Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

אנו מודים סנטרו de Ecología y Biodiversidad CEBIO, אריקה פעליזה, מילסקה סנצ'ז, חורחה קאררה, אדגר Rengifo Vásquez, הרולד Porocarrero Zarria, חורחה Ruíz Leveau, חיימה פצ'קו קסטילו, קרלוס Tello, פאני קרניות, ו פאני פראנדס מלו להכנת רקמות קולקציה בפרו אפשרית. כמו כן, אנו מודים לכל חברי גריפו ג'אגואה ויולנדה לאון על הכנת אוסף רקמות ברפובליקה הדומיניקנית, כמו גם לברnal רודריגז הרננדז, ברנל מאטאריטה, וכולם בתחנת המחקר הביולוגית לה סלבה בקוסטה ריקה, להכנת ניתן לדגימה. אנו מודים לה לאטטנקמפ & לוץ וייגרבה לקבלת גישה ואוסף דגימות של אגרופים מהאגף מתוך לטשטש את העטלפים ליצירת תרבות סלולרית. העטלפים מקורם במושבת הרבייה בביולוגיה המחלקה השנייה של אוניברסיטת לודוויג-מקסימיליאן במינכן. אישור לשמור ולקיים את העטלפים הונפק על ידי המשרד הוטרינרית במחוז מינכן. LMD, SJR, KTJD, ו LMD מומן על ידי NSF-דאב 1442142. LMD מומן על ידי NSF-דאב 1838273. LRY מומן על ידי NSF-PRFB 1812035. SCV ו-PD מומן על ידי פרס קבוצת מחקר Max פלאנק, ו תוכנית המדע גבולות האדם (HFSP) מענק מחקר (RGP0058/2016). SJR, JHTP, ו KTJD מומן על ידי מועצת המחקר האירופי (ERC החל מענק 310482 [EVOGENO]) הוענק SJR, ECT מומן על ידי מלגת מועצת המחקר האירופי (ERC-2012-StG311000).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת אבן ברוק (פרוטוקול #2013-2034).
1. המתת חסד
<ol><li>מויסטן כדור צמר גפן עם הרדמה. או הרדמה אחרת זמינה</li>
	<li>מניחים את כדור הכותנה לתוך שקית פלסטיק מחדש, אטום לאיטום. התיק צריך להיות גדול מספיק כדי ל?...

הפרוטוקול הנדון בכתב יד זה מתאר את נוהלי הדיגום הטובים ביותר לניתוח מולקולרי בתפוקה גבוהה של עטלפים. כל מחקרים מצליחים-omics דורשים רקמה באיכות גבוהה, אבל רקמת העטלף, כמו גם אחרים שאינם מודל אורגניזמים, מתרחשת לעתים קרובות בתנאי שדה, כי לא ניתן להגדיר את אותם סטנדרטים כמו אלה של הגדרת מעבדה מ?...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

כמו טכנולוגיות ברצף התפוקה גבוהה מראש, שיטות סטנדרטיות לרכישת רקמות באיכות גבוהה ושימור לאפשר הארכה של שיטות אלה לאורגניזמים שאינם מודל. סדרה של פרוטוקולים כדי למטב את אוסף רקמות מעטלפים פותחה עבור סדרה של גישות בתפוקה גבוהה רצף. מתוארים כאן הם פרוטוקולים ללכידת עטלפים, הדמוגרפיה הרצויה לאסוף עבור כל עטלף, ואת שיטות אופטימיזציה כדי למזער את הלחץ על המחבט במהלך איסוף רקמות. מתואר במיוחד הם שיטות איסוף וטיפול ברקמות כדי להשיג (i) DNA עבור משקל מולקולרי גבוה ניתוחים גנומית, (ii) RNA עבור הרקמה ספציפיים הטרנססקריפט, ו (iii) חלבונים עבור ניתוח ברמה פרוטמית. לבסוף, גם מתואר הוא שיטה כדי למנוע דגימה קטלנית על ידי יצירת תרביות תאים הראשי קיימא מאטבי כנף. מוטיבציה מרכזית של שיטות אלה היא למקסם את כמות הנתונים המולקולריים הפוטנציאליים ומורפולוגיים עבור כל עטלף ולהציע דרכים אופטימליות כדי לשמר את הרקמות כך שהם שומרים על הערך שלהם כמו שיטות חדשות להתפתח בעתיד. סטנדרטיזציה זו הפכה חשובה במיוחד כמו יוזמות לרמת כרומוזום ברמה, שגיאה ללא שגיאות של מינים ברחבי העולם הופיעו, שבו מפלגות מדעיות מרובות מוביל את רצף של מיסים שונים קבוצות. הפרוטוקולים המפורטים להלן מגדירים את אוסף הרקמה האידיאלית שיטות שימור רקמה עבור Bat1K, קונסורציום כי הוא ברצף את הגנום של כל מיני עטלף.

DNA עבור משקל סטנדרטי מולקולרי נמוך (LMW) ניתוחים, ה-DNA הופק מתוך שלושה מינים neotropical עטלפים. דגימות רקמות נאספו בשדה מהרפובליקה הדומיניקנית וקוסטה ריקה, בעקבות הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה. בעקבות ניתוח, חתיכות קטנות (< 0.5 ס מ בחלק הדק ביותר) של רקמות מעורבות (המוח, ה...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

זהו פרוטוקול עבור הכנת רקמה אופטימלית עבור גנומית, טראנסקריפט, וניתוחים פרוטאומית של עטלפים נתפס בטבע. הוא כולל פרוטוקולים עבור לכידת בת וניתוח, שימור רקמות, ותא culturing של רקמת בת.

אוסף רקמות של עטלפים עבור-ניתוח Omics ותרבות התא הראשוני

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

בסרטון זה, אנו מספקים מדריך צעד אחר צעד לאיסוף עטלפים בצורה הומנית, שנועד למזער את ההשפעה על אוכלוסיות ולמקסם את הערך המדעי. היתרונות של הגישה שלנו הם שאנחנו למקסם את כמות הנתונים המולקולריים והמורפולוגיים הפוטנציאליים עבור כל עטלף, לשמר רקמות כדי לשמור על הערך העתידי שלהם, ולמזער את קצירת אנשים פראיים. קשה להדגים פרוטוקולי ניתוח מילוליים.רבות מטכניקות הכנת הרקמות שאנו מציגים כאן מועברות בצורה הטובה ביותר באמצעות הדמיה כיצד איברים שונים מזוהים, ולאחר מכן נותפו ומאוחסנים כראוי. הכן את כל הבקבוקונים לפני תחילת כל ניתוחים כדי למנוע עיכובים. עבור RNA, להפריש את מספר הבקבוקונים הדרושים עבור כל דגימה.סמן כל צינור עם סוג הרקמה שייאסף, כמו גם מידע זיהוי דגימה סטנדרטי. ממלאים את הבקבוקונים 50% מלאים בתותבת ייצוב RNA, ומצננים לארבע מעלות צלזיוס. יש לדאוג לא למלא את הבקבוקונים לחלוטין עם פתרון ייצוב RNA, כמו הצינור עלול להתפוצץ בעת הצבת אותו חנקן נוזלי.מיד לאחר המתת החסד, בצע עריפת ראש של דגימת העטלף כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עור הגולגולת מן השיער, fascia, ושרירי הגולגולת, כולל העור על האף. תדאג לא לשבור את הקצה הקדמי של האף.הסר את העיניים עם ממטרות, באמצעות כוח חזק מספיק כדי לנתק את עצב הראייה. מניחים את העיניים בבקבוקון שני מיליליטר של פתרון ייצוב RNA. השתמש במספריים כדי להפוך חתך קשתי על החלק הגבי של הגולגולת החל בצוואר, דואג לא לפגוע במוח.לאחר מכן, השתמש במעצורים כדי למשוך בעדינות את שני צידי הגולגולת, עד שהוא סדוק פתוח לחשוף את המוח. ודא שהגולגולת של הקצה הגולגולתי הוסרה, כך שמדפים יכולים בקלות לגרד את המוח. מגרדים בעדינות את המוח במדפים.המוח יהיה רך מאוד. נורת הריח תהפוך גלויה, יושבת בחלק הגחוני של פנים הגולגולת. נסה לשמור על נורת הריח מחוברת.במידת האפשר, לשמור על צורת המוח שלם, ומיד למקם אותו על קרח יבש, או בקבוקון חמישה מיליליטר של פתרון ייצוב RNA. בקצה הגולגולת, הקוכלי צריך להיות גלוי כעת באופן צדדי בכל צד של הראש. השתמש במקלף כדי למשוך בעדינות את cochlei.לאחר מכן, לשים אותם אחד שני מיליליטר בקבוקון של פתרון ייצוב RNA. בצע שני חתכים שבהם הלסת העליונה והתחתון להצטרף, ולהסיר את הלסת התחתונה. צלחת הקריבריפורם תתברר.זוהי עצם קריטית כדי לשמור על החוקר מכוון. זה יכול להיות מזוהה כאזור הראשון ביותר של הגולגולת, עם foramen מרובים, ועם שני חריצים שבו נורת הריח מונחת. לאחר הישוב הוסר, להסיר את rostrum מהחלק הנותר של הגולגולת.ודא שהלסת כוללת את צלחת הקריבריפורם. מניחים את האף בתתבת ייצוב RNA, ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס לילה. מן הדם התחתון, לחתוך את הלשון עם מספריים, ומניחים בקבוקון שני מיליליטר של פתרון ייצוב RNA.מניחים את בקבוקון האף בחנקן נוזלי בעקבות הלילה להשרות בתסכום ייצוב RNA. לאחר 24 שעות של השרייה על קרח, או במקרר, מניחים את הדגימות בחנקן נוזלי. השתמש אזמל לנקב דרך חלל הבטן, מה שהופך חתך אורך עד הצלעות.זה מאבד את מסגרת השלד. להפשיט את העור כדי לחשוף את שריר החזה, ולקחת לפחות שתי דגימות של שריר. רקמות הן RNA והן DNA נאספים במהלך ניתוחים אלה.מניחים רקמות עבור DNA משקל מולקולרי גבוה לתוך cryovials יבש, והקפאת פלאש בחנקן נוזלי. מניחים רקמות עבור RNA בת פתרון ייצוב RNA. חותכים דרך עצם החזה, ומרחיקים את הצלעות.עכשיו, להחזיר את הריאה והלב. השתמש באזמל ומדפים כדי להפריד את הלב מן הריאה. השתמש אזמל כדי לשבור את הריאה, ולמקום פתרון ייצוב RNA.לאסוף את הלב, אשר ניתן לקחת שלם, אבל צריך להיות חתך לתוך חצאים, כך פתרון ייצוב RNA ספוג ביסודיות. עכשיו, קח דגימות מהכבד. קח לפחות שתי דגימות של כבד.מניחים דגימה אחת לתוך בקבוקון להישאר קפוא עבור DNA משקל מולקולרי גבוה, ומ מניחים את המדגם השני בתתבת ייצוב RNA. בצע את צינור ההפטר כדי למצוא את הלבלב ואת כיס המרה. מעבירים את כיס המרה לבקבוקון של פתרון ייצוב RNA.מצא את הקיבה, ואת הטחול דמוי הנוצה בבסיסו, המופיע כגוון שונה של סגול. הלבלב צריך להיות גם גלוי כאן כמבנה משקל. לאסוף את הבטן, הטחול, ואת הלבלב, בקבוקונים בהתאמה של פתרון ייצוב RNA.לאסוף דגימות קטנות של המעי הדק והגדול. מניחים בקבוקונים בהתאמה של פתרון ייצוב RNA. קח את אחת הכליות, ופעל צינורות שלהם לשלפוחית השתן, ולאחר מכן למקם בקבוקונים בהתאמה של פתרון ייצוב RNA.השתמש בכליה האחרת כמדריך כדי למצוא את האשכים אם זכר, או רחם ושחלות אם נקבה. לאסוף אחד או שניהם gonads אם אפשר. כמו כן לקחת דגימות של חלקים שונים של העור של הכנף, ולשמור בקבוקונים נפרדים.היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהיא מאפשרת לנו לדגום בעלי חיים בצורה לא קטלנית, תוך יצירת מספיק חומר למחקרים גנומיים, כמו גם מחקרים מולקולריים פונקציונליים. הפרוטוקול שלנו מאפשר הכנת פיברובלסטים ראשוניים מרקמה כנף. התאים מייצגים מקור מתחדש יקר של חומר גנטי, כמו גם מודל לחקר פונקציונלי ומולקולרי בעטלפים.קטעי כנף שנשמרו במדיה צמיחה לפי סעיף שש של הפרוטוקול הכתוב יש להעביר למתקן תרבות הרקמה. מעבירים את תכולת הצינור לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מיליליטר. ביופסיית קרום הכנף משמשת להדגמה זו.הסר בזהירות את מדיום הצמיחה. לשטוף בעדינות את הביופסיה פעמיים עם 500 microliters של PBS סטרילי. הוסף 500 מיקרוליטר של מיליגרם אחד לכל קולגנס מיליליטר ארבע לצינור.זה יגרום לעיכול של הרקמה לתאים בודדים. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ללא תסיסה. ביום השני, לעשות מדיום צמיחה טרי, ו prewarm אותו ל 37 מעלות צלזיוס.הכן צלחת תרבות רקמה שש היטב על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום צמיחה טרום המלחמה טרי בכל באר של הצלחת לשמש. יש לאחסן את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס וב-5%פחמן דו-חמצני עד לצורך. הסר את הצינור 15 מיליליטר המכיל את התאים מן החממה, ומרווה את תגובת העיכול על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי.תן שימוש חוזר בתאים על-ידי טריטוריה זהירה של הפתרון עם קצה פיפטה P1000 כדי להשיג השעיה של תא יחיד. בעדינות לסובב את התאים בצנטריפוגה שולחן במשך שלוש דקות ב 300 פעמים G. להשליך את העל טבעי על ידי בעדינות הסרת 80 עד 90% של הנוזל עם פיפטה P1000. תן שימוש חוזר לכדור ב-500 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה לפני המלחמה.בעדינות triturate ההשעיה כדי להבטיח כי גלולה כבר לא גלוי, כי התאים מושעים מספיק, הקפדה להימנע חתיכות קטנות של רקמה אשר עדיין עשוי להיות גלוי על הקירות. בעדינות pipette את כל נפח של מתלים התא לתוך באר אחת של צלחת באר שש שהוכן קודם לכן, המכיל את התקשורת צמיחה לפני המלחמה. מטלטלים בעדינות את הצלחת מצד לצד ומקדים לאחור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לעזור לתאים להפיץ על פני השטח של באר בשכבה אחת.בדוק את התאים הצפויים מתחת למיקרוסקופ. הם צריכים להיות תאים בודדים שנראים מנוערים וצפים, אבל צפופים מאוד. מניחים בזהירות את הצלחת לתוך אינקובטור מוגדר מראש ל 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.לאחר כ 24 שעות, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע את בריאות התרבות. כעת יש לחבר תאים למשטח הלוח, ולהופיע שטוחים. שמרו על התאים באינקובטור לח קבוע מראש ל-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.תאים יש לצפות תחת המיקרוסקופ באופן קבוע כדי לקבוע את הצורך רענון מדיה או פיצול. במידת הצורך, שאפו בזהירות כ-50% מהמדיום מהכרכרה, והוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של מדיום צמיחה לפני המלחמה לצד הבאר, כדי לא להפריע לתאים. כאשר יש צורך לעבור את התאים, בזהירות שאף כ 90% של מדיום הצמיחה.לשטוף את התאים בעדינות רבה על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי לקיר של באר, כדי לא להפריע לתאים. מטלטלים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה וצד לצד פעמיים עד שלוש פעמים. בזהירות שאף את כל PBS מהצלחת לפני שטיפת התאים שוב.מוסיפים את טריפסין EDTA לגם, ומטלטלים בעדינות את הצלחת כדי לכסות את כל פני השטח של באר עם טריפסין EDTA, ו דגירה במשך 1 וחצי דקות בטמפרטורת החדר. יש להתוות את התגובה על-ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום צמיחה טרי לפני המלחמה. פיפטה למעלה ולמטה כחמש פעמים כדי לשטוף את התאים מפני השטח של הצלחת, ולהבטיח את התאים הם בהשעיה.מניחים את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר, ולסובב את התאים בצנטריפוגה שולחן במשך שלוש דקות ב 300 פעמים G.השלך את העל טבעי על ידי בעדינות הסרת 80 עד 90 אחוזים של הנוזל עם פיפטה P1000. תן מחדש את גלולה במיליליטר אחד של מדיום צמיחה מראש, בעדינות triturate ההשעיה. ודא כי גלולה או שברים גדולים של גלולה אינם גלויים עוד, ותאים נמצאים בהשעיה תא יחיד.כדי לספור את התא באמצעות מונה תאים אוטומטי, יש לערבב 10 מיליליטר של התאים התלויים אחד לאחד עם כחול טריפאן כדי לזהות תאים בני קיימא. דגירה לדקה אחת, ו pipette 10 microliters של הפתרון על שקופית הספירה. הוסף את שקופית הספירה לתוך מונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים באמצעות ההגדרות המתאימות.הכן מדיה קפואה על-ידי שילוב מדיום צמיחה עם DMSO כדי לקבל ריכוז סופי של 10%DMSO. יש להכין את גלולה מ 80 עד 90% confluent גם של צלחת שש באר. תן את הכדור במיליליטר וחצי של מדיום מקפיא.מניחים כ 750 microliters של השעיית תא בכל אחד משני cryovials נפרדים. מניחים את הבקבוקונים במיכל הקפאה קריוגני, כך התאים להקפיא לאט כדי לשמור על חיוניות התא. מיד מניחים אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי להפשיר את התאים הקפואים, הכינו צלחת בארות המכילה שני מיליליטר של מדיום צמיחה לפני המלחמה בכל באר שתשמש. שמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור עד הצורך. קח בקבוקון אחד של תאים מחנקן נוזלי, והצב אותו באמבט מים חמים כדי להפשיר במהירות את התאים.זה אמור לקחת שתיים עד שלוש דקות. ברגע שהפתרון בבקבוקון מופשר, בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי הומוגניזציה של הפתרון, ומיד למקם את הפתרון כולו באר אחת מתוך שש צלחת היטב. מטלטלים בעדינות את הצלחת מצד לצד ומקדים לאחור פעמיים עד שלוש פעמים כדי לעזור לתאים להפיץ על פני השטח של באר בשכבה אחת.מניחים את התאים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. לפקח ולמעבר התאים כפי שהוכח. תוצאות מייצגות של עקירות DNA מוצגות לניתוחי דנ"א סטנדרטיים משלושה מיני עטלפים.רצועה גדולה אחת מצביעה על פיצול מינימלי, ושברי דנ"א בגודל דומה מכל מיצוי בהתאמה. אינדיקטור נפוץ להצלחה עבור עקירות RNA הוא מספר שלמות RNA, או RIN, עם ערכים מעל שמונה המייצגים איכות גבוהה ב- RNA טקט. מוצגים להלן ערכי RIN של עקירות RNA מ -13 סוגים שונים של רקמות של מיני עטלפים נאוטרופיים, שנדגמו בארבעה יישובים שונים.רקמות שנדגמו ממינים באנדים, קוסטה ריקה, ואת הרפובליקה הדומיניקנית הונחו ישירות חנקן נוזלי לאחר השרייה בתותבת ייצוב RNA בארבע מעלות צלזיוס לילה. רקמות שנדגמו ממינים באמזונס הונחו בחנקן נוזלי כשבוע לאחר שהציבו פתרון ייצוב RNA, והמשיכו לייצב בארבע מעלות צלזיוס ברציפות. גם במקרים כאלה, ערכי RIN היו דומים לאלה שהוצבו מיד בתתברית ייצוב RNA, ישירות לתוך חנקן נוזלי.בעקבות תרבות הרקמה, תותבי תאי העטלף צריכים לכסות 80 עד 90% משטח הלוח, ולשמור על המורפולוגיה המקורית שלהם. זה מייצג את השלב האופטימלי לפיצול. לאחר יותר משישה קטעים, התאים ישנו את המורפולוגיה שלהם כדי להיות גדולים יותר ויותר, והתאים ייכנסו לחושים.תאים בהירים עם כדורים מייצגים תאים מתים. תאים בתרבות מייצגים מקור מתחדש של חומר, כמו דנ"א, רנ"א וחלבון. ניתן להקפיא קווי תאים אלה, ובכך לספק משאב שניתן להשתמש בו לאורך שנים רבות של מחקר.זה מאפשר מחקרים גנומיים, תעתיקים ופונקציונליים שיהיו מאתגרים באמצעות רקמות ראשוניות. לדוגמה, תאים ניתן לשנות גנטית או כימית כדי לבחון את ההשפעות על פנוטיפים הסלולר.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...