Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
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센트로 데 에코로지아 y 바이오다이버시다드 CEBIO, 에리카 팔리자, 밀루스카 산체스, 호르헤 카레라, 에드가 렌기포 바스케스, 해롤드 포로카레로 자리아, 호르헤 루이스 레보, 하이메 페체코 카스티요, 카를로스 텔로, 패니 코넬레호, 패니 페르네즈 에게 감사드립니다. 페루에서 수집 할 수 있습니다. 또한 도미니카 공화국에서 조직 수집을 가능하게 해준 그루포 자라과와 욜란다 레온의 모든 회원과 베르날 로드리게스 에르난데스, 베르날 마타리타, 코스타리카의 라 셀바 생물 연구 센터의 모든 분들께 감사드립니다. 샘플링이 가능합니다. 우리는 세포 배양 생성을위한 필로스토무스 변색 박쥐에서 날개 펀치의 액세스 및 샘플 수집에 대한 엘라 Lattenkamp & Lutz Wiegrebe 감사합니다. 필로스토무스 변색 박쥐는 뮌헨의 루드비히 막시밀리안 대학의 학과 생물학 II의 번식 식민지에서 유래. 박쥐를 유지하고 번식하는 승인은 뮌헨 지역 수의학 사무소에 의해 발행되었다. LMD, SJR, KTJD 및 LRY는 NSF-DEB 1442142의 자금을 지원받았습니다. LMD는 NSF-DEB 1838273에 의해 투자되었다. LRY는 NSF-PRFB 1812035에 의해 투자되었다. SCV와 PD는 막스 플랑크 연구 그룹 상과 인간 국경 과학 프로그램 (HFSP) 연구 보조금 (RGP0058 /2016)에 의해 투자되었다. SJR, JHTP, KTJD는 유럽 연구위원회 (ERC 시작 교부금 310482 [EVOGENO])에 의해 투자되었다, ECT는 유럽 연구위원회 보조금에 의해 투자되었다 (ERC-2012-StG311000).

여기에 설명된 모든 방법은 스토니 브룩 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 #2013-2034).
1. 안락사
<ol><li>이소플루란 마취제 또는 다른 사용 가능한 마취제로 면봉을 적시다.</li>
	<li>면봉을 재밀봉 가능한 밀폐형 비닐 봉지에 넣습니다. 가방은 천 박쥐 가방에 편안하게 가방을 보관할 수있을만큼 커야합니다.</li>
	<li>몇 분 후에 가방?...

이 원고에서 논의된 프로토콜은 박쥐의 다양한 고처리량 분자 분석을 위한 최상의 샘플링 사례를 설명합니다. 모든 성공적인 -omics 연구는 고품질 조직을 필요로하지만, 샘플링 박쥐 조직뿐만 아니라 다른 비 모델 유기체, 종종 제어 실험실 설정과 동일한 표준으로 설정할 수없는 필드 조건에서 발생합니다. 샘플링은 전기 및 냉동고에 대한 제한된 액세스를 포함하여 최소한의 리소스로 원격 위치...

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

고처리량 시퀀싱 기술이 발전함에 따라 고품질 조직 획득 및 보존을 위한 표준화된 방법을 통해 이러한 방법을 비모델 유기체로 확장할 수 있습니다. 박쥐에서 조직 수집을 최적화하는 일련의 프로토콜은 일련의 고처리량 시퀀싱 접근법을 위해 개발되었습니다. 여기에 설명된 것은 박쥐 포획을 위한 프로토콜, 각 박쥐에 대해 수집할 원하는 인구 통계, 조직 수집 중 박쥐의 스트레스를 최소화하기 위한 최적화된 방법입니다. 구체적으로 설명된 것은 (i) 고분자량 게놈 분석을 위한 DNA, (ii) 조직 특이적 전사체에 대한 RNA 및 (iii) 단백질-수준 분석을 위한 단백질을 얻기 위해 조직을 수집하고 치료하는 방법이다. 마지막으로, 또한 날개 클립에서 실행 가능한 기본 세포 배양을 만들어 치명적인 샘플링을 피하는 방법입니다. 이 방법의 중앙 동기는 각 박쥐에 대한 잠재적 인 분자 및 형태 학적 데이터의 양을 극대화하고 새로운 방법이 미래에 개발로 자신의 가치를 유지하기 위해 조직을 보존하는 최적의 방법을 제안하는 것입니다. 이 표준화는 전 세계 여러 과학 당사자가 다른 분류학의 순서를 주도하고있는 염색체 수준의 오류없는 게놈을 서열화하는 이니셔티브가 등장함에 따라 특히 중요해졌습니다. 그룹. 본 명세서에 설명된 프로토콜은 Bat1K에 대한 이상적인 조직 수집 및 조직 보존 방법을 정의하며, 이는 모든 종의 박쥐의 게놈을 시퀀싱하는 컨소시엄이다.

Dna 표준 낮은 분자량 (LMW) 분석을 위해, DNA는 3개의 신열대 박쥐 종에서 추출되었습니다. 조직 샘플은 이 논문에 기재된 프로토콜에 따라 도미니카 공화국 및 코스타리카로부터 현장에서 수집하였다. 해부 후, 혼합 조직 (뇌, 간 및 장)의 작은 조각 (가장 얇은 부분에서 0.5 cm)을 RNA 안정화 용액에 넣고 플래시 냉동 한 다음 -80 °C에서 보관했습니다. 추출은 RNase ...

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Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

이것은 야생에서 잡힌 박쥐의 게놈, 전사체 및 단백질 분석을위한 최적의 조직 준비를위한 프로토콜입니다. 그것은 박쥐 포획 및 해부, 조직 보존 및 박쥐 조직의 세포 배양을위한 프로토콜을 포함한다.

-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

이 비디오에서는 인구에 미치는 영향을 최소화하고 과학적 가치를 극대화하기 위한 인도적인 방식으로 박쥐를 수집하는 단계별 가이드를 제공합니다. 우리의 접근 법의 장점은 우리가 각 박쥐에 대한 잠재적 인 분자 및 형태학적 데이터의 양을 극대화하고, 미래의 가치를 유지하기 위해 조직을 보존하고, 야생 개인수확을 최소화한다는 것입니다. 해부 프로토콜은 구두로 설명하기가 어렵습니다.우리가 여기에서 제시하는 조직 준비 기술의 대부분은 다른 기관이 어떻게 확인되는지 시각화를 통해 가장 잘 전달되고, 그 때 제대로 해부되고 저장됩니다. 지연을 피하기 위해 해부를 시작하기 전에 모든 바이알을 준비합니다. RNA의 경우 각 시편에 필요한 바이알 수를 따로 둡니다.수집될 조직 유형과 표준 시편 식별 정보로 각 튜브에 라벨을 부착합니다. RNA 안정화 용액으로 50%의 병을 채우고 섭씨 4도까지 식힙니다. 액체 질소에 배치할 때 튜브가 폭발할 수 있으므로 RNA 안정화 용액으로 바이알을 완전히 채우지 않도록 주의하십시오.안락사 직후, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 박쥐 표본의 참수 작업을 수행한다. 코의 피부를 포함하여 모발, 근막 및 두개골 근육에서 두개골을 피부로 연결합니다. 코의 프런트 엔드를 부러뜨리지 않도록 주의하십시오.시신경을 분리하기에 충분한 힘을 사용하여 집게로 눈을 제거하십시오. RNA 안정화 용액의 2 밀리리터 바이알에 눈을 놓습니다. 두개골의 등대 에서 목에서 시작하여 뇌를 손상시키지 않도록 주의하십시오.그런 다음, 부드럽게 뇌를 노출하기 위해 열어 금이 갈 때까지, 두개골의 양쪽을 다시 당겨 집게를 사용합니다. 두개골 끝의 두개골이 제거되었는지 확인하여 집게가 쉽게 뇌를 긁어 버릴 수 있도록 하십시오. 집게로 뇌를 부드럽게 긁어냅니다.뇌는 매우 부드러질 것입니다. 후각 전구가 보이는 것으로, 두개골 내부의 복부 부분에 앉아 있을 것입니다. 후각 전구를 부착하여 보관하십시오.가능하면 뇌 모양을 그대로 유지하고 즉시 드라이 아이스또는 RNA 안정화 용액의 5 밀리리터 바이알에 놓습니다. 두개골의 코골 끝에, 코클레이는 이제 머리의 양쪽에 측면으로 볼 수 있어야합니다. 집게를 사용하여 코클레이를 부드럽게 당깁니다.그런 다음 RNA 안정화 용액의 2 밀리리터 바이알 1개에 넣습니다. 상단과 아래턱이 결합하는 두 개의 절개를 만들고 하악을 제거합니다. 크리브리폼 플레이트가 명백해질 것입니다.이것은 연구원의 방향을 유지하는 중요한 뼈입니다. 그것은 여러 포먼, 그리고 후각 전구가 달려 두 개의 홈으로, 두개골의 가장 전방 영역으로 식별 할 수 있습니다. 하악이 제거되면 두개골의 나머지 부분에서 로스트럼을 제거하십시오.턱에 크리브리폼 플레이트가 포함되어 있는지 확인합니다. RNA 안정화 용액에 코를 놓고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 하악함에서 가위로 혀를 자르고 RNA 안정화 용액의 2 밀리리터 바이알에 놓습니다.RNA 안정화 용액에 밤새 담그고 다음 액체 질소에 코 유리병을 놓습니다. 얼음이나 냉장고에 24시간 담근 후 샘플을 액체 질소에 넣습니다. 메스를 사용하여 복강을 관통하여 갈비뼈까지 세로 절개를 합니다.이렇게 하면 골격 프레임이 몰수됩니다. 가슴을 드러내기 위해 피부를 제거하고 적어도 두 개의 근육을 섭취하십시오. RNA와 DNA 둘 다를 위한 조직은 이 해부 도중 집합됩니다.고분자 DNA조직을 건조 극저온에 넣고 액체 질소에 플래시 동결을 넣습니다. RNA 안정화 용액에 RNA조직을 배치합니다. 흉골을 잘라 갈비뼈를 당깁니다.이제 폐와 심장을 검색합니다. 메스와 집게를 사용하여 심장을 폐에서 분리하십시오. 메스를 사용하여 폐를 분해하고 RNA 안정화 용액에 배치하십시오.전체를 취할 수 있지만 RNA 안정화 용액이 철저히 흡수되도록 반으로 단면되어야하는 심장을 수집합니다. 지금, 간에서 샘플을 가져 가라. 간 샘플을 적어도 두 개 복용하십시오.1개의 견본을 높은 분자량 DNA를 위해 동결된 남아 있는 유리병에 놓고, RNA 안정화 용액에 그밖 견본을 놓습니다. 간 덕트를 따라 췌장과 담낭을 찾으십시오. 담낭을 RNA 안정화 용액의 병기로 옮는다.위장을 찾아, 보라색의 다른 그늘로 나타나는 그것의 기지에서 깃털 같은 비장. 췌장은 또한 무게 구조로 여기에서 볼 수 있어야 합니다. RNA 안정화 용액의 각각 바이알에서 위, 비장 및 췌장을 수집합니다.소장과 소장의 작은 샘플을 수집합니다. RNA 안정화 용액의 각 바이알에 배치합니다. 신장 중 하나를 가지고 방광에 자신의 덕트를 따라, 다음 RNA 안정화 용액의 각각의 바이알에 배치.다른 신장을 가이드로 사용하여 여성이 있는 경우 남성, 자궁 및 난소의 고환을 찾으십시오. 가능하면 하나 또는 두 개의 생식구를 수집합니다. 또한 날개의 피부의 다양한 부분의 샘플을 가지고, 별도의 바이알에 보관.우리의 접근의 주요 이점은 우리가 아직도 게놈 연구 결과, 기능적인 분자 연구 결과를 위한 충분한 물질을 생성하는 동안, 비 치명적인 방식으로 동물을 샘플링하는 것을 허용한다는 것입니다. 우리의 프로토콜은 날개 조직에서 기본 섬유 아세포의 준비를 허용합니다. 세포는 유전 물질의 귀중한 재생 가능한 근원을, 뿐만 아니라 박쥐에 있는 기능및 분자 탐사를 위한 모형을 나타냅니다.필기 프로토콜의 섹션 6에 따라 성장 매체에 보존된 날개 클립은 조직 배양 시설로 옮겨져야 한다. 튜브의 내용을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 날개 막 생검은이 데모에 사용됩니다.조심스럽게 성장 매체를 제거합니다. 멸균 PBS의 500 마이크로 리터로 생검을 두 번 부드럽게 씻으십시오. 튜브에 밀리리터 콜라게나아제 4당 1밀리그램의 500 마이크로리터를 추가합니다.이것은 개별적인 세포로 조직의 소화를 일으키는 원인이 될 것입니다. 교반없이 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 둘째 날에는 신선한 성장 매체를 만들고 섭씨 37도까지 예열하십시오.사용할 플레이트의 각 웰에 신선한 예온 성장 배지의 2 밀리리터를 추가하여 6개의 잘 조직 배양 판을 준비한다. 이 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터 5%에 필요할 때까지 보관하십시오. 인큐베이터로부터 세포를 함유하는 15밀리리터 튜브를 제거하고, 신선한 성장 배지의 1밀리리터를 첨가하여 소화 반응을 담금질한다.단일 셀 서스펜션을 달성하기 위해 P1000 파이펫 팁으로 용액을 신중하게 세트리튜레이션하여 세포를 다시 중단합니다. P1000 파이펫으로 액체의 80~90%를 부드럽게 제거하여 300배 G.에서 3분간 탁상 원심분리기에서 셀을 부드럽게 회전시다. 미리 따뜻해진 성장 매체의 500 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.펠릿이 더 이상 보이지 않도록 서스펜션을 부드럽게 세트리에트하여 세포가 충분히 일시 중단되어 벽에 여전히 볼 수 있는 작은 조직을 피하십시오. 셀 서스펜션의 전체 부피를 미리 준비한 6개의 웰 플레이트의 단일 웰로 부드럽게 피펫하여 사전 웜 성장 매체를 함유하고 있다. 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 서 두 세 번 뒤로 흔들어 세포가 단일 층의 우물 표면에 분배할 수 있도록 돕습니다.현미경으로 도금된 세포를 확인하십시오. 그(것)들은 공과 떠있는 것처럼 보이는 단 하나 세포이어야 합니다, 그러나 아주 조밀합니다. 조심스럽게 37섭씨와 5%의 이산화탄소를 선셋한 인큐베이터에 접시를 넣습니다.약 24 시간 후, 배양의 건강을 결정하기 위해 현미경의 밑에 세포를 관찰한다. 이제 셀을 플레이트 표면에 부착하고 평평하게 나타납니다. 가습 된 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %로 미리 설정하여 유지하십시오.세포는 미디어 다과 또는 분할의 필요성을 결정하기 위해 정기적으로 현미경으로 관찰되어야합니다. 필요할 때마다, 조심스럽게 우물에서 매체의 약 50 %를 흡인하고, 부드럽게 세포를 방해하지 않도록, 잘의 측면에 미리 따뜻해지는 성장 매체의 1 밀리리터를 추가합니다. 세포를 통과 할 필요가있을 때, 조심스럽게 성장 매체의 약 90 %를 흡인.세포를 방해하지 않도록 멸균 PBS의 1 밀리리터를 벽에 추가하여 세포를 매우 부드럽게 씻으십시오. 접시를 앞뒤로 좌우로 2~3번 부드럽게 흔들어 놓습니다. 조심스럽게 다시 세포를 세척하기 전에 접시에서 PBS의 모든을 흡인.트립신 EDTA를 우물에 넣고 접시를 부드럽게 흔들어 트립신 EDTA로 우물의 전체 표면을 덮고 실온에서 1 분 반 동안 배양하십시오. 신선한 예온 성장 매체의 1 밀리리터를 추가하여 반응을 담급니다. 파이펫은 약 5배 아래로 내려가 면으로부터 세포를 세척하고 세포가 현탁액에 있는지 확인합니다.셀 서스펜션을 15 밀리리터 튜브에 놓고, P1000 파이펫으로 액체의 80~90%를 부드럽게 제거하여 300배 G.에서 3분간 탁상 원심분리기에서 셀을 회전시다. 미리 따뜻진 성장 매체의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 서스펜션을 부드럽게 세타게 합니다. 펠릿의 펠릿 또는 큰 조각이 더 이상 보이지 않고 세포가 단일 세포 현탁액에 있는지 확인합니다.자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하려면, 실행 가능한 세포를 검출하기 위해 trypan blue와 1 대 1로 일시 중단 된 세포의 10 마이크로 리터 알리쿼트를 혼합합니다. 1분 동안 배양하고, 파이펫 10 마이크로리터의 용액을 계산 슬라이드에 제공합니다. 카운트 슬라이드를 자동화된 셀 카운터에 삽입하여 적절한 설정을 사용하여 셀을 계산합니다.성장 배지와 DMSO를 결합하여 10%DMSO의 최종 농도를 확보하여 동결 매체를 준비한다. 펠릿은 6 개의 웰 플레이트의 80 ~ 90 %의 컨실수 우물에서 준비해야합니다. 동결 매체의 하나 반 밀리리터에 펠릿을 다시 중단.각각 2개의 분리된 극저온에 약 750마이크로리터의 세포 현탁액을 놓습니다. 세포가 세포 활력을 유지하기 위해 천천히 얼도록 극저온 냉동 용기에 바이알을 놓습니다. 즉시 영하 80도에 놓습니다.냉동 된 세포를 해동하려면, 사용될 각 우물에서 예온 성장 배지의 두 밀리리터를 포함하는 여섯 개의 우물 판을 준비합니다. 필요한 때까지 섭씨 37도 및 이산화탄소 인큐베이터 5%로 플레이트를 유지합니다. 액체 질소에서 세포의 한 유리병을 가지고, 빠르게 세포를 해동따뜻한 물 목욕에 배치.이 경우 2~3분정도 소요됩니다. 바이알의 용액이 해동하자마자 부드럽게 피펫위아래로 어플렛하여 용액을 균질화하고, 즉시 전체 용액을 6개의 웰 플레이트 중 한 웰에 놓습니다. 플레이트를 좌우로 부드럽게 흔들어 서 두 세 번 뒤로 흔들어 세포가 단일 층의 우물 표면에 분배할 수 있도록 돕습니다.인큐베이터에 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소5%를 24~48시간 동안 배치합니다. 입증 된 대로 세포를 모니터링하고 통과합니다. DNA 추출의 대표적인 결과는 3개의 박쥐 종에서 표준 DNA 분석을 위해 표시됩니다.단일 큰 대역은 각각의 추출에서 최소한의 단편화, 그리고 유사한 크기의 DNA 조각을 나타낸다. RNA 추출을 위한 성공의 일반적인 표시기는 RNA 무결성 수, 또는 RIN입니다, 전술 RNA에 있는 높은 질을 나타내는 8 위의 값을 가진. 여기에 4개의 다른 지방에서 샘플링된 신열대 박쥐 종의 13개의 다른 조직 모형에서 RNA 추출의 RIN 값이 있습니다.안데스, 코스타리카 및 도미니카 공화국의 종에서 샘플링된 조직은 RNA 안정화 용액에 하룻밤 사이에 4도 떨어진 후 액체 질소에 직접 배치되었다. 아마존에서 종에서 샘플링 된 조직은 RNA 안정화 용액을 배치 한 후 약 1 주일 동안 액체 질소에 배치되었고, 4도에서 지속적으로 보관하였다. 이러한 경우에도 RIN 값은 RNA 안정화 용액에 즉시 배치되고 액체 질소로 직접 배치된 값과 유사했습니다.조직 배양에 따라 박쥐 세포 배양은 플레이트 표면의 80 ~90 %를 커버하고 원래 형태를 유지해야합니다. 이는 분할에 대한 최적의 단계를 나타냅니다. 6개 이상의 구절 후에, 세포는 그들의 형태가 더 크고 더 길어지기 위하여 바꾸고, 세포는 노화를 입력합니다.밝은 볼링 세포는 죽은 세포를 나타냅니다. 배양에 있는 세포는 DNA, RNA 및 단백질같이 물질의 재생 가능한 근원을 나타냅니다. 이러한 세포주는 동결 될 수 있습니다., 따라서 연구의 많은 년 동안 사용할 수 있는 자원을 제공.이것은 1 차조직을 사용하여 도전할 게놈, 전사 및 기능적인 연구 결과를 허용합니다. 예를 들어, 세포는 세포 표현형에 대한 효과를 관찰하기 위해 유전자 또는 화학적으로 변형될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

성인 쥐 심장 Myocytes의 차 문화

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

미세 구조의 분석을위한 효모 엔도 좀의 시스템 Nanogold 라벨링

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

차 소장 Organoid 문화에서 레트로 바이러스 감염의 비디오 프로토콜

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

분리 및 마우스 대동맥 내피 세포의 차 문화

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...