Name: generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

ويشكر المؤلفان توم يوهانان على المشورة التحريرية وM. Segura-Feliu على المساعدة التقنية. تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج المركز الإقليمي للبحوث والبحوث والبحوث من قبل لجنة الجامعات والبحوث التابعة لقسم الابتكار والجامعات والمؤسسة العامة لكاتالونيا (SGR2017-648). تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة البحوث والابتكار والجامعات الإسبانية (MEICO) من خلال BFU2015-67777-R وRTI2018-099773-B-100، وشبكة Prion الإسبانية (Prionet Spain AGL2017-90665-REDT)، ومعهد كارلوس الثالث، CIBERNED ( PRY-2018-2).

وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات بموجب المبادئ التوجيهية والبروتوكولات للجنة الأخلاقية للتجارب الحيوانية (CEEA) لجامعة برشلونة، وتم استعراض بروتوكول استخدام القوارض في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل CEEA من جامعة برشلونة (CEEA الموافقة #276/16 و 141/15).
1. تنقية من الجرذ الذيل ?...

<ol>
	<li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Les nouvelles id&#233;es sur la structure du syst&#232;me nerveux chez l'homme et chez les vert&#233;br&#233;s. , (1894).</li><li>Ram&#243;n y Cajal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuevo concepto de la histolog&#237;a de los centros nerviosos. , (1893).</li><li>Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+neuronal+cell+migrations.">Guiding neuronal cell migrations.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834 (2010).</li><li>Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+axon+guidance.">The molecular biology of axon guidance.</a> Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring:+a+primer.">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727 (2011).</li><li>Rosentreter, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+retinal+ganglion+cell+axons+to+striped+linear+gradients+of+repellent+guidance+molecules.">Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules.</a> Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).</li><li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration.">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li><li>von Philipsborn, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+navigation+in+substrate-bound+ephrin+gradients.">Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients.</a> Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).</li><li>Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+mechanisms:+semaphorins+as+simultaneous+repellents+and+anti-repellents.">Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents.</a> Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).</li><li>Jessell, T. M., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development.+The+decade+of+the+developing+brain.">Development. The decade of the developing brain.</a> Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).</li><li>Serafini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+netrins+define+a+family+of+axon+outgrowth-promoting+proteins+homologous+to+C.+elegans+UNC-6.">The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6.</a> Cell. 78 (3), 409-424 (1994).</li><li>Charron, F., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+brain+wiring+functions+for+classical+morphogens:+a+role+as+graded+positional+cues+in+axon+guidance.">Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance.</a> Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).</li><li>Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+transmission+in+migrating+cells.">Force transmission in migrating cells.</a> Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).</li><li>Dent, E. W., Gertler, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+dynamics+and+transport+in+growth+cone+motility+and+axon+guidance.">Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance.</a> Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).</li><li>Lowery, L. A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trip+of+the+tip:+understanding+the+growth+cone+machinery.">The trip of the tip: understanding the growth cone machinery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).</li><li>Castellani, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protocols for Neuronal Cell Culture. , (2001).</li><li>Gahwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Bornstein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+rattail+collagen+used+as+substrate+for+tissue+cultures+on+coverslips+in+Maximow+slides+and+roller+tubes.">Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes.</a> Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).</li><li>Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+examining+organotypic+CNS+cultures+with+Nomarski+optics.">A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics.</a> In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Earliest+sensory+nerve+fibres+are+guided+to+peripheral+targets+by+attractants+other+than+nerve+growth+factor.">Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor.</a> Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).</li><li>Chedotal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorins+III+and+IV+repel+hippocampal+axons+via+two+distinct+receptors.">Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors.</a> Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).</li><li>Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord.">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78 (3), 425-435 (1994).</li><li>Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eph/ephrin+signaling+in+morphogenesis,+neural+development+and+plasticity.">Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity.</a> Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+purification+of+a+mammalian+slit+protein+as+a+positive+regulator+of+sensory+axon+elongation+and+branching.">Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching.</a> Cell. 96 (6), 771-784 (1999).</li><li>Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+basement-membrane+matrix+modulates+fibroblast+activities+in+vitro.">Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro.</a> Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).</li><li>Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fibrin+or+collagen+gel+assay+for+tissue+cell+chemotaxis:+assessment+of+fibroblast+chemotaxis+to+GRGDSP.">A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP.</a> Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).</li><li>Kapur, T. A., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+concentration+gradients+of+nerve+growth+factor+guide+neurite+outgrowth.">Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).</li><li>Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite-J:+an+image-J+plug-in+for+axonal+growth+analysis+in+organotypic+cultures.">Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).</li><li>Balestrini, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+biology+of+decellularized+lung+matrix:+Implications+of+species+mismatch+in+regenerative+medicine.">Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine.</a> Biomaterials. 102, 220-230 (2016).</li><li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Analysis+of+the+Digestion+of+Bovine+Type+I+Collagen+Telopeptides+with+Porcine+Pepsin.">Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin.</a> Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).</li><li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3-hydroxyproline+(3Hyp)-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen.">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li><li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+(CD11c-CD18,+gp150-95).">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li><li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration.">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li><li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+gels+and+the+'Bornstein+legacy':+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration.">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li></ol>

نمو المحاور النامية هو في المقام الأول الغازية ويشمل تدهور ECM وإعادة عرض. باستخدام الإجراء المعروض هنا، يمكن للباحثين الحصول على مصفوفة ثلاثية الأبعاد متجانسة تتكون من الكولاجين الطبيعي I النوع الذي يمكن أن تستجيب فيه المحاور (أو الخلايا) لتدرج كيميائي يفرزه الخلايا المعدلة وراثياً كما ت?...

تهاجر المحاور العصبية، التي تنتهي بالمخاريط المحورية للنمو، لمسافات طويلة من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM) للجنين عبر مسارات محددة للوصول إلى أهدافها المناسبة. مخروط النمو هو الجزء البعيد من محور وهو متخصص في الشعور بالبيئة المادية والجزيئية للخلية1,2. من وجهة نظر جزيئية، يتم توجيه المخاريط النمو من قبل ما لا يقل عن أربع آليات جزيئية مختلفة: جذب الاتصال، الكيميائية، الاتصال النفور، وchemorepulsion الناجمة عن مختلف العظة توجيه محاور3،4 , 5 , 6. يمكن رصد العمليات التي يتم الاتصال بها بشكل جزئي في الثقافات ثنائية الأبعاد (2D) على ركائز صغيرة النقوش (على سبيل المثال، مع خطوط7أو8 أو بقع9 تحتوي على الجزيئات). ومع ذلك، يمكن للمحاور التنقل إلى هدفهم بطريقة غير انتشارية عن طريق الاستشعار عن بعدة جزيئات جذابة ومثيرة للاشمئزاز من خلايا الدليل في البيئة4،5،10. هنا، ونحن وصف طريقة سهلة للثقافة 3-D للتحقق مما إذا كان جزيء يفرز يحفز آثار chemorepulsive أو chemoattractive على تطوير المحاور.
وكانت الدراسات الأولى تهدف إلى تحديد آثار إشارات توجيه محور عصبي تستخدم ثقافات الزراعة في المصفوفات ثلاثية الأبعاد (3-D) لتوليد التدرجات محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12. هذا النهج، جنبا إلى جنب مع التجارب في الجسم الحي، يسمح لتحديد الأسر الرئيسية الأربع من العظة التوجيهية: Netrins، Slits، سيمابورينس، وEphrins4،5،6. هذه العظة الجزيئية والعوامل الأخرى13 متكاملة من قبل المحاور المتنامية، مما أدى إلى ديناميات المجمعات الالتصاق والقوى الميكانيكية عبر الهيكل الخلوي14،15،16. لتوليد التدرجات الجزيئية في الثقافات ثلاثية الأبعاد للملاحة المحورية، استخدم الباحثون الرواد ركائز تجلط البلازما17،والتي كانت تستخدم أيضا لتحضيرات شريحة organotypic18. ومع ذلك، في عام 1958، تم الإبلاغ عن بروتوكول جديد لتوليد هيدروجيل الكولاجين 3-D لدراسة مع أجهزة ماكسيمو19،منصة الثقافة، وتستخدم في العديد من الدراسات المناسبة للملاحظات المجهرية20. وذكرت دراسة رائدة أخرى هلام الكولاجين كأداة لتضمين الخلايا الليفية البشرية لدراسة تمايز الخلايا الليفية في الخلايا العضلية الليفية في عمليات التئام الجروح21. بالتوازي، طبّق Lumsden وDavies الكولاجين من الأدمة البقري لتحليل التأثير المفترض لعامل نمو الأعصاب (NGF) على توجيه الألياف العصبية الحسية22. مع تطوير منصات ثقافية جديدة (على سبيل المثال، لوحات متعددة الآبار) من قبل شركات ومختبرات مختلفة، تم تكييف ثقافات الكولاجين لهذه الأجهزة الجديدة6،23،24،25 ،26. في موازاة ذلك، تم توفير خلاصة من مواد ECM المشتقة من خط خلايا الورم إنغلبريث-هولم-سرب تجارياً لتوسيع هذه الدراسات27.
وقد وضعت مؤخرا عدة بروتوكولات لتوليد التدرجات الجزيئية مع الأدوار المفترضة في توجيه محور عصبي باستخدام الهلام المائي ثلاثي الأبعاد (مثل الكولاجين، الفيبرين، الخ. 28. وكبديل عن ذلك، يمكن تجميد الجزيء المرشح بتركيز مختلف في مصفوفة مسامية (مثل NGF29)أو إنشاؤه عن طريق الزراعة في منطقة صغيرة من المجاميع خلية هيدروجيل ثلاثية الأبعاد تفرز الجزيء لتوليد شعاعي التدرج4,23,24,25,26. وسيجري شرح آخر إمكانية في هذا البروتوكول.
الإجراء المعروض هنا هو طريقة سهلة وسريعة وقابلة للاستنساخ للغاية استنادا إلى تحليل النمو المحوري في الثقافات هيدروجيل 3D من الدماغ الماوس الجنيني. بالمقارنة مع الطرق الأخرى، فإن البروتوكول مناسب تماما للباحثين غير المدربين ويمكن تطويره بالكامل بعد تدريب قصير (1-2 أسابيع). في هذا البروتوكول، نقوم أولاً بعزل الكولاجين عن ذيول الفئران البالغة لزيادة توليد المصفوفات ثلاثية الأبعاد التي يتم فيها زراعة مجاميع الخلايا المعدلة وراثياً أمام الأنسجة العصبية الجنينية. وتشكل هذه المجاميع الخلية تدرجات كيميائية شعاعية لجزيء مرشح مما يثير استجابة للمحاور المتنامية. وأخيرا، يمكن بسهولة تقييم آثار الجزيء على نمو المحاور باستخدام المجهر التباين المرحلة أو، بدلا من ذلك، أساليب Immunocytochemical.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1176px;" width="1176">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:455px;">Material</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adult Sprague-Dawley rats (8 to 9 weeks old)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">B27 serum-free supplement 50x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cDNA plasmid vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">COS1 cell lines</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-1570</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16325</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">D-(+)-glucose (45% solution in water) for complete Neurobasal medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">D-MEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium 1x ) for COS1 culture medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-029</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline 10x (without Ca2+ and Mg2+) (D-PBS) for cultures</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>merck</td>
			<td>108543</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Ethylenediaminetetraacetic acid dihydrate disodium salt (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Fluorescence mounting media (e.g., Fluoromount-G or similar)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences (EMS)</td>
			<td>17984-25</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gelatin powder&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Glacial acetic acid (Panreac, cat. no. 211008)</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>211008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>24020083</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Heat-inactivated foetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10108-165</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Heat-inactivated horse serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26050-088</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Hydrogen peroxide (H2O2, 32 to 33% in water)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>316989</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine 200 mM solution (100x) for complete Neurobasal and COS1 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Mice pregnant female (embryonic day 12.5 to 16.5; E12.5-16.5)&#160;</td>
			<td>Criffa-Credo, Lyon, France</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11012-044</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Monoclonal antibody against class III &#946;-tubulin (clone TUJ-1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801201</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17502-048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal medium&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103049</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,040,051,000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/streptomycin solution 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-22</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline 10x (PBS) for immunocytochemistry</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9624</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody: biotinylated horse anti-mouse&#160;</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>BA-2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serum-free medium (Opti-MEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>162712</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate solution 7.5%&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25080-094</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile culture grade H2O&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W3500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TritonTM X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (Trypsin (0.05% (wt/vol) with EDTA (1x)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:455px;">Equipment</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 large and 1 small curved scissors for dissection&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15-ml conical centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 haemostats&#160;&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 small straight dissecting scissors</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml centrifuge tubes for centrifugation</td>
			<td>Nalgene or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200-ml sterile glass conical flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-litre glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4- and 6-well culture plates&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740 and 140675</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipette pumps and disposable 10 ml and 25 ml filter-containing sterile plastic pipettes.</td>
			<td colspan="2">Gilson, Brand, Eppendorf or similar&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic pipettes, sterile filter tips and current sterile tips&#160;</td>
			<td>Gilson, Eppendorf or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top microcentrifuge with angle fixed rotor&#160;</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bench top refrigerated centrifuge with swing-bucket rotor (with 1.5, 15 and 50 ml tube adaptors)</td>
			<td colspan="2">Eppendorf, Beckman Coulter or similar</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture incubator at 37 &#186;C, 5% CO2 and 95% air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing cellulose membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9402</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialysis tubing closures&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z37101-7</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable glass pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope with dark field optics&#160;</td>
			<td>Olympus SZ51 or similar&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">High-speed refrigerated Beckman Coulter centrifuge or similar with angle fixed rotor</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large 100-mm, 60-mm and small 35-mm &#216; cell culture dishes&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>&#160;150679 , 150288 and 150318, respectively</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnetic stirrer and magnetic spin bars</td>
			<td>IKA or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td>Mickle Laboratory Engineering</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of fine straight forceps and one pair of curved forceps&#160;</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades for the tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpels (number 15 and 11)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two pairs of fine spatulas for transferring collagen and tissue pieces</td>
			<td>Fine tools Instruments or similar</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of 3-d collagen-based hydrogels to analyze axonal growth and behavior during nervous system development

يستخدم هذا البروتوكول الكولاجين الطبيعي من النوع الأول لتوليد هيدروجيل ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) لرصد وتحليل النمو المحوري. ويتركز البروتوكول على زراعة قطع صغيرة من أدمغة القوارض الجنينية أو المبكرة بعد الولادة داخل هيدروجيل ثلاثي الأبعاد يتكون من النوع المشتق من ذيل الجرذان I مع الكولاجين المسامية محددة. يتم استزراع قطع الأنسجة داخل هيدروجيل وتواجه شظايا الدماغ محددة أو مجاميع الخلايا المعدلة وراثيا لإنتاج وإفراز جزيئات مناسبة لخلق تدرج داخل المصفوفة المسامية. إن خطوات هذا البروتوكول بسيطة وقابلة للاستنساخ ولكنها تشمل خطوات حاسمة للنظر فيها بعناية أثناء وضعها. وعلاوة على ذلك، يمكن رصد سلوك المحاور المتنامية وتحليلها مباشرة باستخدام المجهر على النقيض من المرحلة أو المجهر الفلورسنت أحادية / متعددة الفوتونات بعد التثبيت عن طريق الأساليب المناعية.

هنا، نقدم منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة النمو المحوري في الثقافات الكولاجين هيدروجيل 3-D من الجهاز العصبي الماوس الجنيني. ولهذه الغاية، قمنا بعزل الكولاجين من ذيول الفئران البالغة لتوليد مصفوفات ثلاثية الأبعاد قمنا فيها بزراعة مجاميع الخلايا المعدلة وراثياً التي تعبر عن N...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development at JoVE.com

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

هنا، نحن نقدم طريقة لتحليل سلوك نمو المحاور في المصفوفات ثلاثية الأبعاد، ومحاكاة نموها الطبيعي.

توليد الجيل من 3D الكولاجين القائم على Hydrogels لتحليل النمو المحوري والسلوك أثناء تطوير الجهاز العصبي

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

هذه الطريقة مفيدة من أجل تحليل دور بعض الجزيئات في التوجيه المحوري والهجرة العصبية خلال تطوير النظام العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تحليل النتائج سريع وبسيط ولا يتطلب برامج معقدة مما يعني الكثير من التدريب للباحثين. وسوف يكون إثبات الإجراء ميريان سيغورا فيليو، وهو فني من مختبرنا.لبدء لوحة 200، 000 COS-1 الخلايا في 35 ملليمتر أطباق بيتري واحتضان مع ثقافة كاملة المتوسطة في حاضنة ثقافة الخلية من أجل قراءة 70 إلى 80٪ التقاء بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إلى transfect COS-1 الخلايا مع الحمض النووي ترميز جزيء المرشح باستخدام طريقة تحويل الدهون القائمة على. خلط أول 250 ميكرولترات من مصل المتوسطة الحرة واحد إلى 2 ميكروغرام الحمض النووي في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.لإعداد أنبوب الدهنية، إضافة 240 ميكرولترات من المتوسطة المصل الحرة و 10 ميكرولترات من كاشف الحملات الدهنية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، إضافة محتوى أنبوب الحمض النووي إلى أنبوب lipsomal. اخلطي المزيج ويندمجي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.استبدال المتوسطة على الخلايا المستزرعة مع 1.5 ملليلتر من المتوسطة المصل الحرة. إضافة خليط الدهون الحمض النووي ببطء وإسقاط الحكمة إلى الخلايا. احتضان في حاضنة ثقافة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات.بعد الانتهاء من الحضانة، استبدال الوسط مع الوسط ثقافة كاملة واحتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة. في اليوم التالي، شطف الخلايا مع 0.1 مولر Dulbecco في برنامج تلفزيوني. أضف 800 ميكرولترات التربسين EDTA لكل طبق وحضن لمدة خمس إلى 15 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.جمع الخلايا المنفصلة مع ملليلترين من المتوسط ثقافة كاملة في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وإضافة 10 ملليلتر من نفس المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في أربع درجات مئوية في 130 مرات ز لمدة خمس دقائق. إزالة فائقة والحفاظ على بيليه التي تحتوي على COS-1 الخلايا على الجليد.بعد إعداد خليط عمل الكولاجين، إضافة 100 إلى 150 ميكرولترات من خليط الكولاجين إلى بيليه من الخلايا المصابة ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. انتشار 45 إلى 50 ميكرولترات من خلية الكولاجين بيليه خليط على طبق بيتري 35 ملليمتر لتشكيل الفرقة موحدة من خلايا الكولاجين، ما يقرب من واحد إلى 1.5 سنتيمتر. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم ملاحظة الجلة.إعداد شريط ثان يحتوي على خلايا تحكم في طبق ثقافة ثانٍ وضعه في الحاضنة. عند الانتهاء من الجيل، إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من 37 درجة مئوية درجة حرارة COS-1 ثقافة كاملة متوسطة لكل طبق يحتوي على شرائط خلية الكولاجين هلام ووضعها في الحاضنة. استخدام مشرط غرامة أو مروحية الأنسجة لقطع شرائط خلية الكولاجين لتوليد قطع مربعة صغيرة، 400 إلى 500 ميكرومتر في الطول.نقل جميع المقاطع من نفس حالة transfection إلى طبق بيتري تحتوي على ثلاثة إلى 3.5 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا العصبية. تحقق تحت مجهر تشريح نوعية القطع ووضع الأطباق في الحاضنة. استخدام مقص لقطع قرون الجنين في يوم الجنين 16.5 من تجويف البطن من الفئران الإناث الحوامل التضحية ووضعها في طبق بيتري كبير يحتوي على عازلة HBSg الباردة.ضع الطبق في غطاء تدفق الفارني واستخدم ملقطًا مستقيمًا لاستخراج الأجنة ووضعها في طبق جديد يحتوي على HBBSg بارد. مع ملقط صغيرة، وإزالة الجلد، ومن ثم مع ملقط منحنية ومستقيمة، تشريح بعناية الدماغ ومكان في طبق يحتوي على HBSSg الباردة. تحت مجهر تشريح، وذلك باستخدام مشرط أو مقص غرامة، وقطع الدماغ في النصف على طول خط الوسط لفصل كلا نصفي الكرة الأرضية.ثم، إزالة diencephalon ومع ملقط غرامة، وإزالة السحايات والأوعية الدموية من قطع الدماغ. استخدام 100٪ الإيثانول لتنظيف جميع أجزاء من المروحية الأنسجة، وخاصة PTFE لوحة قطع وشفرة الحلاقة والحفاظ على المروحية الأنسجة في غطاء تدفق لامين تحت الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. نقل كل قطعة الأنسجة إلى لوحة قطع من المروحية الأنسجة.بعد أن تم تقطيع الأنسجة ، نقل القطع من 35 ملليمتر الأطباق بيتري مليئة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من NCM كاملة. باستخدام الإبر التنغستن غرامة، والانتهاء من تشريح الأنسجة في NCM كاملة. تحقق من جودة الشرائح التي تم الحصول عليها تحت المجهر التشريح، والتأكد من أن الطبقات يمكن التعرف عليها بوضوح في البصريات الحقل المظلم وتشريح المنطقة ذات الاهتمام مع الإبر التنغستن.الحفاظ على نوعية جيدة القطع في متوسطة NCM كاملة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. إن المظاهرات البصرية أمر حاسم في الخطوات المتعلقة بإعداد الثقافات المشتركة التي تسهل الكلمات لفهم العملية. وضع عدة صحن استزراع الأربعة المعقمة في غطاء تدفق الفارني وإعداد خليط عمل الكولاجين كما كان سابقاً.إضافة 15 إلى 20 ميكرولترات من خليط هيدروجيل في الجزء السفلي من كل بئر لإنتاج قاعدة الكولاجين دائرية. ضع الأطباق في الحاضنة حتى يتم ملاحظة الهلام الكامل. وتحقق من نوعية الكولاجين هلام.مع ماصة، نقل قطعة صغيرة من COS-1 خلية تجميع على قاعدة هيدروجيل، ثم استخدام ماصة لوضع قطعة من الأنسجة على نفس القاعدة، على مقربة من قطعة من الخلايا المجمعة على مسافة واحدة حجم explant. بعد إعداد خليط الكولاجين العمل الجديد على الجليد، ماصة بلطف 15 إلى 20 ميكرولترات من هذا الخليط الجديد لتغطية explant وتجميع الخلايا، مما يجعل شطيرة مثل ثقافة الهيدروجيل. استخدام إبرة التنغستن غرامة لإعادة توجيه explant بحيث يواجه خلية الكلي في 500 إلى 600 ميكرومتر.العودة لوحة إلى الحاضنة حتى يتم ملاحظة هلام ومن ثم إضافة 0.5 ملليلتر من NCM كاملة تستكمل مع 2٪ B27 تكملة والحفاظ على الثقافات لمدة 36 إلى 48 ساعة في الحاضنة. عندما واجهت محاور فرس النهر مع نيترين-1، نمت بشكل تفضيلي نحو مصدر نيترين-1، مما يشير إلى أن نيترين-1 يعمل كجزيء جذاب كيميائي لهذه المحاور. في حالة التحكم ، أو transfection وهمية ، نمت جميع المحاور عصبيا ، دون أي تفضيل الاتجاه.عندما واجهت محاور فرس النهر مع خلايا إفراز Sema3E، نمت معظمها عكس الخلية الكلية، مشيرا إلى أن Sema3E بمثابة جزيء مثير للاشمئزاز العلاج الكيميائي لهذه المحاور. ويبين هذا التمثيل التخطيطي لاستجابة محور عصبي وطريقة القياس الكمي أنه في ظروف التحكم، كانت المحاور المحورية موزعة بالتساوي في كل من الأرباع القريبة والعرجية، وتظهر مع نمو إشعاعي. وهذا يشير إلى نسبة قريبة أو نسبة PD واحدة.عندما أظهرت explants زيادة عدد المحاور في الربع القريب بالمقارنة مع القعدة ، مما يدل على جاذبية العلاج الكيميائي ، كانت نسبة PD أكبر من واحد. عندما كان عدد محاور عصبية أعلى في الربع القعد منه في واحد القريبة، مما يدل على التنافر الكيميائي، كانت نسبة PD أقل من واحد. بعد هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على معلومات أساسية حول دور بعض الجزيئات أثناء تطور الخلايا العصبية، مما يسمح لنا بإنشاء نقطة انطلاق لمزيد من استكشاف الوظائف.على الرغم من أن هذه التقنية مفيدة في تطوير الخلايا العصبية كما هو، فإنه يمكن أيضا أن تطبق في الفحص الدوائية، الأوعية الدموية، وهندسة الأنسجة والاستراتيجيات.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

تحجيم Fluidic صالحة للحقن الفيروسية استهداف سليمة دوائر الدماغ 3 - D

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

معالجة ميكانيكية من الخلايا العصبية للسيطرة على تطوير محواري

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

التصوير في الوقت الحقيقي من محور عصبي نقل الكم دوت المسمى عامل التغذية العصبية في الخلايا العصبية الابتدائية

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

التصوير 3-D وتحليل الخلايا العصبية المصابة<em&gt; في فيفو</em&gt; مع<em&gt; التوكسوبلازما</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

تعديل لColliculo-مهادية قشرية ماوس الدماغ شريحة، دمج الطباعة 3-D من مكونات الغرفة ومتعدد المقاييس التصوير الضوئي

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الزحف السلوك

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...