Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Wij danken Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo en Fanny Fernández Melo voor het maken van weefsel collectie in Peru mogelijk. We danken ook alle leden van Grupo Jaragua en Yolanda León voor het maken van weefsel inzameling in de Dominicaanse Republiek mogelijk, evenals aan Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, en iedereen bij La Selva Biological Research Station in Costa Rica, voor het maken bemonstering mogelijk. We bedanken Ella latten kamp & Lutz Wiegrebe voor toegang en monster collectie van vleugel stoten van Phyllostomus verkleuren vleermuizen voor celkweek generatie. Phyllostomus verkleurde vleermuizen zijn ontstaan uit een broed kolonie in het departement biologie II van de Ludwig-Maximilians-Universiteit in München. Goedkeuring voor het houden en fokken van de vleermuizen werd afgegeven door het district Veterinair Bureau van München. LMD, SJR, KTJD en LRY werden gefinancierd door NSF-DEB 1442142. LMD werd gefinancierd door NSF-DEB 1838273. LRY werd gefinancierd door de NSF-PRFB 1812035. SCV en PD werden gefinancierd door een Max Planck Research Group Award, en een Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP, en KTJD werden gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) toegekend aan SJR, ECT werd gefinancierd door de Europese Onderzoeksraad Grant (ERC-2012-StG311000).

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Stony Brook University (protocol #2013-2034).
1. euthanasie
<ol><li>Bevochtig een wattenbolletje met een Isofluraan verdoving of een ander beschikbaar anestheticum.</li>
	<li>Plaats de katoenen bal in een hersluitbare, luchtdichte plastic zak. De zak moet groot genoeg zijn om een zak in een doek bat zak comfortabel te houden.</li>
	<li>Na enkele minuten van het toestaan van de za...

Het protocol dat in dit manuscript wordt besproken, beschrijft de beste bemonsterings praktijken voor verschillende moleculaire analyses van vleermuizen met hoge doorvoer. Alle succesvol-omics studies vereisen weefsel van hoge kwaliteit, maar het bemonsteren van vleermuis weefsel, evenals andere niet-model organismen, komt vaak voor in veldomstandigheden die niet kunnen worden ingesteld op dezelfde normen als die van een gecontroleerde laboratorium instelling. Sampling vindt vaak plaats op afgelegen locaties, met minimal...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

Als high-throughput sequencing technologieën Advance, gestandaardiseerde methoden voor het verwerven en conserveren van weefsel van hoge kwaliteit zorgen voor de uitbreiding van deze methoden naar niet-model organismen. Een reeks protocollen om de weefsel verzameling van vleermuizen te optimaliseren is ontwikkeld voor een reeks benaderingen met hoge doorvoer sequentiëren. Hier geschetst zijn protocollen voor de inname van vleermuizen, gewenste demografische gegevens worden verzameld voor elke vleermuis, en geoptimaliseerde methoden om te minimaliseren van stress op een vleermuis tijdens weefsel verzameling. Specifiek beschreven zijn methoden voor het verzamelen en behandelen van weefsel om (i) DNA te verkrijgen voor genomische analysen met een hoog moleculair gewicht, (II) RNA voor Weefselspecifieke transcriptomen (III) eiwitten voor analyses op Proteomic-niveau. Tot slot, ook geschetst is een methode om dodelijke bemonstering te voorkomen door het creëren van levensvatbare primaire celculturen uit vleugel clips. Een centrale motivatie van deze methoden is om de hoeveelheid potentiële moleculaire en morfologische gegevens voor elke vleermuis te maximaliseren en optimale manieren te suggereren om weefsels te behouden, zodat ze hun waarde behouden als nieuwe methoden in de toekomst ontwikkelen. Deze standaardisatie is bijzonder belangrijk geworden als initiatieven voor het sequentiëren van chromosoom-niveau-en foutvrije genomen van soorten over de hele wereld zijn ontstaan, waarbij meerdere wetenschappelijke partijen de sequenties van verschillende taxonomische Groepen. De protocollen die hierin worden beschreven, definiëren de ideale methoden voor weefsel verzameling en weefsel conservering voor Bat1K, het consortium dat de genomen van elke soort vleermuis sequentieert.

Dna Voor standaard laag moleculair gewicht (LMW)-analyses werd DNA geëxtraheerd uit drie neotropische vleermuissoorten. Weefselmonsters werden verzameld op het gebied van de Dominicaanse Republiek en Costa Rica, volgens de in dit document beschreven protocollen. Na dissectie werden kleine stukjes (< 0,5 cm bij het dunste gedeelte) van gemengde weefsels (hersenen, lever en darmen) in RNA-stabiliserende oplossing geplaatst, Flash bevroren, en vervolgens opgeslagen bij-8...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Dit is een protocol voor de optimale weefsel voorbereiding voor genomische, transcriptomische en proteomische analyses van vleermuizen die in het wild zijn gevangen. Het omvat de protocollen voor de inname van vleermuis en dissectie, weefsel conservering, en celculturing van vleermuis weefsel.

Weefsel collectie van vleermuizen voor-omics analyses en primaire celcultuur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

In deze video bieden we een stap voor stap gids voor het verzamelen van vleermuizen op een humane manier, bedoeld om de impact op de bevolking te minimaliseren en de wetenschappelijke waarde te maximaliseren. De voordelen van onze aanpak zijn dat we de hoeveelheid potentiële moleculaire en morfologische gegevens voor elke vleermuis maximaliseren, weefsels behouden om hun toekomstige waarde te behouden en het oogsten van wilde individuen te minimaliseren. Ontledingsprotocollen zijn moeilijk verbaal aan te tonen.Veel van de weefselbereidingstechnieken die we hier presenteren, kunnen het best worden gecommuniceerd door te visualiseren hoe verschillende organen worden geïdentificeerd en vervolgens goed worden ontleed en opgeslagen. Bereid alle flesjes voor voordat u dissecties start om vertragingen te voorkomen. Voor RNA, zet het aantal flesjes die nodig zijn voor elk exemplaar.Label elke buis met het weefseltype dat zal worden verzameld, evenals standaard monster identificatie-informatie. Vul de flacons 50% vol met RNA stabiliserende oplossing, en chill tot vier graden celsius. Zorg ervoor dat u de flacons niet volledig vult met RNA-stabilisatieoplossing, omdat de buis kan exploderen bij het plaatsen van vloeibare stikstof.Onmiddellijk na euthanasie, uitvoeren onthoofding van de vleermuis specimen zoals beschreven in het tekstprotocol. Huid van de schedel van het haar, fascia, en schedelspieren, met inbegrip van de huid op de neus. Zorg ervoor dat je de voorkant van de neus niet breekt.Verwijder de ogen met tangen, met behulp van sterk genoeg kracht om de oogzenuw los te maken. Plaats de ogen in een twee milliliter flacon van RNA stabiliserende oplossing. Gebruik een schaar om een sagittale snee te maken op het dorsale gedeelte van de schedel vanaf de nek, waarbij u ervoor zorgt dat de hersenen niet worden beschadigd.Gebruik vervolgens tangen om beide zijden van de schedel voorzichtig terug te trekken, totdat het wordt opengebroken om de hersenen bloot te leggen. Zorg ervoor dat de schedel van het schedeleinde is verwijderd, zodat tangen gemakkelijk de hersenen kunnen wegschrapen. Schraap de hersenen voorzichtig met tangen.De hersenen zullen erg zacht zijn. De reukbol zal zichtbaar worden, zittend aan het ventrale gedeelte van het interieur van de schedel. Probeer de reuklamp bevestigd te houden.Indien mogelijk, houd de hersenen vorm intact, en onmiddellijk plaats het op droog ijs, of in een vijf milliliter flacon van RNA stabiliserende oplossing. Aan het staartzijde van de schedel moet de cochlei nu zijdelings zichtbaar zijn aan elke kant van het hoofd. Gebruik tangen om de cochlei voorzichtig te trekken.Zet ze vervolgens in een twee milliliter flacon van RNA stabiliserende oplossing. Maak twee incisies waar de boven- en onderkant kaak aansluiten, en verwijder de onderkaak. De cribriform plaat zal duidelijk worden.Dit is een kritiek bot om de onderzoeker georiënteerd te houden. Het kan worden geïdentificeerd als de meest voorste regio van de schedel, met meerdere foramen, en met twee groeven waar de reukbol rust. Zodra de onderkaak is verwijderd, verwijder het rostrum uit het resterende deel van de schedel.Zorg ervoor dat de kaak de cribriform plaat bevat. Plaats de neus in RNA stabiliserende oplossing, en op te slaan op vier graden Celsius 's nachts. Snijd de tong uit de onderkaak met een schaar en plaats in een twee milliliter flacon van RNA-stabilisatieoplossing.Plaats de neus flacon in vloeibare stikstof na de 's nachts weken in RNA stabiliserende oplossing. Na 24 uur weken op ijs, of in de koelkast, plaats de monsters in vloeibare stikstof. Gebruik een scalpel te doorboren door de buikholte, het maken van een longitudinale incisie tot aan de ribben.Dit verliest het skelet frame. Strip de huid om de borstspier te onthullen en neem ten minste twee monsters van de spier. Weefsels voor zowel RNA als DNA worden verzameld tijdens deze dissecties.Plaats weefsels voor een hoog moleculair gewicht DNA in droge cryovials, en flash bevriezen in vloeibare stikstof. Plaats weefsels voor RNA in RNA stabiliserende oplossing. Snijd door het borstbeen en trek de ribben weg.Haal de long en het hart op. Gebruik de scalpel en tangen om het hart te scheiden van de long. Gebruik een scalpel om de long te breken, en plaats in RNA stabiliserende oplossing.Verzamel het hart, dat geheel kan worden genomen, maar moet worden doorsneden in helften, zodat de RNA stabiliserende oplossing grondig doorweekt. Neem monsters van de lever. Neem minstens twee levermonsters.Plaats een monster in een flacon te blijven bevroren voor een hoog moleculair gewicht DNA, en plaats het andere monster in RNA stabiliserende oplossing. Volg de leverbuik om de alvleesklier en galblaas te vinden. Breng de galblaas over naar een flacon van RNA-stabilisatieoplossing.Vind de maag, en de veer-achtige milt aan de basis, verschijnen als een andere schaduw van paars. De alvleesklier moet hier ook zichtbaar zijn als een gewichtsstructuur. Verzamel de maag, de milt, en de alvleesklier, in de respectieve flacons van RNA stabiliserende oplossing.Verzamel kleine monsters van de dunne en dikke darm. Plaats in de respectievelijke flacons van RNA stabiliserende oplossing. Neem een van de nieren, en volg hun kanalen naar de blaas, plaats dan in de respectieve flesjes van RNA stabiliserende oplossing.Gebruik de andere nier als een gids om de teelballen te vinden als mannelijke, of baarmoeder en eierstokken als vrouwelijke. Verzamel een of beide geslachtsklieren indien mogelijk. Neem ook monsters van verschillende delen van de huid van de vleugel, en bewaar in aparte flesjes.Het belangrijkste voordeel van onze aanpak is dat het ons in staat stelt om dieren te proeven op een niet-dodelijke manier, terwijl nog steeds het genereren van genoeg materiaal voor genomische studies, evenals functionele moleculaire studies. Ons protocol maakt het mogelijk om primaire fibroblasten uit vleugelweefsel te bereiden. De cellen vertegenwoordigen een kostbare hernieuwbare bron van genetisch materiaal, evenals een model voor functionele en moleculaire verkenningen bij vleermuizen.Vleugel clips die zijn bewaard in groeimedia volgens sectie zes van het geschreven protocol moeten worden overgebracht naar de weefselkweek faciliteit. Breng de inhoud van de buis in een 15 milliliter conische centrifuge buis. De vleugelmembraanbiopsie wordt gebruikt voor deze demonstratie.Verwijder voorzichtig het groeimedium. Was de biopsie twee keer voorzichtig met 500 microliters steriele PBS. Voeg 500 microliter van een milligram per milliliter collagenase vier aan de buis.Dit zal leiden tot de spijsvertering van het weefsel in individuele cellen. Incubeer 's nachts bij 37 graden celsius zonder agitatie. Maak op dag twee een fris groeimedium en verwarm het tot 37 graden.Bereid een zes goed weefsel cultuur plaat door het toevoegen van twee milliliter van verse voorverwarmde groeimedium in elke put van de plaat te gebruiken. Bewaar deze plaat in een 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator tot het nodig is. Verwijder de 15 milliliter buis met de cellen uit de couveuse, en blus de spijsvertering reactie door het toevoegen van een milliliter vers groeimedium.Resuspend de cellen door zorgvuldig triturating de oplossing met een P1000 pipet tip om een enkele cel suspensie te bereiken. Draai voorzichtig de cellen in een tafelblad centrifuge gedurende drie minuten op 300 keer G.Gooi de supernatant door voorzichtig verwijderen van 80 tot 90% van de vloeistof met een P1000 pipet. Resuspend de pellet in 500 microliters van voorverwarmd groeimedium.Triturate voorzichtig de suspensie om ervoor te zorgen dat de pellet niet meer zichtbaar is, en dat de cellen voldoende zijn opgehangen, om ervoor te zorgen dat kleine stukjes weefsel die nog zichtbaar kunnen zijn op de muren te voorkomen. Voorzichtig pipette het gehele volume van de cel suspensie in een enkele put van de zes put plaat die eerder werd voorbereid, met de prewarme groeimedia. Wieg de plaat voorzichtig van links naar rechts en van voor naar achter twee tot drie keer om cellen te helpen verdelen over het putoppervlak in een enkele laag.Controleer de vergulde cellen onder een microscoop. Het moeten enkele cellen zijn die verbollen en zwevend lijken, maar zeer dicht. Plaats de plaat voorzichtig in een incubator preset tot 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.Observeer na ongeveer 24 uur de cellen onder de microscoop om de gezondheid van de cultuur te bepalen. Cellen moeten nu worden bevestigd aan het plaatoppervlak, en lijken afgevlakt. Houd de cellen in een bevochtigde incubator preset tot 37 graden Celsius en 5%kooldioxide.Cellen moeten regelmatig onder de microscoop worden geobserveerd om de noodzaak van mediaverfrissing of splitsing te bepalen. Indien nodig, voorzichtig aanzuigen ongeveer 50% van het medium uit de put, en voorzichtig voeg een milliliter van voorverwarmde groeimedium aan de zijkant van de put, om niet te verstoren de cellen. Wanneer het nodig is om de cellen door te geven, voorzichtig aanzuigen ongeveer 90% van het groeimedium.Was de cellen heel voorzichtig door een milliliter steriele PBS toe te voegen aan de wand van de put, om de cellen niet te verstoren. Wieg de plaat zachtjes heen en weer en van links naar rechts twee tot drie keer. Spoel voorzichtig alle PBS van de plaat voordat u de cellen weer wast.Voeg trypsine EDTA toe aan de put en wieg de plaat voorzichtig om het hele oppervlak van de put te bedekken met trypsine EDTA en incubeer anderhalve minuut bij kamertemperatuur. Blus de reactie door een milliliter vers voorverwarmd groeimedium toe te voegen. Pipet op en neer ongeveer vijf keer om de cellen te wassen van het oppervlak van de plaat, en ervoor te zorgen dat de cellen in suspensie.Plaats de cel suspensie in een 15 milliliter buis, en spin de cellen in een tafelblad centrifuge gedurende drie minuten op 300 keer G.Discard de supernatant door voorzichtig verwijderen van 80 tot 90 procent van de vloeistof met een P1000 pipet. Resuspend de pellet in een milliliter van voorverwarmd groeimedium, en voorzichtig triturate de suspensie. Zorg ervoor dat de pellet of grote fragmenten van de pellet niet meer zichtbaar zijn en dat de cellen in een enkele celsuspensie zitten.Om de cel te tellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller, meng een tien microliter aliquot van de zwevende cellen een op een met trypan blauw om levensvatbare cellen te detecteren. Een minuut incubeer maken en 10 microliter van de oplossing op de telplaat. Plaats de teldia in een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen met behulp van de juiste instellingen.Bereid bevriezingsmedia voor door groeimedium te combineren met DMSO om een uiteindelijke concentratie van 10% DMSO te verkrijgen. De pellet moet worden bereid van een 80 tot 90% confluent goed van een zes put plaat. Resuspend de pellet in anderhalve milliliter vriesmedium.Plaats ongeveer 750 microliter celsuspensie in elk van de twee afzonderlijke cryovials. Plaats de flesjes in een cryogene vriescontainer, zodat de cellen langzaam bevriezen om de celvitaliteit te behouden. Plaats ze onmiddellijk op min 80 graden Celsius.Om de bevroren cellen te ontdooien, bereid een zes put plaat met twee milliliter van voorverwarmd groeimedium in elke put die zal worden gebruikt. Houd de plaat in de 37 graden Celsius en 5% kooldioxide incubator tot het nodig is. Neem een flesje cellen uit vloeibare stikstof, en plaats het in een warm waterbad om de cellen snel te ontdooien.Dit duurt twee tot drie minuten. Zodra de oplossing in de flacon ontdooid is, u de oplossing voorzichtig op en neer zetten om de oplossing te homogeniseren en onmiddellijk de hele oplossing in één put van de zes putplaat plaatsen. Wieg de plaat voorzichtig van links naar rechts en van voor naar achter twee tot drie keer om cellen te helpen verdelen over het putoppervlak in een enkele laag.Plaats de cellen in de couveuse op 37 graden Celsius en vijf procent kooldioxide gedurende 24 tot 48 uur. Monitor en passage van de cellen zoals aangetoond. Representatieve resultaten van DNA-extracties worden getoond voor standaard DNA-analyses van drie vleermuissoorten.Een enkele grote band geeft minimale fragmentatie, en vergelijkbare grootte fragmenten van DNA van elke respectieve extractie. Een gemeenschappelijke indicator van succes voor RNA extracties is het RNA integriteitsnummer, of RIN, met waarden boven acht die hoge kwaliteit in tactRNA vertegenwoordigen. Hier worden RIN-waarden van RNA-extracties van 13 verschillende weefselsoorten van neotropische vleermuissoorten weergegeven, bemonsterd op vier verschillende plaatsen.Weefsels bemonsterd van soorten in de Andes, Costa Rica, en de Dominicaanse Republiek werden direct in vloeibare stikstof geplaatst na het weken in RNA stabiliserende oplossing op vier graden Celsius 's nachts. Weefsels van soorten in het Amazonegebied werden ongeveer een week na het plaatsen van een RNA-stabilisatieoplossing in vloeibare stikstof geplaatst en continu op vier graden celsius bewaard. Zelfs in dergelijke gevallen waren de RIN-waarden vergelijkbaar met die welke onmiddellijk in RNA-stabilisatieoplossing werden geplaatst en rechtstreeks in vloeibare stikstof.Na weefselkweek moeten vleermuiscelculturen 80 tot 90% van het plaatoppervlak bedekken en hun oorspronkelijke morfologie behouden. Dit vertegenwoordigt het optimale stadium voor het verdelen. Na meer dan zes passages zullen cellen hun morfologie veranderen om groter en langer te worden, en de cellen zullen senescentie ingaan.Heldere balled up cellen vertegenwoordigen dode cellen. Cellen in de cultuur vertegenwoordigen een hernieuwbare bron van materiaal, zoals DNA, RNA en eiwit. Deze cellijnen kunnen worden bevroren, waardoor een bron die kan worden gebruikt gedurende vele jaren van onderzoek.Dit maakt genomische, transcriptomische, en functionele studies die uitdagend zal zijn met behulp van primaire weefsels. Cellen kunnen bijvoorbeeld genetisch of chemisch worden gewijzigd om effecten op cellulaire fenotypes waar te nemen.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning Stapel-Polymer Stellingen voor Tissue Engineering en Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolatie en Cultuur van de Muis Primaire Pancreatic Acinaire Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van de muis endotheelcellen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Verbeterde Swiss-rolling Techniek voor darmweefsel Voorbereiding voor Immunohistochemische en Immunofluorescentie Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...