Enhver life science projekt, der kræver 3D ultrastruktur undersøgelse af en bestemt region af interesse i en kompleks biologisk prøve kan gøre brug af denne teknik. Prøveforberedelsesproceduren er den samme for to billeddannelsesmobaliteter, der er SBF/SEM og FIB-SEM. Anvendelsen af mikrobølgeovnen fremskynder prøvebehandlingsdelen væsentligt.
Selvom vist her for rod tips, denne protokol kan bruges til enhver biologisk model system med minimale justeringer. Før du bruger denne arbejdsgang til at korrelere SBF/SEM og FIB-SEM, bør man være fortrolig med de enkelte teknologier. Udførelsen af visse trin er let påvises, men vanskeligt at beskrive i skriftlig tekst.
Demonstrere proceduren vil være Peter Borghgraef, der er en tekniker i vores laboratorium. Til at begynde, skære rodspidser af den faste Arabidopsis thaliana planter på agar plader og sætte to til tre tips i Eppendorf rør, der indeholder den samme fiksative natten over på fire grader Celsius. Om morgenen, med en pipette, erstatte fiksativ med 0,1 molar fosfat buffer ved pH 6,8 i rørene med rørene på et roterende bord ved 100 RPM og vask i 10 minutter.
Gentag derefter vasken ved hjælp af frisk fosfat buffer fem gange. I en røghætte, post-fix roden tips ved at erstatte fosfat buffer med 2%osmium tetroxid og 0,2% ruthenium rød i 0,1 molar fosfat buffer ved pH 6,8 med rørene med låg åbne i en mikrobølgeovn og starte programmet. Derefter kasseres opløsningen i rørene og vaske rodspidserne to gange med dobbelt destilleret vand i fem minutter hver.
For tredje og fjerde dobbelt destilleret vandvask, skal du bruge mikrobølgeovnen til at hjælpe vasken. Efter den første 40 sekunder dobbelte destilleret vand vask, tage root tip prøver ud af mikrobølgeovnen og erstatte det dobbelte destilleret vand med frisk dobbelt destilleret vand. Sæt prøverne tilbage i mikrobølgeovnen og fortsætte programmet.
Dernæst forberede TCH løsning ved at tilføje 0,1 gram thiocarbohydrazide til 10 milliliter dobbelt destilleret vand i en 15 milliliter rør. Placer røret i en ovn og varme ved 60 grader Celsius i en time for at opløse. Filtrer derefter TCH-opløsningen ved hjælp af et 0,22 mikrometer sprøjtefilter.
Udskift straks opløsningen i prøverørene med den filtrerede TCH-opløsning, og fortsæt med protokollen. Nu nedsænkes prøverne i ethanol og læg dem i mikrobølgeovnen til at dehydrere i graduerede trin på 50% 70%90% og derefter to gange af 100% ethanol behandling. Efter propylenoxid dehydrering behandling, tilsæt 50% Spurr's harpiks i rørene for at starte infiltration af roden tips i mindst to timer.
Efter den endelige inkubation i 100% Spurr's harpiks, placere rodspidserne i indlejring forme og fylde forme med friske 100% Spurr's harpiks og polymerisere i en ovn ved 65 grader Celsius i 36 til 48 timer. Først skal du bruge et barberblad til groft trimme den polymeriserede prøve i en tynd blok. Med den side, der har udsat væv vender nedad, vedhæfte prøven til midten af en metal pin med ledende epoxy harpiks at have vævet rører metal pin.
Placer prøven i en ovn ved 65 grader Celsius for at helbrede epoxy natten over. Om morgenen skal metalstiften indlæses i holderen, og der skal bruges et barberblad til at fjerne overskydende epoxy fra prøven. For yderligere at glatte prøvens overflade skal du laste holderen med metalstiften i holderen til ultramikrotomen.
I ultramicrotome, bruge et glas eller diamant kniv til at glatte forsiden af siderne af blokken danner en pyramide. Sørg for, at i det mindste noget af vævet allerede er eksponeret på bloksiden. Placer derefter den trimmede prøveblok i sputtercoateren, og juster indstillingerne til platin ved to til fem nanometer for at belægge prøven med et tyndt lag.
Sæt holderen i SBF-SEM-mikroskopet. Bring diamantkniven tæt på prøveoverfladen og trim den øverste del af prøven for at fjerne platinlaget og eksponere en del af vævet. Derefter indstilles den accelererende spænding til 1,5 til 2 kilovolts.
Optag et billede af vævet, og opsæt et billedbillede. Brug Fiji-software til at vælge fil, importere, billedsekvens og finde billedstakken for at indlæse billederne. Når du har justeret billedet i henhold til manuskriptet, skal du kontrollere justeringen ved at rulle gennem datasættet.
Brug kommandoen Gem under filmenuen til at gemme det justerede datasæt som en 3D TIFF-fil. Analysér datasættet omhyggeligt for at se, om investeringsafkastet er inkluderet, og indeholder de oplysninger, der er nødvendige for det biologiske spørgsmål. På det sidste billede af stakken, som er den aktuelle blokside i SBF-SEM-mikroskopet, skal du vælge et nyt investeringsafkast til FIB-SEM.
Efter belægning med platin igen, indlæse prøven i FIB-SEM og bruge den sekundære elektron detektor på 15 kilovolts og en nanoamp til at lokalisere ROI identificeret i SBF-SEM på blokken ansigt. Bevæg og vip scenen for at bringe investeringsafkastet på prøven ind i sammenfaldspunktet for FIB- og SEM-strålerne ved hjælp af FIB-stråle- og gasindsprøjtningssystemet. Aflejr et 1 mikrometer beskyttende lag platin på overfladen over investeringsafkastet.
Dernæst ved hjælp af en lav fræsning strøm spænder 50 til 100 picoamps, mølle fine linjer i platin deposition for autofokusering og 3D-sporing under billeddannelse køre. Derefter ved hjælp af en høj fræsestrøm på 30 nanoampe, fræse en grøft på 30 mikrometer foran ROI skabe billeddannelse overflade for SEM stråle. Når du har udjævnet billedfladen, skal du starte billeddannelseskørslen og overvåge processens stabilitet i de første 50 til 100 sektioner.
Når systemet kører problemfrit, forlade rummet og sikre, at der er så lidt forstyrrelse i rummet som muligt. Billeder fra SBF-SEM giver et overblik over vævet, der giver indsigt i cellernes rumlige orientering og intracellulære forbindelser. Den efterfølgende FIB-SEM-billeddannelse i en ny region tilføjer detaljer med høj opløsning af specifikke celler og strukturer.
SBF-SEM-data viser forskellige gengivelser af de ikke-isotropiske voxels fra de isotropiske voxel FIB-SEM-data. SBF-SEM præsenterer en trappeeffekt på overfladen, mens FIB-SEM-dataene med de fem nanometersektioner sikrer, at gengivelsen fremstår meget glattere, og de enkelte sektioner passer helt ind i overfladen. Denne protokol beskriver billeddannelsen af et entydigt område i en enkelt prøve, og enhver afvigelse fra arbejdsprocessen kan forårsage skade på stikprøven, hvilket gør det umuligt at flytte interesseområdet.