Alla life science-projekt som kräver 3D ultrastruktur undersökning av en specifik region av intresse i ett komplext biologiskt prov kan använda sig av denna teknik. Provet förberedelseförfarandet är detsamma för två bildframställning modaliteter är SBF / SEM och FIB-SEM. Användningen av mikrovågorna påskyndar i stort sett provbearbetningsdelen.
Även visas här för rot tips, kan detta protokoll användas för alla biologiska modellsystem med minimala justeringar. Innan du använder detta arbetsflöde för korrelera SBF / SEM och FIB-SEM, bör man vara bekant med de enskilda teknikerna. Utförandet av vissa steg demonstreras lätt men svårt att beskriva i skriven text.
Demonstrerar proceduren blir Peter Borghgraef som är tekniker i vårt labb. Till att börja, klippa rotspetsar av de fasta Arabidopsis thaliana plantorna på agarplattor och sätta två till tre tips i Eppendorf-rör som innehåller samma fixativa över natten vid fyra grader Celsius. På morgonen, med en pipett, ersätta fixativ med 0,1 molar fosfat buffert vid pH 6,8 i rören med rören på ett roterande bord vid 100 RPM och tvätta i 10 minuter.
Upprepa sedan tvätten med färsk fosfatbuffert fem gånger. I en rökhuv, efter fixera rotspetsarna genom att ersätta fosfatbuffert med 2%osmium-tetroxid och 0,2%ruteniumrött i 0,1 molarfosfatbuffert vid pH 6.8 med rören med lock öppna i en mikrovågsugn och starta programmet. Släng sedan lösningen i rören och tvätta rotspetsarna två gånger med dubbelt destillerat vatten i fem minuter vardera.
För den tredje och fjärde dubbel destillerade vattentvätten, använd mikrovågsugnen för att hjälpa tvätten. Efter den första 40 andra dubbla destillerade vattentvätten, ta ut rotspetsproverna ur mikrovågsugnen och ersätt det dubbla destillerat vatten med färskt dubbeldestillerat vatten. Lägg tillbaka proverna i mikron och fortsätt programmet.
Därefter förbereder TCH-lösning genom att lägga till 0,1 gram tiocarbohydrazid till 10 milliliter dubbeldestillerat vatten i ett 15 milliliterrör. Placera röret i en ugn och värm vid 60 grader Celsius i en timme för att lösa upp. Filtrera sedan TCH-lösningen med hjälp av ett 0,22 mikrometersprutfilter.
Byt omedelbart ut lösningen i provrören med den filtrerade TCH-lösningen och fortsätt med protokollet. Nu fördjupa proverna i etanol och placera dem i mikrovågsugnen för att torka i graderade steg på 50%70%90%och sedan två gånger 100%etanol behandling. Efter propylenoxid uttorkning behandling, tillsätt 50%Spurr harts i rören för att starta infiltration av rotspetsar i minst två timmar.
Efter den slutliga inkubationen i 100%Spurrs harts, placera rotspetsarna i inbäddningsformar och fyll formar med färska 100%Spurrs harts och polymerisera i en ugn vid 65 grader Celsius i 36 till 48 timmar. Använd först ett rakblad för att grovt trimma det polymeriserade provet till ett tunt block. Med sidan har utsatt vävnad nedåt, fäst provet till mitten av en metall stift med ledande epoxiharts att vävnaden vidrör metallstiftet.
Placera provet i en ugn på 65 grader Celsius för att bota epoxin över natten. På morgonen, ladda metallstiftet i bäraren och använd ett rakblad för att ta bort eventuell överflödig epoxi från provet. För att ytterligare jämna ut provets ansikte, lasta bärselen med metalltappen i hållaren för ultramikrotomen.
I ultramikrotom, använd ett glas eller diamant kniv för att jämna ut ansiktet på sidorna av blocket bildar en pyramid. Se till att åtminstone en del av vävnaden redan är exponerad på blocket ansiktet. Placera sedan det trimmade provblocket i sputter coatern och justera inställningarna till platina vid två till fem nanometer för att belägga provet med ett tunt lager.
Sätt in bärvågen i SBF-SEM-mikroskopet. För diamantkniven nära provytan och trimma bort den övre delen av provet för att avlägsna platinalagret och exponera en del av vävnaden. Ställ sedan in accelererande spänning till 1,5 till 2 kilovolt.
Ta en bild av vävnaden och sätt upp en bildkörning. Använda Fiji programvara, välj fil, import, bildsekvens och leta upp bildstacken för att ladda bilderna. När du har justerat bilden enligt manuskriptet, kontrollera justeringen genom att bläddra igenom datamängden.
Använd kommandot spara under arkivmenyn för att spara den justerade datauppsättningen som en 3D-TIFF-fil. Analysera datamängden noggrant för att se om ROI ingår och innehåller den information som behövs för den biologiska frågan. På den sista bilden av stacken, som är den aktuella blockansiktet i SBF-SEM-mikroskopet, väljer du en ny ROI för FIB-SEM.
Efter beläggning med platina igen, ladda provet i FIB-SEM och använd den sekundära elektrondetektorn vid 15 kilovolt och en nanoamp för att lokalisera den ROI som identifieras i SBF-SEM på blockansiktet. Flytta och luta scenen för att få ROI på provet i sammanträffande punkt FIB och SEM balkar, med hjälp av FIB-strålen och gasinsprutningssystem. Deponera en en mikrometer skyddande lager av platina på ytan ovanför ROI.
Därefter, med hjälp av en låg fräsström som sträcker sig 50 till 100 picoamps, kvarn fina linjer i platina nedfall för autofokusering och 3D-spårning under bildbehandling köra. Sedan med hjälp av en hög fräsström på 30 nanoamps, fräsa ett dike av 30 mikrometer framför ROI skapa bildytan för SEM strålen. Efter utjämning av bildytan, starta bildframställningskörningen och övervaka processens stabilitet under de första 50 till 100 sektionerna.
När systemet är igång smidigt, lämna rummet och se till att det blir så lite störningar i rummet som möjligt. Bilder från SBF-SEM ger en översikt över vävnaden som ger insikt i den rumsliga orienteringen av celler och intracellulära anslutningar. Den efterföljande FIB-SEM bildframställning på en ny region lägger till hög upplösning detalj av specifika celler och strukturer.
SBF-SEM data visar olika återgivning av de icke-isotropiska voxels från isotropiska voxel FIB-SEM data. SBF-SEM presenterar en trappa effekt på ytan medan FIB-SEM data som har de fem nanometersektionerna säkerställer att renderingen verkar mycket jämnare och enskilda sektioner smälter in i ytan helt. Det här protokollet beskriver avbildning av en unik region i ett enda prov och eventuella avvikelser från arbetsflödet kan orsaka skador på provet gör det omöjligt att flytta regionen av intresse.