Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
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Wir danken Centro de Ecologa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sénchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vésquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo und Fanny Fernandez Melo für die Herstellung von Gewebe Sammlung in Peru möglich. Wir danken auch allen Mitgliedern der Grupo Jaragua und Yolanda Leon für die Möglichkeit der Gewebesammlung in der Dominikanischen Republik, sowie Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita und allen in der Biologischen Forschungsstation La Selva in Costa Rica für die Herstellung von Probenahme möglich. Wir danken Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe für den Zugang und die Mustersammlung von Flügelschlägen von Phyllostomus Verfärbung Fledermäuse für die Zellkultur-Generation. Phyllostomus Verfärbungfledermäuse stammen aus einer Zuchtkolonie im Fachbereich Biologie II der Ludwig-Maximilians-Universität München. Die Genehmigung zum Halten und Züchten der Fledermäuse wurde vom Landesveterinäramt München erteilt. LMD, SJR, KTJD und LRY wurden von NSF-DEB 1442142 finanziert. LMD wurde von NSF-DEB 1838273 finanziert. LRY wurde vom NSF-PRFB 1812035 finanziert. SCV und PD wurden durch einen Max-Planck-Forschungsgruppenpreis und ein Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016) gefördert. SJR, JHTP und KTJD wurden vom Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) an SJR, ECT wurde durch stipendium des Europäischen Forschungsrats (ERC-2012-StG311000) finanziert.

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Stony Brook University (Protokoll #2013-2034) genehmigt.
1. Euthanasie
<ol><li>Befeuchten Sie eine Baumwollkugel mit einem Isofluran-Anästhetikum oder einem anderen verfügbaren Anästhetikum.</li>
	<li>Legen Sie die Baumwollkugel in eine wiederverschließbare, luftdichte Plastiktüte. Die Tasche sollte groß genug sein, um eine Tasche in einer Stofffledermaustasche bequem zu halten.</li>
	<l...

Das in diesem Manuskript diskutierte Protokoll beschreibt die besten Probenahmeverfahren für verschiedene molekulare Analysen von Fledermäusen mit hohem Durchsatz. Alle erfolgreichen -omics-Studien erfordern qualitativ hochwertiges Gewebe, aber die Probenahme von Fledermausgewebe, sowie andere Nicht-Modellorganismen, tritt oft unter Feldbedingungen auf, die nicht auf die gleichen Standards wie die einer kontrollierten Laborumgebung eingestellt werden können. Probenahme findet häufig an abgelegenen Orten mit minimalen...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

Mit dem Fortschritt der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ermöglichen standardisierte Methoden zur qualitativ hochwertigen Gewebeerfassung und -konservierung die Ausweitung dieser Methoden auf Nichtmodellorganismen. Eine Reihe von Protokollen zur Optimierung der Gewebesammlung von Fledermäusen wurde für eine Reihe von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze entwickelt. Hier sind Protokolle für die Erfassung von Fledermäusen, gewünschte Demografie für jede Fledermaus gesammelt werden, und optimierte Methoden, um Stress auf eine Fledermaus während der Gewebesammlung zu minimieren. Konkret beschrieben werden Methoden zur Sammlung und Behandlung von Gewebe, um (i) DNA für genomische Analysen mit hohem Molekulargewicht zu erhalten, (ii) RNA für gewebespezifische Transkriptome und (iii) Proteine für proteomische Analysen. Schließlich wird auch eine Methode beschrieben, um tödliche Probenahmen zu vermeiden, indem aus Flügelclips lebensfähige primäre Zellkulturen erstellt werden. Eine zentrale Motivation dieser Methoden ist es, die Menge der potenziellen molekularen und morphologischen Daten für jede Fledermaus zu maximieren und schlagen optimale Möglichkeiten, um Gewebe zu erhalten, so dass sie ihren Wert behalten, wie neue Methoden in der Zukunft entwickeln. Diese Standardisierung ist besonders wichtig geworden, da Initiativen zur Sequenzierung von chromosomenfreien Genomen von Arten auf der ganzen Welt entstanden sind, in denen mehrere wissenschaftliche Parteien die Sequenzierung verschiedener taxonomischer Gruppen. Die hier beschriebenen Protokolle definieren die idealen Methoden zur Gewebesammlung und Gewebeerhaltung für Bat1K, das Konsortium, das die Genome jeder Fledermausart sequenziert.

Dna Für Standardanalysen mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) wurde DNA aus drei neotropischen Fledermausarten extrahiert. Gewebeproben wurden vor Ort aus der Dominikanischen Republik und Costa Rica nach den in diesem Papier beschriebenen Protokollen entnommen. Nach der Zerlegung wurden kleine Stücke (<0,5 cm im dünnsten Abschnitt) von Mischgeweben (Gehirn, Leber und Darm) in rnastabilisierende Lösung, blitzgefroren, dann bei -80 °C gelagert. Extraktionen wurden m...

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Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Dies ist ein Protokoll für die optimale Gewebevorbereitung für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen von Fledermäusen, die in freier Wildbahn gefangen sind. Es enthält Protokolle für Fledermaus-Capture und -Sektion, Gewebekonservierung, und Zellkultivierung von Fledermausgewebe.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

In diesem Video bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Sammeln von Fledermäusen in einer humanen Weise, um die Auswirkungen auf die Populationen zu minimieren und den wissenschaftlichen Wert zu maximieren. Die Vorteile unseres Ansatzes sind, dass wir die Menge potenzieller molekularer und morphologischer Daten für jede Fledermaus maximieren, Gewebe erhalten, um ihren zukünftigen Wert zu behalten, und die Ernte wildlebender Individuen minimieren. Sezierprotokolle sind schwer verbal zu demonstrieren.Viele der Gewebevorbereitungstechniken, die wir hier präsentieren, werden am besten durch die Visualisierung vermittelt, wie verschiedene Organe identifiziert und dann richtig seziert und gespeichert werden. Bereiten Sie alle Durchstechflaschen vor, bevor Sie mit den Sezierungen beginnen, um Verzögerungen zu vermeiden. Legen Sie für RNA die Anzahl der Fläschchen beiseite, die für jede Probe benötigt werden.Beschriften Sie jedes Rohr mit dem gesammelten Gewebetyp sowie Standard-Probenidentifikationsinformationen. Füllen Sie die Fläschchen 50% voll von RNA-Stabilisierungslösung, und kühlen Sie auf vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, die Durchstechflaschen nicht vollständig mit RNA-stabilisierungslösung zu füllen, da die Röhre explodieren kann, wenn sie in flüssigen Stickstoff platziert wird.Unmittelbar nach der Euthanasie, führen Sie die Enthauptung der Fledermaus Probe, wie im Textprotokoll beschrieben. Haut den Schädel aus den Haaren, Faszien und Schädelmuskeln, einschließlich der Haut auf der Nase. Achten Sie darauf, das vordere Ende der Nase nicht zu brechen.Entfernen Sie die Augen mit Zange, mit starker genug Kraft, um den Sehnerv zu lösen. Legen Sie die Augen in eine zwei Milliliter Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung. Verwenden Sie eine Schere, um einen sagittalen Schnitt auf dem dorsalen Teil des Schädels beginnend am Hals zu machen, wobei darauf geachtet wird, das Gehirn nicht zu beschädigen.Dann verwenden Sie Zangen, um sanft beide Seiten des Schädels zurückzuziehen, bis es aufgerissen wird, um das Gehirn freizulegen. Stellen Sie sicher, dass der Schädel des Schädelendes entfernt wurde, so dass Zangen das Gehirn leicht wegkratzen können. Kratzen Sie das Gehirn vorsichtig mit Zangen.Das Gehirn wird sehr weich sein. Die olfaktorische Glühbirne wird sichtbar, sitzend am ventralen Teil des Inneren des Schädels. Versuchen Sie, die Olfaktor-Lampe anhängen zu halten.Halten Sie die Gehirnform nach Möglichkeit intakt und legen Sie sie sofort auf Trockeneis oder in eine fünf Milliliter-Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung. Am kaudalen Ende des Schädels sollte die Cochlei nun seitlich auf jeder Seite des Kopfes sichtbar sein. Verwenden Sie Zangen, um die Cochlei sanft zu ziehen.Dann legen Sie sie in eine Zwei-Milliliter-Durchstechflasche mit RNA-stabilisierungslösung. Machen Sie zwei Einschnitte, wo der obere und untere Kiefer verbinden, und entfernen Sie den Unterkiefer. Die Krippenplatte wird sichtbar.Dies ist ein kritischer Knochen, um den Forscher orientiert zu halten. Es kann als die vordere Region des Schädels identifiziert werden, mit mehreren Foramen und mit zwei Rillen, wo die Riechbirne ruht. Sobald der Unterkiefer entfernt wurde, entfernen Sie die Tribüne aus dem verbleibenden Teil des Schädels.Stellen Sie sicher, dass der Kiefer die Cribriform-Platte enthält. Legen Sie die Nase in RNA-Stabilisierungslösung, und lagern Sie bei vier Grad Celsius über Nacht. Aus dem unteren Unterkiefer die Zunge mit der Schere schneiden und in eine zwei Milliliter-Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung legen.Legen Sie die Nasendurchstechflasche in flüssigen Stickstoff nach dem über Nacht einweichenden in RNA-Stabilisierungslösung. Nach 24 Stunden Einweichen auf Eis oder im Kühlschrank die Proben in flüssigen Stickstoff geben. Verwenden Sie ein Skalpell, um durch die Bauchhöhle zu durchbohren, so dass ein Längsschnitt bis zu den Rippen.Dadurch verfällt der Skelettrahmen. Entfernen Sie die Haut, um den Brustmuskel zu offenbaren, und nehmen Sie mindestens zwei Proben von Muskel. Gewebe für RNA und DNA werden während dieser Abschnitte gesammelt.Legen Sie Gewebe für hochmolekulare DNA in trockene Kryovials und blitzen Sie in flüssigem Stickstoff ein. Legen Sie Gewebe für RNA in rnastabilisierende Lösung. Schneiden Sie durch das Brustbein, und ziehen Sie die Rippen weg.Holen Sie sich nun die Lunge und das Herz. Verwenden Sie das Skalpell und Zange, um das Herz von der Lunge zu trennen. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Lunge aufzubrechen, und legen Sie in RNA-Stabilisierungslösung.Sammeln Sie das Herz, das ganz eingenommen werden kann, sollte aber in Hälften geschnitten werden, so dass die RNA-Stabilisierungslösung gründlich einweicht. Nehmen Sie nun Proben aus der Leber. Nehmen Sie mindestens zwei Proben von Leber.Legen Sie eine Probe in eine Durchstechflasche, um für DNA mit hohem Molekulargewicht eingefroren zu bleiben, und legen Sie die andere Probe in eine RNA-stabilisierungslösung. Folgen Sie dem Leberkanal, um die Bauchspeicheldrüse und Gallenblase zu finden. Übertragen Sie die Gallenblase in eine Durchstechflasche mit RNA-stabilisierungslösung.Finden Sie den Magen, und die federartige Milz an ihrer Basis, erscheint als ein anderer Farbton von lila. Die Bauchspeicheldrüse sollte hier auch als Gewichtsstruktur sichtbar sein. Sammeln Sie den Magen, die Milz und die Bauchspeicheldrüse, in den entsprechenden Fläschchen der RNA-Stabilisierungslösung.Sammeln Sie kleine Proben des Kleinen und Dickdarms. In die jeweiligen Durchstechflaschen der RNA-stabilisierungslösung geben. Nehmen Sie eine der Nieren, und folgen Sie ihren Kanälen zur Blase, dann in den jeweiligen Fläschchen der RNA-Stabilisierungslösung platzieren.Verwenden Sie die andere Niere als Leitfaden, um die Hoden zu finden, wenn männlich, oder Gebärmutter und Eierstöcke, wenn weiblich. Sammeln Sie eine oder beide Gonaden, wenn möglich. Nehmen Sie auch Proben von verschiedenen Teilen der Haut des Flügels, und halten Sie in separaten Fläschchen.Der Hauptvorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass er es uns ermöglicht, Tiere auf nicht-tödliche Weise zu beproben, während wir dennoch genügend Material für genomische Studien sowie funktionelle molekulare Studien generieren. Unser Protokoll ermöglicht die Herstellung von primären Fibroblasten aus Flügelgewebe. Die Zellen stellen eine wertvolle erneuerbare Quelle von genetischem Material dar, sowie ein Modell für funktionelle und molekulare Explorationen bei Fledermäusen.Flügelclips, die gemäß Abschnitt 6 des geschriebenen Protokolls in Wachstumsmedien erhalten geblieben sind, sollten in die Gewebekultureinrichtung übertragen werden. Übertragen Sie den Inhalt des Rohres in ein 15 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Für diese Demonstration wird die Flügelmembranbiopsie verwendet.Entfernen Sie vorsichtig das Wachstumsmedium. Waschen Sie die Biopsie zwei Mal mit 500 Mikroliter sterilem PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase vier in die Röhre.Dies wird zu einer Verdauung des Gewebes in einzelne Zellen führen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne Aufregung inkubieren. Machen Sie am zweiten Tag ein frisches Wachstumsmedium und erwärmen es auf 37 Grad Celsius.Bereiten Sie eine sechs Brunnengewebe-Kulturplatte vor, indem Sie zwei Milliliter frisches vorgewärmtes Wachstumsmedium in jedem zu verwendenden Brunnen der Platte hinzufügen. Bewahren Sie diese Platte in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator auf, bis es nötig ist. Entfernen Sie die 15 Milliliter Tube, die die Zellen enthält, aus dem Inkubator, und löschen Sie die Verdauungsreaktion, indem Sie ein Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzufügen.Setzen Sie die Zellen wieder aus, indem Sie die Lösung sorgfältig mit einer P1000 Pipettenspitze trituieren, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen. Drehen Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge drei Minuten lang bei 300-fachem G.Discard den Überstand vorsichtig herunter, indem Sie 80 bis 90% der Flüssigkeit mit einer P1000 Pipette vorsichtig entfernen. Setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter vorgewärmtem Wachstumsmedium aus.Die Suspension wird vorsichtig trituieren, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht mehr sichtbar ist und dass die Zellen ausreichend suspendiert sind, um kleine Gewebestücke zu vermeiden, die an den Wänden noch sichtbar sein können. Das gesamte Volumen der Zellsuspension vorsichtig in einen einzigen Brunnen der sechs zuvor vorbereiteten Wellplatte, die die Vorwärme-Wachstumsmedien enthält, wird vorsichtig pipet. Schaukeln Sie die Platte zwei- bis dreimal von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um Zellen zu helfen, sich in einer einzigen Schicht über die Brunnenoberfläche zu verteilen.Überprüfen Sie die plattierten Zellen unter dem Mikroskop. Es sollten einzelne Zellen sein, die aufundballet und schwebend erscheinen, aber sehr dicht. Legen Sie die Platte vorsichtig in einen Inkubator voreingestellt auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Nach ca. 24 Stunden beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um den Zustand der Kultur zu bestimmen. Zellen sollten nun an der Plattenoberfläche befestigt werden und abgeflacht erscheinen. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator voreingestellt auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Zellen sollten regelmäßig unter dem Mikroskop beobachtet werden, um den Bedarf an Medienerfrischung oder -spaltung zu bestimmen. Wenn nötig, saugen Sie vorsichtig etwa 50% des Mediums aus dem Brunnen, und fügen Sie vorsichtig einen Milliliter vorgewärmten Wachstumsmedium zur Seite des Brunnens, um die Zellen nicht zu stören. Wenn es notwendig ist, die Zellen zu durchziehen, saugen Sie vorsichtig etwa 90% des Wachstumsmediums an.Waschen Sie die Zellen sehr sanft, indem Sie einen Milliliter sterilen PBS an die Wand des Brunnens, um die Zellen nicht zu stören. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig hin und her und zwei- bis dreimal von Seite zu Seite. Alle PBS vorsichtig von der Platte absaugen, bevor sie die Zellen wieder waschen.Trypsin EDTA in den Brunnen geben und die Platte sanft schaukeln, um die gesamte Oberfläche des Brunnens mit Trypsin EDTA zu bedecken, und 1,5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Quench die Reaktion durch Zugabe von einem Milliliter frisch vorgewärmte Wachstumsmedium. Pipette nach oben und unten etwa fünf Mal, um die Zellen von der Oberfläche der Platte zu waschen, und stellen Sie sicher, dass die Zellen in Suspension sind.Legen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und drehen Sie die Zellen drei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 300-fachem G.Discard the supernatant by gently removing 80 to 90 percent of the liquid with a P1000 pipette. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter vorgewärmtem Wachstumsmedium aus, und trituieren Sie die Suspension sanft. Stellen Sie sicher, dass das Pellet oder große Fragmente des Pellets nicht mehr sichtbar sind und sich die Zellen in einer Einzelzellsuspension befinden.Um die Zelle mit einem automatisierten Zellzähler zu zählen, mischen Sie ein zehn Mikroliter Aliquot der suspendierten Zellen eins zu eins mit Trypan blau, um lebensfähige Zellen zu erkennen. Eine Minute inkubieren und 10 Mikroliter der Lösung auf den Zählschlitten liefern. Fügen Sie die Zählfolie in einen automatisierten Zellenzähler ein, um die Zellen mit den entsprechenden Einstellungen zu zählen.Bereiten Sie Gefriermedien vor, indem Sie Wachstumsmedium mit DMSO kombinieren, um eine endgültige Konzentration von 10% DMSO zu erhalten. Das Pellet sollte aus einem 80 bis 90%igen Konfluentbrunnen einer sechs Brunnenplatte hergestellt werden. Das Pellet in anderthalb Milliliter Gefriermedium wieder aufhängen.Legen Sie ca. 750 Mikroliter Zellsuspension in zwei separate Kryovials. Legen Sie die Fläschchen in einen kryogenen Gefrierbehälter, so dass die Zellen langsam einfrieren, um die Vitalität der Zelle zu erhalten. Sofort bei minus 80 Grad Celsius platzieren.Um die gefrorenen Zellen aufzutauen, bereiten Sie eine sechs Brunnenplatte mit zwei Millilitern vorgewärmtem Wachstumsmedium in jedem Brunnen vor, der verwendet wird. Halten Sie die Platte in der 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator, bis erforderlich. Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit Zellen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad, um die Zellen schnell aufzutauen.Dies sollte zwei bis drei Minuten dauern. Sobald die Lösung in der Durchstechflasche aufgetaut ist, pipette nach oben und unten, um die Lösung zu homogenisieren, und sofort die gesamte Lösung in einem Brunnen der sechs Brunnenplatte platzieren. Schaukeln Sie die Platte zwei- bis dreimal von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um Zellen zu helfen, sich in einer einzigen Schicht über die Brunnenoberfläche zu verteilen.Stellen Sie die Zellen im Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Überwachen und durchforsperen Sie die Zellen, wie gezeigt. Repräsentative Ergebnisse der DNA-Extraktion enden für Standard-DNA-Analysen von drei Fledermausarten.Ein einzelnes großes Band weist auf eine minimale Fragmentierung und ähnlich große DNA-Fragmente aus jeder einzelnen Extraktion hin. Ein gemeinsamer Erfolgsindikator für RNA-Extraktionen ist die RNA-Integritätsnummer (RIN) mit Werten über acht, die eine hohe Qualität in Takt-RNA darstellen. Gezeigt werden rIN-Werte von RNA-Extraktionen von 13 verschiedenen Gewebetypen neotropischer Fledermausarten, die an vier verschiedenen Orten beprobt werden.Gewebe, das von Arten in den Anden, Costa Rica und der Dominikanischen Republik abgetastet wurde, wurden nach dem Einweichen in RNA-Stabilisierungslösung bei vier Grad Celsius über Nacht direkt in flüssigen Stickstoff gegeben. Gewebe, die von Arten im Amazonas gebietiert wurden, wurden etwa eine Woche nach dem Platzieren einer RNA-Stabilisierungslösung in flüssigen Stickstoff gehalten und kontinuierlich bei vier Grad Celsius gehalten. Auch in solchen Fällen waren rIN-Werte mit denen vergleichbar, die sofort in RNA-Stabilisierungslösung und direkt in flüssigen Stickstoff gelegt wurden.Nach der Gewebekultur sollten Fledermauszellkulturen 80 bis 90 % der Plattenoberfläche abdecken und ihre ursprüngliche Morphologie beibehalten. Dies stellt die optimale Phase für die Aufteilung dar. Nach mehr als sechs Passagen ändern Zellen ihre Morphologie, um größer und länger zu werden, und die Zellen treten in die Seneszenz ein.Helle aufgeballte Zellen stellen abgestorbene Zellen dar. Zellen in der Kultur stellen eine erneuerbare Quelle von Material dar, wie DNA, RNA und Protein. Diese Zelllinien können eingefroren werden und stellen so eine Ressource dar, die über viele Jahre forschung genutzt werden kann.Dies ermöglicht genomische, transkriptomische und funktionelle Studien, die mit Primärgewebe närzuzieren werden. Beispielsweise können Zellen genetisch oder chemisch verändert werden, um Effekte auf zelluläre Phänotypen zu beobachten.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Forschung

Biologie

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion und Prüfung von Hypoxie in der Zellkultur

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...