Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

ونحن نشكر سنترو دي Ecología y Biodiversidad CEBIO ، اريكا بإليزا ، ميليسكا سانشيز ، خورخي كاريرا ، ادغار رينغيفو فاسكيز ، هارولد بوروكاريرو زاريا ، خورخي رويس ليفيو ، خايمي بيتشيكو كاستيلو ، كارلوس تيلو ، فاني كورنيخو ، وفانيي فرنانديز ميلو لصنع الانسجه تجميع في بيرو يمكن. ونشكر أيضا جميع أعضاء مجموعه جوارافا ويولاندا ليون لجعل جمع الانسجه في الجمهورية الدومينيكية ممكنا ، فضلا عن برنال رودريغيز هيرنانديز ، برنال ماتاريتا ، والجميع في محطه لا سيلفا للبحوث البيولوجية في كوستاريكا ، لجعل أخذ العينات ممكن. ونحن نشكر آيلا Lattenkamp & لوتس Wiegrebe للوصول وجمع عينه من اللكمات الجناح من الخفافيش اللون Phyllostomus لتوليد ثقافة الخلية. [ فلولوستووس] [ديسلون] خفاش نشا من يتوالد مستعمره في القسم علم الاحياء [ايي] من [لودويغ-ماكسيميليان-ونيفرستي] في ميونيخ. تم إصدار الموافقة علي الحفاظ علي وتولد الخفافيش من قبل مكتب البيطرية منطقه ميونيخ. تم تمويل LMD و SJR و KTJD و LMD من قبل NSF-DEB 1442142. تم تمويل LMD من قبل NSF-DEB 1838273. وقد تم تمويل LRY من قبل NSF-PRFB 1812035. تم تمويل SCV و PD من قبل جائزه مجموعه ماكس بلانك البحثية ، ومنحه البحوث برنامج علوم الحدود البشرية (HFSP) (RGP0058/2016). تم تمويل SJR ، JHTP المشاركة ، و KTJD من قبل مجلس البحوث الأوروبي (الاغاثه الاوليه التي بدات منحه 310482 [EVOGENO]) الممنوحة ل SJR ، تم تمويل الخ من قبل المجلس الأوروبي 2012 للبحوث منحه (StG311000).

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانية (IACUC) من جامعه ستوني برؤاك (البروتوكول #2013-2034).
1-القتل الرحيم
<ol><li>بلل كره من القطن مع مخدر ايزوفلواني أو مخدر آخر متاح.</li>
	<li>ضع كره القطن في كيس من البلاستيك محكم الغلق. يجب ان تكون الحق...

يصف البروتوكول الذي تمت مناقشته في هذه المخطوطة أفضل ممارسات أخذ العينات لمختلف التحليلات الجزيئية عاليه الانتاجيه للخفافيش. جميع الدراسات الناجحة-الomics تتطلب انسجه عاليه الجودة ، ولكن أخذ العينات الانسجه الخفافيش ، فضلا عن غيرها من الكائنات غير النموذجية ، وغالبا ما يحدث في الظروف المي...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

ومع تقدم تكنولوجيات التسلسل العالية الانتاجيه ، فان الطرق الموحدة لاكتساب الانسجه عاليه الجودة والحفاظ عليها تسمح بتمديد هذه الأساليب إلى الكائنات غير النموذجية. وقد وضعت سلسله من البروتوكولات لتحسين جمع الانسجه من الخفافيش لسلسله من النهج تسلسل الانتاجيه العالية. وترد هنا بروتوكولات للقبض علي الخفافيش ، والديموغرافيات المطلوبة لجمعها لكل الخفافيش ، والأساليب الأمثل للحد من الإجهاد علي الخفافيش اثناء جمع الانسجه. وحددت بالتحديد طرق لجمع ومعالجه الانسجه للحصول علي (ط) الحمض النووي للتحليلات الجينية عاليه الوزن الجزيئي, ' 2 ' RNA لناسخات الانسجه الخاصة, و ' 3 ' البروتينات للتحليلات المستوي البروتيني. وأخيرا ، فان الخطوط العريضة أيضا هي طريقه لتجنب أخذ عينات مميته عن طريق خلق ثقافات خلايا أوليه قابله للاستمرار من مقاطع الجناح. والدافع الرئيسي لهذه الطرق هو تعظيم كميه البيانات الجزيئية والمورفولوجية المحتملة لكل مضرب واقتراح الطرق المثلي للحفاظ علي الانسجه بحيث تحتفظ بقيمتها مع تطور الأساليب الجديدة في المستقبل. وقد أصبح هذا التوحيد مهما بشكل خاص كمبادرات لتسلسل مستوي الكروموسوم ، والجينوم خاليه من الأخطاء من الأنواع في جميع انحاء العالم قد برزت ، والتي العديد من الأحزاب العلمية تتصدر تسلسل التصنيفية المختلفة مجموعات. البروتوكولات المبينة هنا تحدد جمع الانسجه المثالية وأساليب الحفاظ علي الانسجه ل Bat1K ، الاتحاد الذي هو تسلسل الجينوم من كل نوع من أنواع الخفافيش.

الحمض النووي للتحليلات القياسية منخفضه الوزن الجزيئي (lmw) ، تم استخراج الحمض النووي من ثلاثه أنواع الخفافيش مداريه. وجمعت عينات من الانسجه في الميدان من الجمهورية الدومينيكية وكوستاريكا ، وفقا للبروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة. بعد تشريح, قطع صغيره (< 0.5 سم في...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

هذا هو بروتوكول لاعداد الانسجه الأمثل لالجينوم ، الناسخ ، وتحليلات بروتينيه من الخفافيش اشتعلت في البرية. وهو يتضمن بروتوكولات للتقاط الخفافيش والتشريح ، والحفاظ علي الانسجه ، والذبح الخلية من انسجه الخفافيش.

جمع الانسجه من الخفافيش للتحليلات الomics وثقافة الخلايا الاوليه

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

في هذا الفيديو، نقدم دليلًا خطوة بخطوة لجمع الخفافيش بطريقة إنسانية، تهدف إلى تقليل التأثير على السكان وتعظيم القيمة العلمية. مزايا نهجنا هي أن نزيد من كمية البيانات الجزيئية والمورفولوجية المحتملة لكل خفاش ، والحفاظ على الأنسجة للحفاظ على قيمتها المستقبلية ، وتقليل حصاد الأفراد البرية. بروتوكولات تشريح يصعب إثبات لفظيا.العديد من تقنيات إعداد الأنسجة التي نقدمها هنا يتم توصيلها بشكل أفضل من خلال تصور كيفية تحديد الأعضاء المختلفة ، ومن ثم تشريحها وتخزينها بشكل صحيح. إعداد جميع قوارير قبل البدء في أي تشريح لتجنب التأخير. بالنسبة للرنا، خصص عدد القنينات اللازمة لكل عينة.تسمية كل أنبوب مع نوع الأنسجة التي سيتم جمعها، فضلا عن معلومات تحديد العينة القياسية. ملء قوارير 50٪ كامل من حمض الريبا حل الاستقرار، والبرد إلى أربع درجات مئوية. الحرص على عدم ملء قوارير تماما مع حمض نووي الريبي استقرار الحل, كما قد تنفجر أنبوب عند وضعه في النيتروجين السائل.مباشرة بعد القتل الرحيم، قم بقطع رأس عينة الخفافيش كما هو موضح في بروتوكول النص. جلد الجمجمة من الشعر، اللفافة، وعضلات الجمجمة، بما في ذلك الجلد على الأنف. الحرص على عدم كسر الواجهة الأمامية للأنف.إزالة العينين مع ملقط، وذلك باستخدام قوة قوية بما فيه الكفاية لفصل العصب البصري. ضع العينين في قارورة مليلتر من محلول استقرار الحمض النووي الريبي. استخدم المقص لإجراء قطع القوس على الجزء الظهري من الجمجمة بدءًا من الرقبة ، مع الحرص على عدم تلف الدماغ.ثم، استخدام ملقط لسحب بلطف كلا الجانبين من الجمجمة، حتى تصدع مفتوحة لفضح الدماغ. تأكد من إزالة جمجمة نهاية الجمجمة، بحيث يمكن أن تتخلص من ملقط بسهولة الدماغ. كشط الدماغ بلطف مع ملقط.الدماغ سيكون ناعم جداً سوف تصبح لمبة حاسة الشم مرئية، ويجلس في الجزء البطني من الجزء الداخلي من الجمجمة. حاول أن تبقي المصباح الشمي ملتصقاًإذا كان ذلك ممكنا، والحفاظ على شكل الدماغ سليمة، ووضعها على الفور على الجليد الجاف، أو في قارورة خمسة ملليلتر من حمض نوويRNA استقرار الحل. على نهاية السد من الجمجمة، وينبغي أن cochlei الآن مرئية بشكل جانبي على كل جانب من الرأس. استخدام ملقط لسحب بلطف cochlei.ثم، وضعها في قارورة ملليلتر واحد من حمض نوويRNA استقرار الحل. جعل اثنين من الشقوق حيث العلوي والسفلي الفك الانضمام، وإزالة الفك السفلي. سوف تصبح لوحة cribriform واضحة.هذا هو العظام الحرجة للحفاظ على الباحث الموجهة. ويمكن تحديدها على أنها المنطقة الأكثر الأمامي من الجمجمة، مع عدة رواه، ومع اثنين من الأخاقد حيث المصباح الشمي تقع. وبمجرد إزالة الفك السفلي، أزل المنصة من الجزء المتبقي من الجمجمة.تأكد من أن الفك يحتوي على لوحة cribriform. وضع الأنف في حمض نوويRNA استقرار الحل، وتخزينها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. من الفك السفلي، وقطع اللسان مع مقص، ومكان في قارورة ملليلتر من حمض نوويRNA استقرار الحل.وضع قارورة الأنف في النيتروجين السائل بعد نقع بين عشية وضحاها في حمض الريبا حل الاستقرار. بعد 24 ساعة من القع على الجليد، أو في الثلاجة، ضع العينات في النيتروجين السائل. استخدام مشرط لاختراق من خلال تجويف البطن، مما يجعل شق طولي يصل إلى الأضلاع.هذا يفقد الإطار الهيكلي. تعري الجلد للكشف عن العضلات الصدرية، وأخذ عينتين على الأقل من العضلات. يتم جمع الأنسجة لكل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي خلال هذه التشريحات.مكان الأنسجة للوزن الجزيئي العالي الحمض النووي في اكريفالات جافة، وتجميد فلاش في النيتروجين السائل. مكان الأنسجة للرنا في حمض الريبا حل الاستقرار. قطع من خلال القص، وسحب بعيدا الأضلاع.الآن، إسترجاع الرئة والقلب. استخدم المشرط والملباب لفصل القلب عن الرئة. استخدام مشرط لتفريق الرئة، ووضع في حمض نوويRNA استقرار الحل.جمع القلب، والتي يمكن أن تؤخذ كاملة، ولكن ينبغي أن تكون مقسمة إلى أنصاف، بحيث يتمقع حل استقرار الجيش الملكي النيبالي تماما. الآن، أخذ عينات من الكبد. خذ على الأقل عينتين من الكبد.ضع عينة واحدة في قارورة لتبقى مجمدة للحمض النووي عالي الوزن الجزيئي ، ووضع العينة الأخرى في محلول استقرار الحمض النووي الريبي. اتبع القناة الكبدية للعثور على البنكرياس والمرارة. نقل المرارة إلى قارورة من حمض الريبا حل الاستقرار.العثور على المعدة، والطحال مثل الريش في قاعدة انها، التي تظهر كظل مختلف من الأرجواني. يجب أن يكون البنكرياس أيضا مرئية هنا كبنية الوزن. جمع المعدة والطحال والبنكرياس، في قارورة كل من الحمض النووي الريبي استقرار الحل.جمع عينات صغيرة من الأمعاء الصغيرة والكبيرة. مكان في قارورة كل من حمض الرنا حل الاستقرار. تأخذ واحدة من الكلى، واتبع قنواتها إلى المثانة، ثم وضع في قارورة كل منهما من حمض الريبا حل الاستقرار.استخدم الكلى الأخرى كدليل للعثور على الخصيتين إذا كان ذكراً، أو رحماً ومبيضاً إذا كانت أنثى. جمع واحد أو كل من الهناد إذا كان ذلك ممكنا. أيضا أخذ عينات من أجزاء مختلفة من الجلد من الجناح، والاحتفاظ بها في قارورة منفصلة.الميزة الرئيسية لنهجنا هو أنه يسمح لنا لأخذ عينات الحيوانات بطريقة غير قاتلة، في حين لا تزال تولد ما يكفي من المواد لدراسات الجينوم، فضلا عن الدراسات الجزيئية الوظيفية. بروتوكولنا يسمح بإعداد الخلايا الليفية الأولية من أنسجة الجناح. وتمثل هذه الخلايا مصدراً ثميناً متجدداً للمواد الوراثية، فضلاً عن نموذج للاستكشافات الوظيفية والجزيئية في الخفافيش.يجب نقل مقاطع الجناح التي تم الاحتفاظ بها في وسائط النمو حسب القسم السادس من البروتوكول المكتوب إلى مرفق زراعة الأنسجة. نقل محتويات الأنبوب إلى أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر. يستخدم غشاء الجناح خزعة لهذا العرض.إزالة بعناية متوسطة النمو. غسل بلطف الخزعة مرتين مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. إضافة 500 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر الكولاجين أربعة إلى الأنبوب.وهذا سوف يسبب هضم الأنسجة في الخلايا الفردية. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون تحريض. في اليوم الثاني، جعل متوسط النمو الجديد، وقبل الدفء إلى 37 درجة مئوية.إعداد ستة بئر لوحة الأنسجة عن طريق إضافة ملليلترين من الطازجة قبل الدفء المتوسطة النمو في كل بئر من لوحة لاستخدامها. تخزين هذه اللوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ حتى الحاجة. إزالة أنبوب 15 ملليلتر التي تحتوي على الخلايا من الحاضنة، وإخماد رد فعل الهضم عن طريق إضافة ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازج.Resuspend الخلايا عن طريق triturating بعناية الحل مع طرف P1000 ماصة لتحقيق تعليق خلية واحدة. تدور بلطف أسفل الخلايا في جهاز طرد مركزي الطاولة لمدة ثلاث دقائق في 300 مرة G.Discard المابير عن طريق إزالة بلطف 80 إلى 90٪ من السائل مع ماصة P1000. Resuspend بيليه في 500 microliters من متوسطة النمو مسبقا.قم بتكوير التعليق بلطف لضمان أن البيليه لم يعد مرئيًا ، وأن الخلايا معلقة بما فيه الكفاية ، مع التأكد من تجنب قطع صغيرة من الأنسجة التي قد تكون لا تزال مرئية على الجدران. بلطف ماصة كامل حجم تعليق الخلية في بئر واحد من لوحة الآبار الستة التي تم إعدادها في وقت سابق، تحتوي على وسائل الإعلام النمو قبل الدفء. صخرة بلطف لوحة من جانب إلى آخر ومن الأمام إلى الوراء مرتين إلى ثلاث مرات لمساعدة الخلايا على توزيع على سطح البئر في طبقة واحدة.تحقق من الخلايا المطلية تحت المجهر. يجب أن تكون خلايا واحدة تظهر مُتَمَرّحة و عائمة، لكن كثيفة جداً. ضع اللوحة بعناية في حاضنة مسبقة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد حوالي 24 ساعة، لاحظ الخلايا تحت المجهر لتحديد صحة الثقافة. الخلايا يجب أن تكون الآن تعلق على سطح لوحة، وتظهر بالارض. الحفاظ على الخلايا في حاضنة مرطبة مسبقا إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.وينبغي أن تكون لاحظت الخلايا تحت المجهر بانتظام لتحديد الحاجة إلى المرطبات وسائل الإعلام أو تقسيم. كلما لزم الأمر، بعناية تعرق ما يقرب من 50٪ من المتوسط من البئر، وإضافة بلطف ملليلتر واحد من متوسطة النمو مسبقا إلى جانب البئر، حتى لا يزعج الخلايا. عندما يكون من الضروري تمرير الخلايا، بعناية التعرق تقريبا 90٪ من متوسطة النمو.غسل الخلايا بلطف شديد عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة إلى جدار البئر، حتى لا يزعج الخلايا. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا والجانب إلى الجانب مرتين إلى ثلاث مرات. pirate بعناية كل من برنامج تلفزيوني من لوحة قبل غسل الخلايا مرة أخرى.إضافة التربسين EDTA إلى البئر، وروك بلطف لوحة لتغطية سطح كامل من البئر مع التربسين EDTA، واحتضان لمدة دقيقة ونصف في درجة حرارة الغرفة. إخماد رد الفعل عن طريق إضافة ملليلتر واحد من متوسط النمو الطازجة مسبقا. الماصات صعودا وهبوطا ما يقرب من خمس مرات لغسل الخلايا من سطح لوحة، وضمان الخلايا في التعليق.ضع تعليق الخلية في أنبوب 15 ملليلتر، وتدور أسفل الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدة لمدة ثلاث دقائق في 300 مرة G.Discard المابير عن طريق إزالة بلطف 80 إلى 90 في المئة من السائل مع ماصة P1000. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من متوسطة النمو مسبقا، و triturate بلطف تعليق. تأكد من أن بيليه أو شظايا كبيرة من بيليه لم تعد مرئية، والخلايا في تعليق خلية واحدة.لحساب الخلية باستخدام عداد خلية الآلي، مزيج من 10 ميكرولتر aliquot من الخلايا المعلقة واحد إلى واحد مع الأزرق trypan للكشف عن الخلايا القابلة للحياة. احتضان لمدة دقيقة واحدة، والماصات 10 ميكرولترات من الحل على الشريحة العد. أدخل شريحة العد في عداد خلية تلقائي لحساب الخلايا باستخدام الإعدادات المناسبة.إعداد وسائل الإعلام تجميد من خلال الجمع بين متوسط النمو مع DMSO للحصول على تركيز نهائي من 10٪ DMSO. وينبغي إعداد بيليه من 80 إلى 90٪ التقاء جيدا من ستة بئر لوحة. resuspend بيليه في ملليلتر ونصف من تجميد المتوسطة.ضع حوالي 750 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل من cryتين المنفصلتين. ضع القنينات في حاوية تجميد التبريد، بحيث تتجمد الخلايا ببطء للحفاظ على حيوية الخلية. ضعهم على الفور عند 80 درجة مئوية ناقص.لإذابة الخلايا المجمدة، وإعداد لوحة ستة بئر تحتوي على مليلترين من متوسط النمو مسبقا في كل بئر التي سيتم استخدامها. الحفاظ على لوحة في 37 درجة مئوية وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ حتى الحاجة. خذ قارورة واحدة من الخلايا من النيتروجين السائل، ووضعها في حمام الماء الدافئ لذوبان الخلايا بسرعة.هذا يجب أن يستغرق دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بمجرد أن يذوب المحلّل في القارورة، فإنّ الماصات بلطف ترتفع وتُنْصَل لتجانس المحلّل، وعلى الفور وضع المحلّل بأكمله في بئر واحد من الـ6 صحن بئر. صخرة بلطف لوحة من جانب إلى آخر ومن الأمام إلى الوراء مرتين إلى ثلاث مرات لمساعدة الخلايا على توزيع على سطح البئر في طبقة واحدة.وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و5 في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. مراقبة مرور الخلايا كما هو موضح. وتظهر النتائج التمثيلية لاستخراج الحمض النووي لتحليل الحمض النووي القياسية من ثلاثة أنواع الخفافيش.يشير نطاق واحد كبير إلى حد أدنى من التجزؤ، وأجزاء مماثلة الحجم من الحمض النووي من كل استخراج لكل منها. مؤشر مشترك لنجاح استخراج الحمض النووي الريبي هو عدد RNA سلامة، أو RIN، مع القيم فوق ثمانية تمثل جودة عالية في رنا اللباقة. تظهر هنا قيم RIN لاستخراج الحمض النووي الريبي من 13 نوعًا مختلفًا من أنواع الخفافيش النيوروبية ، تم أخذ عينات منها في أربع مناطق مختلفة.تم وضع الأنسجة التي تم أخذ عينات منها من الأنواع في أنديس، كوستاريكا، وجمهورية الدومينيكان مباشرة في النيتروجين السائل بعد نقع في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم وضع الأنسجة التي تم أخذ عينات منها من الأنواع في منطقة الأمازون في النيتروجين السائل بعد أسبوع تقريبًا من وضع محلول استقرار الحمض النووي الريبي ، والاحتفاظ بها عند أربع درجات مئوية بشكل مستمر. وحتى في مثل هذه الحالات، كانت قيم RIN مماثلة لتلك التي وضعت على الفور في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي، ومباشرة في النيتروجين السائل.بعد زراعة الأنسجة، يجب أن تغطي الثقافات خلية الخفافيش 80 إلى 90٪ من سطح لوحة، والحفاظ على مورفولوجيا الأصلي. وهذا يمثل المرحلة المثلى لتقسيم. بعد أكثر من ستة مقاطع، سوف الخلايا تغيير مورفولوجيا لتصبح أكبر وأطول، والخلايا ستدخل senescence.الخلايا الزاهية الكرة حتى تمثل الخلايا الميتة. تمثل الخلايا في الثقافة مصدرًا متجددًا للمواد ، مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. ويمكن تجميد هذه الخطوط الخلوية، مما يوفر موردا يمكن استخدامه على مدى سنوات عديدة من البحث.وهذا يسمح الدراسات الجينومية، النسخية، والوظيفية التي سوف تكون صعبة باستخدام الأنسجة الأولية. على سبيل المثال، يمكن تعديل الخلايا وراثيا أو كيميائيا لمراقبة الآثار على الأنماط الظاهرية الخلوية.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning السقالات بوليمر الليفية للهندسة الأنسجة والخلايا الثقافة

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

التعريفي واختبار نقص الأكسجة في الثقافة خلية

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold وصفها نظام Endosomal خميرة التحليلات التركيبية

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

بروتوكول الفيديو من عدوى فيروسات الرجعية في الابتدائية المعوية عضي الثقافة

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...