando a ponta da broca suavemente em sua extremidade contundente.

Coloque a ponta da broca na cabeça de aperto e recoloque-a no braço de micro-injeção. Mova suavemente o braço para uma posição onde a agulha está situada de um a dois centímetros acima da antena de micro-injeção. Use o controle do braço para posicionar a ponta da agulha no centro do prato, e abaixe-a até que esteja logo acima da superfície da mídia.

Programe a estação de controle de braço para devolver a agulha a este ponto depois de todas as injeções. Concentre o microscópio nos organoides e selecione o alvo para injetar. Posicione a agulha logo acima e o direito do organoide a ser injetado, e mova a agulha para baixo e lateralmente para o lúmen organoide.

Pressione o botão de injeção no micro-injetor para deixar a mistura de bactérias manchadas de fenol emergir da agulha. E injetar cada organoide três vezes. Quando todos os organoides necessários forem injetados, remova a placa de micro-injeção do palco, substitua a tampa e incuba a placa a 37 graus Celsius por 90 minutos.

Após a incubação, aspire a mídia de crescimento e substitua-a por três mililitros de solução de elevação celular. Em seguida, incubar a quatro graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, mova suavemente os organoides e a solução de elevação celular para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de DPBS.

Centrifugar a 370 vezes G por três minutos. Remova o supernatante e adicione um mililitro da mídia de crescimento base contendo 0,1 miligramas por gentamicina mililitro. Em seguida, com um P1000, pipeta para cima e para baixo aproximadamente 50 vezes para quebrar os organoides.

Adicione quatro mililitros mais mídia, e incubar a 37 graus Celsius por uma hora para matar bactérias extracelulares. Em seguida, centrifugar os organoides a 370 vezes G por três minutos. Aspire o supernascida, deixando o mínimo possível.

Lave os organoides com DPBS uma vez e centrífuga novamente. Adicione 500 microliters do tampão de lise, e pipeta para cima e para baixo aproximadamente 50 vezes para dissociar manualmente os organoides intestinais humanos. Depois de incubar à temperatura ambiente por cinco minutos, diluir em série a solução resultante dez vezes em DPBS.

Pipeta três gotículas de 20 mícrons das soluções limpas e diluídas em placas de ágar LB pré-aquecidas. Finalmente, incubar a 37 graus Celsius durante a noite e prosseguir com a contagem de colônias. Os organoides intestinais humanos foram micro-injetados com a solução bacteriana vermelha fenol.

A retenção desta cor vermelha pelos organoides previne injeções duplicadas. O pré-tratamento dos organoides intestinais humanos derivados da linha celular COF-2 com IL-22 humano recombinante restringe a invasão do S.typhimurium SL1344 em células epiteliais intestinais. Os organoides infectados foram processados para imuno-coloração, ou microscopia eletrônica de transmissão, a fim de facilitar a visualização das interações bacterianas do IEC hospedeiro.

O RNA pode ser extraído dos organoides injetados para olhar a resposta transcriômica à infecção. Fluorescência e microscopia eletrônica também podem ser usadas para observar interações de patógenos hospedeiros com mais detalhes. A coisa mais importante a se lembrar é garantir que você tenha praticado o suficiente no micro-injetor para ser capaz de completar suas injeções de forma rápida e eficiente para resultados consistentes.

As pontas da broca de micro-injeção têm um ponto fino e afiado, e deve-se tomar cuidado ao carregá-las e descarregá-las do micro-injetor. Esta técnica permite que interações de patógenos de células epiteliais sejam estudadas em detalhes anteriormente inalcançáveis. Este modelo de infecção será de uso particular para aqueles que estudam patógenos específicos do homem.

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