Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Vi takker Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo og Fanny Fernández Melo for at gøre vævs indsamling i Peru muligt. Vi takker også alle medlemmer af Grupo Jaragua og Yolanda León for at gøre vævs indsamling i den Dominikanske Republik muligt, samt til Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, og alle på La Selva biologisk forsknings station i Costa Rica, for at gøre mulighed for stikprøveudtagning. Vi takker Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe for adgang og prøve samling af vingeslag fra Phyllostomus misfarve flagermus til generering af cellekultur. Phyllostomus misfarende flagermus stammede fra en avls koloni i Department Biology II af Ludwig-Maximilians-universitetet i München. Godkendelse til at beholde og opdrætte flagermus blev udstedt af München distrikts Veterinærkontor. LMD, SJR, KTJD og LRY blev finansieret af NSF-DEB 1442142. LMD blev finansieret af NSF-DEB 1838273. LRY blev finansieret af NSF-PRFB 1812035. SCV og PD blev finansieret af en Max Planck-forskningsgruppe Award og et forskningsstipendium til human grænse Science program (HFSP) (RGP0058/2016). SJR, JHTP og KTJD blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (ERC start Grant 310482 [EVOGENO]) tildelt SJR, ECT blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (ERC-2012-StG311000).

Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Stony Brook University (protokol #2013-2034).
1. eutanasi
<ol><li>Fugt en bomulds kugle med en isofluran bedøvelsesmiddel eller en anden tilgængelig bedøvelse.</li>
	<li>Placer bomulds kuglen i en resealable, lufttæt plastikpose. Posen skal være stor nok til at holde en pose i en klud bat taske komfortabelt.</li>
	<li>Efter flere minutter af at lade posen til at ge...

Den protokol, som omtales i dette manuskript, beskriver den bedste prøveudtagnings praksis for forskellige molekylære analyser af flagermus med høj gennemløb. Alle vellykkede omics-undersøgelser kræver væv af høj kvalitet, men prøveudtagning af bat-væv samt andre ikke-modelorganismer forekommer ofte i feltforhold, der ikke kan indstilles til de samme standarder som i kontrollerede laboratorieomgivelser. Stikprøveudtagning sker ofte på fjerntliggende steder med minimale ressourcer, herunder begrænset adgang t...

High-gennemløb sekvensering (HTS) metoder har hurtigt fremskreden i effektivitet og faldt i omkostninger, og det er nu muligt at skalere disse tilgange til hundreder eller tusinder af prøver. Indsigter opnået ved anvendelse af disse teknologier har enorme virkninger på tværs af flere videnskabelige discipliner, fra biomedicin til evolution og økologi1,2,3. Endnu, mange HTS applikationer stole kritisk på høj kvalitet nukleinsyre syrer fra en levende kilde. Denne begrænsning vil sandsynligvis blive stadig mere problematisk med udviklingen af tredje generations sekvensering baseret på lang læste molekyler4. Af disse årsager er der behov for at koncentrere indsatsen om at fastlægge bedste praksis for indsamling af fersk vævsprøver fra vilde organismer uden for laboratoriet, hvilket maksimerer materialets nytteværdi og reducerer antallet af individer, der skal Indsamlet.
Bat1K er et internationalt konsortium af videnskabsfolk med et igangværende initiativ til at sekvens genom af alle arter af bat til kromosom-niveau forsamling5. Flagermus repræsenterer 20% af pattedyrs mangfoldighed og har exceptionelle tilpasninger, der har betydning for forståelsen af aldring, sygdoms økologi, sensorisk biologi og metabolisme5,6. Mange flagermus er også truet eller truet på grund af menneskelig udnyttelse7 eller er hastigt faldende på grund af patogener8,9, og genomniveau sekvensering er af stor betydning for bevarelsen af disse arter. Selv om Bat1K i øjeblikket har til formål at sekvense genomer af alle bat-arter, er standardiseringen af indsamlingen af vævsprøver for genomisk sekvensering af høj kvalitet fortsat en central udfordring i hele Fællesskabet af organismal biologer. Ud over genomdata kræver funktionel forståelse af de forskellige bat-tilpasninger vævsspecifikke transkriptomer og proteinanalyser, der ofte kræver særskilte indsamlings protokoller. Som med alle taksonomiske grupper er optimal vævs indsamling og-bevaring afgørende for opnåelse af data af højeste kvalitet til omics-analyser, men det er ofte vanskeligt at formidle bedste praksis på grund af teknologier, der hurtigt ændrer sig, og flere forskerteams, som arbejder selvstændigt.
Behovet for at indføre bedste praksis for forskning i bat-omic'er er særlig presserende, da mange flagermusarter er sjældne eller truede. I modsætning til andre små pattedyr som gnavere og spidde, er flagermus langtids levede, kan henføres til exceptionelle DNA reparationsmekanismer10 og langsom reproduktion11, med de fleste arter føder kun én eller (i nogle få tilfælde) to unge om året. Af disse grunde kan flagermus populationer være langsomme til at komme sig efter forstyrrelser, og indsamling af mange individer fra naturen er hverken tilrådeligt eller gennemførligt. Med andre ord skal protokollerne optimeres for at opnå den maksimale mængde data for en enkelt prøve, hvilket reducerer behovet for unødigt at replikere prøvetagnings indsatsen.
Her fokuserer denne protokol specifikt på standardiserede metoder til indsamling og prøvetagning af bat-væv for genomisk og transkriptomic sekvensering og proteinanalyser. Dens højeste prioritet er at sikre, at bat-væv indsamles etisk og ansvarligt, lige fra Tilladelsesprocessen for indsamling, eksport af væv til minimering af stress til dyret, og langsigtede opbevaringsforhold. Udførlige dissektioner er blevet udviklet med det formål at fremtidssikret nytten af forskellige materialer indsamlet. Dette manuskript giver en trin-for-trin guide til at indsamle flagermus på en human måde, der er beregnet til at minimere indvirkningen på populationer og maksimere videnskabelig værdi. Mens fokus i denne protokol er specifikt til brug i flagermus, mange af trinene er relevante for andre hvirveldyr taxa, især pattedyr.
Vævs samling, oversigt Proceduren for vævs opsamling, herunder opbevaringstemperatur og valg af konserveringsmiddel, bestemmes af arten af de planlagte downstream-analyser. Men, det anbefales kraftigt, at, når det er muligt, væv er indsamlet under en række metoder til at maksimere sin fremtidige nytte, selv om der ikke er planlagt nogen specifik analyse. Generelt indsamles og bevares vævet for efterfølgende analyser af enten nukleinsyrer (DNA og RNA) eller protein. For hver af disse applikationer, væv kan optimeres optimalt ved direkte flash frysning i flydende nitrogen (LN2). Men, umiddelbar fordybelse i LN2 er ikke altid muligt i marken. Som teknologiske fremskridt, ressourcer såsom specialiserede hætteglas til at opbevare DNA og RNA ved omgivende temperaturer bliver mere let tilgængelige. Selvom vi ikke har valideret alle sådanne materialer i denne protokol, opfordrer vi andre forskere til at analysere ydeevnen af nye materialer relativt i forhold til det, vi præsenterer her. Vi giver metoder til ideelt at bevare væv til forskellige applikationer i situationer, hvor LN2 ikke kan tilgås, f. eks, når LN2 transport er ikke muligt på grund af site adgang via lille fly i Amazonas. Derudover giver vi en metode til opsamling af væv, hvorfra levende celler kan dyrkes og udbredes. Nedenfor skitserer vi vigtige overvejelser ved indsamling af materiale til hvert af disse respektive formål, og der gives en oversigt over indsamlingsmetoderne i tabel 1.
Væv til DNA For alt høstet væv indsamlet, vil lagringsmediet afgøre, om det kan bruges til enten standard eller høj molekylvægt (HMW) DNA-ekstraktion. HMW er påkrævet ved langtids læsning og er i øjeblikket nødvendig for at generere kromosomniveau genom-samlinger eller et "Platinum-standard"-genom. Lavmolekyl vægt (LMW) DNA kan udvindes fra flash frosne, AllProtect (herefter benævnt "vævs stabiliserende opløsning"), eller endda RNAlater (fremover "RNA-stabiliserende opløsning")-konserverede prøver (selvom flash frosne prøver forbliver optimale ). DNA isoleret ved standard laboratoriemetoder (f. eks. silicagel membran spin kolonner, phenol-chloroform), kan stadig give DNA-fragmenter på op til ~ 20 kilobaser (KB). Derfor, forudsat at der er tilstrækkelig udbytte, kan denne form for isoleret DNA anvendes til enkelt Indsæt størrelse bibliotek forberedelse, hvor skærstørrelse er ofte ~ 500 base-par (BP), og korte sekvens læsninger af ~ 100 BP genereres12. Dette DNA er især nyttigt til "gensekvensering" af projekter eller studier, hvor kromosomale data i fuld længde ikke er påkrævet. HMW DNA (10-150 KB) er mere udfordrende og kan kun pålideligt opnås ved hjælp af væv, der er blevet hurtigt flash frosset i LN2 efter høst og vedligeholdes ved et maksimum på-80 °C indtil ekstraktion.
Lav molekylvægt eller fragmenteret DNA er ofte tilstrækkeligt til målrettede tilgange, herunder genforstærkning via PCR og kort læsning af sekventering13. PCR-baserede undersøgelser med LMW-DNA, der kun er rettet mod et eller flere gener, har været meget informative i forståelsen af tilpasning og den molekylære evolution af bat sensorisk biologi6,14, fysiologi15, Phylogenetics 5,16og bevaring17,18. En vellykket målrettet sekvens generobringen af lav molekylvægt og fragmenteret DNA er også blevet påvist for talrige hvirveldyr grupper, herunder flagermus19. Disse metoder er ofte omkostningseffektive og minimalt invasive til flagermus, som fækale prøver og ikke-dødelig vævs prøvetagning via buccale servietter eller Wing biopsi slag er også almindelige måder at opnå DNA for lav molekylvægt analyser20, 21.
Men kvaliteten afhænger i høj grad af den type medier, hvor prøven er lagret22. Efter systematiske og kvantitative sammenligninger af buccale podninger og biopsi slag, fløj biopsi slag har vist sig at give konsekvent højere niveauer af DNA og var mindre stressende for flagermus under samlingen22. Disse sammenligninger viste også, at de bedste resultater blev opnået, når vinge punch blev bevaret i indikator silica (dvs. en type tørremiddel fremstillet af silica gel perler, der skifter farve, når fugt er observeret) snarere end i andre populære lagringsmedier såsom ethanol eller DMSO22; selv om andre lagringsmedier, herunder vævs stabiliserings opløsning, ikke blev undersøgt. Vingeslag kan også bruges til at dyrke fibroblast celler i kultur, såsom i Kacprzyk et al.23 og som beskrevet nedenfor (Se afsnit 6). For disse metoder bør vingen eller uropatagium forlænges forsigtigt, og en ren biopsi punch, typisk 3 mm i diameter, bør anvendes til at opnå prøven. Denne fremgangsmåde synes at forårsage ingen varige skader, med ar healing over inden for uger i de fleste tilfælde24.
HMW DNA (10-150 KB) er mere udfordrende og er i øjeblikket kun pålideligt opnået ved hjælp af væv, der er blevet hurtigt flash frosset i LN2 efter høst og vedligeholdes ved et maksimum på-80 °C indtil ekstraktion. HMW DNA (10-150 KB) er afgørende for lang læsning af DNA-sekvensering og derfor for de Novo genom-samlingen. Mens de fleste kommercielle kits kan bruges til at isolere nogle standard HMW-DNA, opfylder de resulterende molekyle størrelser ofte ikke kravene i tredje generations sekvensering teknologier [f. eks. dem, der lanceres af virksomheder som Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, og 10x Genomics, eller gennem Samlingsmetoder, der tilbydes af Bionano Genomics eller Dovetail Genomics]. Som sådan er der en ny efterspørgsel efter "ultra HMW" DNA (> 150 KB). Når der opnås ultra HMW DNA fra flagermus, friske prøver af leveren, hjernen, eller muskel er alle egnede, men disse skal straks blinke frosset i LN2 uden nogen lager buffer eller cryoprotectant. En fuldstændig beskrivelse af disse trin ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, men findes andre steder25.
Væv til RNA RNA er et enkeltstrenget molekyle, der er mindre stabilt end DNA. Selv om der er mange former for RNA,-omics analyser tendens til at fokusere på mRNA (Messenger RNA) og små RNAs (f. eks, microRNAs). Efter transskription, mRNA er splejret til at danne en moden afskrift, der indeholder ingen introns og repræsenterer kodning del af gener/genomer. Kodning gener tegner sig for en lille brøkdel af genom størrelse (1%-2%), hvilket gør målretning mRNA en omkostningseffektiv middel til at opnå sekvensdata for gener. MicroRNAs er en klasse af RNAs, der regulerer processen med oversættelse af mRNA til proteiner og er derfor vigtige regulerende effektorer. RNA-udskrifter kan sorteres enkeltvis eller mere almindeligt for-omics-analyser26,27,28,29,30, som en del af en transkriptom; Det betyder, at summen af alle RNA-udskrifter er til stede i en given prøve.
Sekvensering kan udføres efter flere metoder (dvs. via kort læsning af RNA-SEQ eller lang læsning af hele isoform SEQ), hvilket muliggør analyse af både RNA-overflod og brug af isoform. Da mængden og mangfoldigheden af mRNA-udskrifter varierer mellem celler og væv, gør RNA-sekvensering det muligt at studere og sammenligne genekspression og regulering på tværs af prøver. Interessen for sekvensering af små RNAs og hele isoform sekvensering er stigende, da disse metoder bliver mere og mere biologisk informative. Forberedelse af vævsprøver til sekvens af forskellige klasser af RNA kan udføres på samme måde som præsenteret i dette manuskript, med kun de efterfølgende ekstraktionsmetoder afviger31,32. Da transkriptomer giver et højt dæknings udsnit af protein kodnings genomet, kan det samlede datasæt være nyttigt i genom-samling og annotation, hvilket gør indsamlingen af RNA-SEQ-data på tværs af en række forskellige væv til en vigtig bestanddel af Bat1K initiativ.
I modsætning til DNA er RNA kemisk ustabil og også målrettet af Rnaseenzymer, som er allestedsnærværende i vævs lysater som en defensiv strategi mod RNA-baserede vira. Af disse grunde begynder RNA-fraktionen i celler og væv at nedbrydes kort efterprøve udtagnings-og/eller eutanasi-punktet. Bevarelse af RNA kræver derfor skridt til at forhindre dets nedbrydning. Dette indebærer typisk at bevare frisk opsamlet væv ved 4 °C i et stabiliserende middel, såsom RNA-stabiliserende opløsning, for at inaktivere de Rnaser, der naturligt findes i vævet, efterfulgt af frysning til langtidsopbevaring. Som et foretrukket alternativ, væv kan blinke frosset i LN2; selv som nævnt ovenfor, transporterer LN2 ind i marken og opretholde niveauer for at forhindre væv optøning kan være logistisk udfordrende.
Væv til protein Protein sammensætning og relativ overflod varierer mellem celler og væv på samme måde som det, der blev drøftet for RNA; Men, proteiner er i gennemsnit mere stabile end RNA. Protein identifikation ved hjælp af proteomics typisk matcher en brøkdel af, og ikke hele, protein sekvens, men det kan give oplysninger om udtryk på tværs af væv og karakterisere patogener til stede. Da mange protein sekvenser bevares på tværs af pattedyr, kan bat-prøver for proteomics let kontamineres med bevaret menneskelige proteiner, der kræver sterile protokoller (f. eks. handsker, pincet) under indsamlingen. Mens flash-frysning i LN2 er den bedste måde at forhindre nedbrydning af proteiner, brug af tøris,-20 °C frysere, og selv is er egnet, hvis der ikke er andre midler. Da temperaturerne stiger, stiger risikoen for differentiel protein opdeling også. Stabiliserende stoffer som vævs stabiliserings løsning er effektive til at bevare proteinfraktionen af væv ved stuetemperatur og er velegnede til kortvarig bevaring (op til en uge), når flash-frysning ikke er rentabelt.
Den enzymatiske profil af et givet væv har direkte indflydelse på bevarelsen af protein deri. Væv med lav enzymatisk aktivitet såsom muskel kan bevare protein profiler selv ved de højere temperaturer i en husholdning fryser. Derimod er levervævet enzymatisk reaktivt, og dets proteiner har højere sandsynligheder for nedværdigende under tilberedningen. Det stigende antal protokoller for opnåelse af humane proteomiske profiler fra formalin-faste paraffin-indlejrede (FFPE) prøver tyder på, at PARAFORMALDEHYD fastgørelse af væv holder løfte om lave omkostninger protein bevarelse, når frysning ved indsamling ikke er muligt33,34. Selv om de er meget afhængige af konserverings tiden og-tilstanden, er proteiner blevet identificeret via Immunhistokemi fra formalin-faste, ethanol-bevarede bat-prøver35. Denne fremgangsmåde er ikke skalerbar til prøvetagning på proteomisk niveau, men fremhæver potentialet for formalin-faste bat-væv til at give protein profiler, når flash-frysning er utilgængelig, og andre stabiliserende stoffer er for dyre.
Væv til cellekultur Prøveudtagning væv og flash-frysning tilbyder en begrænset mængde materiale, der skal anvendes, og når materialet er brugt, er det ikke længere tilgængelig. Alternativt, cellekulturer levere levende celler, der kan straks anvendes eller bevares til fremtidige undersøgelser. Kulturer også lette udvidelse af celler til at øge udbyttet, når vævsprøver er små. Det er særlig nyttigt i tilfælde, hvor vævs indsamlingen er begrænset, såsom eksperimenter med sjældne arter, hvor ikke-dødelig prøvetagning er afgørende og derfor har store konsekvenser for bevarelsen. Beskrevet er en protokol, hvor cellekulturen er mulig via ikke-dødelig prøvetagning af vinge membran væv, men dyrkning er mulig med flere vævstyper36,37. Den protokol, der er angivet her, vælger til vedlige celler. Kombinationen af kilde vævs-og vækstmedier bruges gør denne protokol egnet til at vælge og vokse fibroblaster, men hvis det ønskes, kan alternative protokoller bruges til at vælge for andre celletyper. I forbindelse med Bat1K-projektet forudses det, at for sjældne og truede arter er ikke-dødbringende prøveudtagning af vinge membraner og udvidelse af prøver via dyrkning afgørende for at frembringe den mængde DNA, der er nødvendig for de mange anvendte teknologier5 .
Bat Capture Alle, der håndterer flagermus, bør uddannes af en bat-kompetent forsker og vaccineres mod rabies med en række præ-eksponerings injektioner. Hvis bidt, en yderligere række efter eksponering injektioner er stadig nødvendigt. Standard metoder til opsamling af flagermus omfatter tåge garn (figur 1) og harpe fælder (figur 2). Tåge garn bruges oftest og er ideelt til områder med lav til moderat aktivitet, da de kræver mest pleje for at minimere flagermus lidelse. Små flagermus er særligt sårbare og kan dø af stress, hvis ikke en tendens til hurtigt. Hyppige netto inspektioner minimerer flagermus skade og dødelighed samt beskadigelse af tåge nettet. Denne detalje er vigtig, fordi korrekt vævs indsamling kræver, at vævet skal være frisk, og ukorrekt opmærksomhed på tåge nettene i flagermus kan føre til unødvendig dødelighed eller for tidlig dødelighed, før forskeren kan behandle prøverne korrekt. Fordi flere flagermus kan hvile i en harpe fælde med minimal nød, denne tilgang er ideel til områder med høj flagermus aktivitet, såsom nær en hule eller store Roost. Detaljerede instruktioner til korrekt flagermus opsamling og databehandling til indsamling af morfologiske og demografiske oplysninger er tilgængelige i de supplerende metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

Som high-gennemløb sekvensering teknologier forhånd, standardiserede metoder til høj kvalitet væv erhvervelse og bevaring giver mulighed for udvidelse af disse metoder til ikke-model organismer. En række protokoller til optimering vævs indsamling fra flagermus er blevet udviklet til en række High-gennemløb sekvensering tilgange. Skitseret her er protokoller til opsamling af flagermus, ønskede demografi, der skal indsamles for hver flagermus, og optimerede metoder til at minimere stress på en flagermus under vævs indsamling. Specifikt skitseret er metoder til indsamling og behandling af væv for at opnå (i) DNA for høj molekylvægt genomiske analyser, (II) RNA for vævsspecifikke transkriptomer, og (III) proteiner til proteomisk-niveau analyser. Endelig er også skitseret en metode til at undgå dødbringende prøvetagning ved at skabe levedygtige primære cellekulturer fra vinge klip. En central motivation af disse metoder er at maksimere mængden af potentielle molekylære og morfologiske data for hvert bat og foreslå optimale måder at bevare væv, så de bevarer deres værdi som nye metoder udvikler sig i fremtiden. Denne standardisering er blevet særlig vigtig som initiativer til sekvens kromosom-niveau, fejlfri genomer af arter i hele verden er dukket op, hvor flere videnskabelige partier er i spidsen for sekventering af forskellige taksonomiske Grupper. De protokoller, der er skitseret heri definerer den ideelle vævs indsamling og vævs bevaring metoder til Bat1K, konsortiet, som er sekventering af genomer af alle arter af bat.

Dna For standard analyser med lav molekylvægt (LMW) blev DNA ekstraheret fra tre neotropiske bat-arter. Vævsprøver blev indsamlet i marken fra den Dominikanske Republik og Costa Rica, efter de protokoller, der er beskrevet i dette papir. Efter dissektion blev små stykker (< 0,5 cm i den tyndeste del) af blandet væv (hjerne, lever og tarm) anbragt i RNA-stabiliserende opløsning, flash frosset og derefter opbevaret ved-80 °C. Ekstraktioner blev udført ved hjælp ...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Dette er en protokol for optimal vævs forberedelse til genomisk, transkriptomic og proteomiske analyser af flagermus fanget i naturen. Det omfatter protokoller for flagermus opsamling og dissektion, vævs bevaring, og celledyrkning af bat væv.

Vævs samling af flagermus til omics-analyser og primær cellekultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

I denne video giver vi en trin for trin guide til indsamling af flagermus på en human måde, der har til formål at minimere indvirkningen på populationer og maksimere den videnskabelige værdi. Fordelene ved vores tilgang er, at vi maksimerer mængden af potentielle molekylære og morfologiske data for hver flagermus, bevare væv for at bevare deres fremtidige værdi, og minimere høst vilde individer. Dissektion protokoller er vanskelige at verbalt demonstrere.Mange af de vævspræparatteknikker, vi præsenterer her, kommunikeres bedst ved at visualisere, hvordan forskellige organer identificeres, og derefter korrekt dissekeret og opbevaret. Forbered alle hætteglas, før du starter nogen dissektioner for at undgå forsinkelser. Ved RNA skal der afsættes det antal hætteglas, der er nødvendigt for hver prøve.Mærk hvert rør med den vævstype, der indsamles, samt standard identifikationsoplysninger for prøver. Fyld hætteglassene 50% fuld af RNA stabiliserende opløsning, og chill til fire grader celsius. Pas på ikke at fylde hætteglassene helt med RNA-stabiliserende opløsning, da røret kan eksplodere, når det anbringes i flydende nitrogen.Umiddelbart efter aktiv dødshjælp udføres halshugning af flagermusprøven som beskrevet i tekstprotokollen. Hud kraniet fra hår, fascia, og kraniet muskler, herunder huden på næsen. Pas på ikke at bryde den forreste ende af næsen.Fjern øjnene med scener, ved hjælp af stærk nok kraft til at frigøre synsnerven. Anslaf øjnene i et hætteglas med RNA-stabiliseringsopløsning på to milliliter. Brug saks til at gøre en sagittal snit på dorsale del af kraniet starter ved halsen, passe på ikke at beskadige hjernen.Brug derefter hændekraft til forsigtigt at trække begge sider af kraniet tilbage, indtil det er revnet åben for at eksponere hjernen. Sørg for, at kranieens kranieende er fjernet, så spånskninger nemt kan skrabe hjernen væk. Skrab forsigtigt hjernen med scent.Hjernen vil være meget blød. Den olfaktoriske pære vil blive synlig, sidder på den ventrale del af det indre af kraniet. Prøv at holde olfaktoriske pære vedhæftet.Hvis det er muligt, skal hjerneformen holdes intakt, og den straks på tøris eller i et hætteglas med RNA-stabilisering af 5 milliliter. På den haleende ende af kraniet, bør cochlei nu være sideværts synlige på hver side af hovedet. Brug vicess til forsigtigt at trække i cochlei.Læg dem derefter i et to milliliterglas af RNA-stabiliserende opløsning. Lav to indsnit, hvor den øverste og nederste kæbe slutte sig til, og fjerne underkæben. Den cribriform plade vil blive synlige.Dette er en kritisk knogle for at holde forskeren orienteret. Det kan identificeres som den mest forreste region af kraniet, med flere foramen, og med to riller, hvor olfaktoriske pære hviler. Når underkæben er fjernet, skal du fjerne talerstolen fra den resterende del af kraniet.Sørg for, at kæben indeholder cribriform pladen. Placer næsen i RNA stabiliserende løsning, og opbevares ved fire grader celsius natten over. Fra underkæben skæres tungen med en saks, og placer i et to milliliter hætteglas med RNA stabiliserende opløsning.Ansug næsehætteglasset i flydende nitrogen efter nattens lægges i blød i RNA-stabiliserende opløsning. Efter 24 timers iblødsætning på is eller i køleskabet skal prøverne lægges i flydende nitrogen. Brug en skalpel til at gennembore gennem bughulen, hvilket gør en langsgående snit op til ribbenene.Dette mister skeletrammen. Strip huden til at afsløre brystmusklen, og tage mindst to prøver af muskler. Væv til både RNA og DNA indsamles under disse dissektioner.Placer væv for høj molekylvægt DNA i tørre kryovials, og flash fryse i flydende nitrogen. Placer væv til RNA i RNA stabiliserende opløsning. Skær gennem brystbenet, og træk ribbenene væk.Hent lunge og hjerte. Brug skalpel og scer til at adskille hjertet fra lungerne. Brug en skalpel til at bryde op i lungen, og sted i RNA stabiliserende opløsning.Saml hjertet, som kan tages hele, men bør inddeles i halvdele, således at RNA stabiliserende opløsning opsuger grundigt. Tag prøver fra leveren. Tag mindst to prøver af leveren.Den ene prøve anbringes i et hætteglas for at forblive frosset for dna med høj molekylvægt, og den anden prøve anbringes i RNA-stabiliserende opløsning. Følg den hepatiske kanalen for at finde bugspytkirtlen og galdeblæren. Overfør galdeblæren til et hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.Find maven, og fjer-lignende milt på det base, optræder som en anden nuance af lilla. Bugspytkirtlen bør også være synlig her som en vægtstruktur. Saml maven, milten og bugspytkirtlen i de respektive hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning.Saml små prøver af den lille og tyktarmen. Placer i de respektive hætteglas med RNA-stabiliserende opløsning. Tag en af nyrerne, og følg deres kanaler til blæren, derefter placere i respektive hætteglas af RNA stabiliserende opløsning.Brug den anden nyre som en guide til at finde testiklerne, hvis mandlige, eller livmoder og æggestokke, hvis kvindelige. Saml en eller begge gonader, hvis det er muligt. Også tage prøver af forskellige dele af huden på vingen, og holde i separate hætteglas.Den største fordel ved vores tilgang er, at det giver os mulighed for at prøve dyr på en ikke-dødelig måde, mens der stadig genereres nok materiale til genomiske undersøgelser, samt funktionelle molekylære undersøgelser. Vores protokol tillader fremstilling af primære fibroblaster fra vingevæv. Cellerne repræsenterer en værdifuld vedvarende kilde til genetisk materiale, samt en model for funktionelle og molekylære udforskninger i flagermus.Vingeklip, der er bevaret i vækstmedier i henhold til afsnit seks i den skriftlige protokol, bør overføres til vævskulturfaciliteten. Indholdet af røret overføres til et konisk centrifugerør på 15 milliliter. Vingemembranen biopsi bruges til denne demonstration.Fjern forsigtigt vækstmediet. Vask forsigtigt biopsien to gange med 500 mikroliter steril PBS. Tilsæt 500 mikroliter af en milligram pr. milliliter kollagenase fire til røret.Dette vil forårsage fordøjelse af vævet i de enkelte celler. Inkubere natten over ved 37 grader celsius uden omrøring. På dag to, lave en frisk vækst medium, og prewarm det til 37 grader celsius.Forbered en seks godt væv kultur plade ved at tilføje to milliliter frisk prewarmed vækstmedium i hver brønd af pladen, der skal anvendes. Opbevar denne plade i en 37 grader celsius og 5% kuldioxid inkubator, indtil det er nødvendigt. Fjern det 15 milliliterrør, der indeholder cellerne, fra inkubatoren, og dæmp fordøjelsesreaktionen ved at tilsætte en milliliter frisk vækstmedium.Opspræn dine celler ved omhyggeligt at triturere opløsningen med en P1000 pipettespids for at opnå en enkelt celleaffjedring. Drej forsigtigt cellerne ned i en bordpladecentrifuge i tre minutter ved 300 gange G.Kassér supernatanten ved forsigtigt at fjerne 80 til 90% af væsken med en P1000-pipette. Opsplitet pellet i 500 mikroliter af forvarmet vækstmedium.Triturere forsigtigt suspensionen for at sikre, at pellet ikke længere er synlig, og at cellerne er tilstrækkeligt suspenderet, og sørg for at undgå små stykker væv, som stadig kan være synlige på væggene. Forsigtigt pipette hele mængden af celle suspension i en enkelt brønd af de seks godt plade, der blev udarbejdet tidligere, indeholder prewarm vækstmedier. Ryd forsigtigt pladen fra side til side og foran til ryg to til tre gange for at hjælpe cellerne med at fordele sig over brøndoverfladen i et enkelt lag.Kontroller de belagte celler under et mikroskop. De skal være enkelte celler, der vises balled op og flydende, men meget tæt. Forsigtigt placere pladen i en inkubator preset til 37 grader celsius og 5% kuldioxid.Efter ca. 24 timer observeres cellerne under mikroskopet for at bestemme kulturens sundhed. Celler skal nu fastgøres til pladens overflade og vises fladtrykt. Vedligehold cellerne i en befugtet inkubator forudindstillet til 37 grader celsius og 5% kuldioxid.Celler bør observeres under mikroskopet regelmæssigt for at bestemme behovet for medieforfriskning eller opdeling. Når det er nødvendigt, omhyggeligt aspirere ca 50% af mediet fra brønden, og tilsæt forsigtigt en milliliter af forvarmet vækstmedium til siden af brønden, for ikke at forstyrre cellerne. Når det er nødvendigt at passage cellerne, omhyggeligt aspirere ca 90% af vækstmediet.Vask cellerne meget forsigtigt ved at tilføje en milliliter steril PBS til væggen i brønden, for ikke at forstyrre cellerne. Ryd forsigtigt pladen frem og tilbage og fra side til side to til tre gange. Indsugning forsigtigt hele PBS fra pladen, før cellerne vaskes igen.Tilføj trypsin EDTA til brønden, og forsigtigt rock pladen til at dække hele overfladen af brønden med trypsin EDTA, og inkubere i halvandet minut ved stuetemperatur. Sluk reaktionen ved at tilføje en milliliter frisk prewarmed vækstmedium. Pipette op og ned ca. fem gange for at vaske cellerne fra pladens overflade og sikre, at cellerne er i suspension.Placer celleophænget i et 15 milliliterrør, og drej cellerne ned i en bordpladecentrifuge i tre minutter ved 300 gange G.Kassér supernatanten ved forsigtigt at fjerne 80 til 90 procent af væsken med en P1000-pipette. Opsplit pellet i en milliliter af præwarmed vækstmedium, og forsigtigt triturere suspensionen. Sørg for, at pellet eller store fragmenter af pellet ikke længere er synlige, og celler er i en enkelt celle suspension.Hvis du vil tælle cellen ved hjælp af en automatiseret celletæller, skal du blande en ti mikroliter aliquot af de suspenderede celler en til en med trypan blå for at detektere levedygtige celler. Inkuber i et minut, og pipette 10 mikroliter af opløsningen på tælleslide. Indsæt tælleslide i en automatiseret celletæller for at tælle cellerne ved hjælp af de relevante indstillinger.Forbered frysemedier ved at kombinere vækstmed DMSO for at opnå en endelig koncentration på 10% DMSO. Pellet skal fremstilles fra en 80 til 90% sammenløbsfå godt af en seks brøndplade. Opsplitning af pellet i halvanden milliliter frysende medium.Placer ca. 750 mikroliter celleaffjedring i hver af to separate kryovialer. Placer hætteglassene i en kryogen frysning beholder, således at cellerne fryser langsomt for at opretholde celle vitalitet. Straks placere dem på minus 80 grader celsius.At tø de frosne celler, forberede en seks godt plade, der indeholder to milliliter forvarmet vækstmedium i hver brønd, der vil blive brugt. Vedligehold pladen i 37 grader celsius og 5% kuldioxid inkubator, indtil det er nødvendigt. Tag et hætteglas af celler fra flydende nitrogen, og læg det i et varmt vandbad for hurtigt at tø cellerne op.Det burde tage to til tre minutter. Så snart opløsningen i hætteglasset er optøet, pipetteres forsigtigt op og ned for at homogenisere opløsningen og straks placere hele opløsningen i en brønd af de seks brøndplade. Ryd forsigtigt pladen fra side til side og foran til ryg to til tre gange for at hjælpe cellerne med at fordele sig over brøndoverfladen i et enkelt lag.Placer cellerne i inkubatoren ved 37 grader celsius og fem procent kuldioxid i 24 til 48 timer. Overvåge og passage cellerne som påvist. Repræsentative resultater af DNA-ekstraktioner er vist for standard DNA-analyser fra tre flagermusarter.Et enkelt stort bånd angiver minimal fragmentering og lignende fragmenter af DNA fra hver af de respektive ekstraktion. En almindelig indikator for succes for RNA-ekstraktioner er RNA-integritetsnummeret, eller RIN, hvor værdier over otte repræsenterer høj kvalitet i takt RNA. Vist her er RIN værdier af RNA ekstraktioner fra 13 forskellige vævstyper af neotropiske flagermus arter, udtaget til fire forskellige lokaliteter.Væv udtaget fra arter i Andeserne, Costa Rica, og Den Dominikanske Republik blev placeret direkte i flydende kvælstof efter iblødsætning i RNA stabiliserende opløsning ved fire grader celsius natten over. Væv udtaget fra arter i Amazonas blev placeret i flydende nitrogen cirka en uge efter at placere en RNA stabiliserende opløsning, og holdes på fire grader celsius kontinuerligt. Selv i sådanne tilfælde var RIN-værdierne sammenlignelige med dem, der straks blev placeret i RNA-stabiliserende opløsning og direkte i flydende nitrogen.Efter vævskulturen bør batcellekulturer dække 80 til 90 % af pladeoverfladen og bevare deres oprindelige morfologi. Dette repræsenterer den optimale fase for opdeling. Efter mere end seks passager, vil cellerne ændre deres morfologi til at blive større og længere, og cellerne vil komme ind senescens.Lyse balled op celler repræsenterer døde celler. Celler i kultur repræsenterer en vedvarende kilde til materiale, som DNA, RNA og protein. Disse cellelinjer kan fryses, hvilket giver en ressource, der kan bruges over mange års forskning.Dette giver mulighed for genomiske, transskriptioniske, og funktionelle undersøgelser, der vil være udfordrende ved hjælp af primære væv. For eksempel kan celler modificeres genetisk eller kemisk for at observere virkninger på cellulære fænotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Mærkning af Gær endosomale System for Ultrastrukturelle Analyser

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen af ​​retroviral infektion i Primary Intestinal organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Forbedret Swiss-rullende Teknik for tarmvæv Forberedelse til immunhistokemisk og Immunofluorescerende Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...