Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Vi takker Centro de Ecología y mangfold CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo, og Fanny Fernández Melo for å lage vev samling i Peru mulig. Vi takker også alle medlemmer av Grupo Jaragua og Yolanda León for å lage vev samling i den dominikanske republikk mulig, så vel som til Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, og alle på La Selva biological Research Station i Costa Rica, for å gjøre prøvetaking mulig. Vi takker Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe for tilgang og prøve samling av vinge slag fra Phyllostomus misfarges ball for cellekultur generasjon. Phyllostomus misfarges ball stammer fra en avl koloni i DEPARTMENT Biology II av Ludwig-Maximilians-Universitetet i München. Godkjennelse til å holde og avle ball ble utstedt av München-distriktet veterinær kontor. LMD, SJR, KTJD og LRY ble finansiert av NSF-DEB 1442142. LMD ble finansiert av NSF-DEB 1838273. LRY ble finansiert av NSF-PRFB 1812035. SCV og PD ble finansiert av en Max Planck Research Group Award, og en menneskelig grenser Science program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016). SJR, JHTP og KTJD ble finansiert av European Research Council (ERC starter Grant 310482 [EVOGENO]) tildelt SJR, ble ECT finansiert av European Research Council Grant (ERC-2012-StG311000).

Alle metoder som er beskrevet her har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Stony Brook University (protokoll #2013-2034).
1. døds aktiv
<ol><li>Fukt en bomullsdott med en isoflurane bedøvelse eller en annen tilgjengelig bedøvelse.</li>
	<li>Plasser bomulls kulen i en resealable, lufttett plastpose. Posen skal være stor nok til å holde en pose i en klut bat bag komfortabelt.</li>
	<li>Etter flere minutter med å la posen til å trenge gjennom bedøvel...

Protokollen som omtales i dette manuskriptet beskriver den beste sampling-praksisen for forskjellige molekylære analyser av høy gjennomstrømming av ball. Alle vellykkede-omics studier krever høy kvalitet vev, men prøvetaking bat vev, samt andre ikke-modell organismer, ofte oppstår i feltet forhold som ikke kan settes til samme standarder som de av en kontrollert laboratorium innstilling. Prøvetaking skjer ofte på avsidesliggende steder, med minimale ressurser, inkludert begrenset tilgang til elektrisitet og fryse...

Metoder for høy gjennomstrømming sekvensering (HTS) har raskt Avansert i effektivitet og redusert i kostnader, og det er nå mulig å skalere disse tilnærmingene til hundrevis eller tusenvis av prøvene. Innsikt innhentet av anvendelsen av disse teknologiene har enorme virkninger på tvers av flere vitenskapelige disipliner, fra biomedisin til evolusjon og økologi1,2,3. Likevel, mange HTS-programmer stole kritisk på høy kvalitet nukleinsyre syrer fra en levende kilde. Denne begrensningen vil trolig bli stadig mer problematisk med utviklingen av tredje generasjons sekvensering basert på lang-Les molekyler4. Av disse grunner er det behov for å fokusere arbeidet med å etablere beste praksis for å samle ferske vevsprøver fra ville organismer utenfor laboratoriet, noe som maksimerer nytten av materiale og reduserer antall individer som må Samlet.
Bat1K er et internasjonalt konsortium av forskere med et pågående initiativ for å sekvens de Genova av alle arter av bat til kromosom nivå montering5. Ball representerer 20% av pattedyr mangfold og har eksepsjonelle tilpasninger som har implikasjoner for å forstå aldring, sykdoms økologi, sensorisk biologi og metabolisme5,6. Mange ball er også truet eller truet på grunn av menneskelig utnyttelse7 eller er raskt fallende på grunn av patogener8,9, og Genova-nivå sekvensering er av stor betydning for bevaring av disse artene. Selv om Bat1K tiden har som mål å sekvens genomer av alle bat arter, er standardisering av samling av vevsprøver for høy kvalitet genomisk sekvensering en viktig utfordring over fellesskapet av organismal biologer. I tillegg til å genomisk data, krever funksjonell forståelse av mangfoldet av bat-tilpasninger vevs spesifikke transcriptome-og protein analyser, som ofte krever separate innsamlings protokoller. Videre, som med alle taksonomisk grupper, mens optimal vev innsamling og bevaring er avgjørende for å oppnå den høyeste kvalitetsdata for-omics analyser, kommuniserer beste praksis er ofte vanskelig på grunn av raskt skiftende teknologier og flere forskergrupper som arbeider selvstendig.
Behovet for å vedta beste praksis for bat-omics forskning er spesielt presserende, gitt at mange bat arter er sjeldne eller truet. I motsetning til andre små pattedyr som gnagere og shrews, er ball lang levetid, tilskrives eksepsjonell DNA reparasjon mekanismer10 og langsom reproduksjon11, med de fleste arter som føder bare én eller (i noen tilfeller) to unge per år. Av disse grunner, kan bat populasjoner være trege til å gjenopprette fra forstyrrelser, og samle mange individer fra naturen er verken tilrådelig eller gjennomførbart. Med andre ord, protokoller må optimaliseres for å få den maksimale mengden data for en enkelt prøve, og dermed redusere behovet for unødvendig replikere prøvetaking innsats.
Her fokuserer denne protokollen spesifikt på standardiserte metoder for innsamling og prøvetaking av bat vev for genomisk og transcriptomic sekvensering og protein analyser. Den øverste prioritet er å sikre at bat vev er samlet etisk og ansvarlig, alt fra tillatelsesprosessen for innsamling, eksport av vev til minimering av stress til dyret, og langsiktige lagringsforhold. Forseggjort dissections har blitt utviklet med sikte på å fremtids-Proofing nytten av ulike materialer samlet. Dette manuskriptet gir en steg-for-steg guide til å samle ball på en human måte som er ment å minimere innvirkning på populasjoner og maksimere vitenskapelig verdi. Mens fokus for denne protokollen er spesielt for bruk i ball, mange av trinnene er relevante for andre virveldyr dyr, spesielt pattedyr.
Oversikt over vevs innkreving Prosedyren for vev samling, inkludert temperaturen for lagring og valg av bevare agent, vil bli bestemt av arten av eventuelle nedstrøms analyser planlagt. Men, det anbefales sterkt at, når det er mulig, er vev samlet under en rekke metoder for å maksimere sin fremtidige nytte selv om ingen spesifikk analyse er planlagt. Generelt er vev samlet og bevart for senere analyser av enten nukleinsyre syrer (DNA og RNA), eller protein. For hver av disse programmene, kan vevet bli optimalt bevart ved direkte blits frysing i flytende nitrogen (LN2). Men umiddelbar nedsenking i LN2 er ikke alltid mulig i feltet. Etter hvert som teknologien utvikler seg, blir ressurser som spesialiserte hetteglass for å lagre DNA og RNA ved omgivelsestemperaturer lettere tilgjengelige. Selv om vi ikke har validert alle slike materialer i denne protokollen, oppfordrer vi andre forskere til å forholdsvis analysere resultatene av nye materialer i forhold til det vi presenterer her. Vi gir metoder for å ideelt bevare vev for ulike applikasjoner i situasjoner der LN2 ikke kan nås, for eksempel når LN2 transport er ikke mulig på grunn av tilgang til nettstedet via lite fly i Amazonas. I tillegg gir vi en metode for å samle vev som levende celler kan dyrkes og spres. Nedenfor skisserer vi viktige hensyn for innsamling av materiale for hver av disse respektive formål og en oversikt over innsamlings metoder er gitt i tabell 1.
Vev for DNA For alle høstet vev samlet, vil lagringsmediet avgjøre om det kan brukes til enten standard eller høy molekylvekt (HMW) DNA-ekstraksjon. HMW er nødvendig for lang lese sekvenser og for tiden kreves for å generere kromosom nivå Genova samlinger, eller en "platina standard" Genova. Lav molekylvekt (LMW) DNA kan utvinnes fra Flash frosset, AllProtect (heretter referert til som "vev stabilisere løsning"), eller til og med RNAlater (heretter "RNA stabilisere løsning")-bevarte prøver (selv om Flash frosne prøvene forbli optimal ). DNA isolert av standard laboratorie metoder (f. eks silica gel membran spin kolonner, fenol-kloroform), kan fortsatt gi DNA-fragmenter på opptil ~ 20 kilobases (KB). Derfor forutsatt at det er tilstrekkelig utbytte, kan denne formen for isolert DNA brukes til enkelt sette størrelse bibliotek forberedelse, der innsatsen størrelsen er ofte ~ 500 base-par (BP), og kort sekvens leser av ~ 100 BP er generert12. Dette DNA er spesielt nyttig for "resequencing" prosjekter eller studier der full lengde kromosom data er ikke nødvendig. HMW DNA (10-150 kB) er mer utfordrende og kan bare bli pålitelig innhentet ved hjelp av vev som har blitt raskt blinke frosset i LN2 etter innhøsting og opprettholdt på maksimalt-80 ° c til ekstraksjon.
Lav molekylvekt eller fragmentert DNA er ofte tilstrekkelig for målrettede tilnærminger, inkludert gen forsterkning via PCR og kortleser sekvenser13. PCR-baserte undersøkelser ved hjelp av LMW DNA som mål bare én eller noen få gener har vært svært informativ i forståelsen tilpasning og molekylær evolusjon av bat sensorisk biologi6,14, fysiologi15, phylogenetics 5,16og bevaring17,18. Vellykket målrettet sekvens gjenerobre av lav molekylvekt og fragmentert DNA har også blitt demonstrert for mange virveldyr grupper, inkludert ball19. Disse metodene er ofte kostnadseffektive og minimalt invasiv til bat, som avføringsprøver og ikke-dødelige vev prøvetaking via bukkal pensle eller vinge biopsi slag er også vanlige måter å få DNA for lav molekylvekt analyser20, 21i denne.
Imidlertid avhenger kvaliteten sterkt på hvilken type medier der prøven er lagret22. Etter systematisk og kvantitativ sammenligninger av bukkal servietter og biopsi slag, har vinge biopsi slag vist å gi gjennomgående høyere nivåer av DNA og var mindre stressende til balltre under samlingen22. Disse sammenligningene viste også at de beste resultatene ble oppnådd når vingen punch ble bevart i indikator silika (dvs. en type tørkemiddel laget av silika gel perler som skifter farge når fuktighet er observert) i stedet for i andre populære lagringsmedier som etanol eller DMSO22; Selv om andre lagringsmedier, inkludert vevs stabiliserings løsning, ikke ble undersøkt. Vinge slag kan også brukes til å dyrke Fibroblast celler i kulturen, slik som i Kacprzyk et al.23 og som beskrevet nedenfor (se pkt. 6). For disse metodene bør vingen eller uropatagium utvides forsiktig, og en ren biopsi punch, vanligvis 3 mm i diameter, bør brukes til å få prøven. Denne tilnærmingen ser ut til å forårsake ingen varig skade, med arr healing over i løpet av uker i de fleste tilfeller24.
HMW DNA (10-150 kB) er mer utfordrende og er foreløpig bare pålitelig innhentet ved hjelp av vev som har vært raskt blinke frosset i LN2 etter innhøsting og opprettholdt på maksimalt-80 ° c til ekstraksjon. HMW DNA (10-150 kB) er avgjørende for lang-lese DNA sekvensering og derfor for de Novo Genova montering. Faktisk, mens de fleste kommersielle kits kan brukes til å isolere noen standard HMW DNA, den resulterende molekylet størrelser ofte ikke oppfyller kravene i tredje generasjons sekvensering teknologier [f. eks de lansert av selskaper som Pacific biovitenskap (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, og 10x Genomics, eller gjennom montering metoder som tilbys av Bionano Genomics eller Svalehale Genomics]. Som sådan, det er en ny etterspørsel etter "Ultra HMW" DNA (> 150 kB). Når oppnå ultra HMW DNA fra ball, friske prøver av leveren, hjernen, eller muskelen er alle egnet, men disse må umiddelbart blinke frosset i LN2 uten lagrings buffer eller kryoprotektant. En fullstendig beskrivelse av disse trinnene er utenfor omfanget av dette papiret, men er tilgjengelig andre steder25.
Vev for RNA RNA er en enkelt-strandet molekyl som er mindre stabilt enn DNA. Selv om det er mange former for RNA,-omics analyser har en tendens til å fokusere på mRNA (Messenger RNA) og små RNAs (f. eks, microRNAs). Etter transkripsjon, er mRNA skjøtes å danne en moden transkripsjon som inneholder ingen introns og representerer koding del av gener/genomer. Coding gener utgjør en liten brøkdel av Genova størrelse (1%-2%), noe som gjør målretting mRNA en kostnadseffektiv måte å skaffe sekvens data for gener. MicroRNAs er en klasse av RNAs som regulerer prosessen med oversettelse av mRNA til proteiner og er således viktige regulatoriske effekt Orer. RNA-transkripsjoner kan være sekvensielt individuelt, eller mer vanlig for-omics analyser26,27,28,29,30, som en del av en transcriptome; det vil si summen av alle RNA-transkripsjoner som finnes i et gitt utvalg.
Sekvensering kan utføres følgende flere metoder (dvs. via Short-Les RNA-SEQ eller lang-lese hele isoformen SEQ), slik at analyse av både RNA overflod og isoformen bruk. Ettersom mengden og mangfoldet av mRNA transkripsjoner varierer mellom celler og vev, gjør RNA sekvensering det mulig å studere og sammenligne genuttrykk og regulering på tvers av prøvene. Interessen for sekvensering små RNAs og hele isoformen sekvensering vokser, da disse metodene blir stadig mer biologisk informative. Utarbeidelse av vevsprøver for å sekvens forskjellige klasser av RNA kan utføres på samme måte som presentert i dette manuskriptet, med bare de påfølgende utvinnings metodene ulik31,32. Til slutt, fordi transcriptomes tilbyr en høy dekning undergruppe av protein-koding Genova, det sammensatte datasettet kan være nyttig i Genova montering og merknader, noe som gjør innsamling av RNA-SEQ data på tvers av en rekke ulike vev en viktig del av Bat1K initiativ.
I motsetning til DNA, er RNA kjemisk ustabil og også målrettet av RNase-enzymer, som er overalt til stede i vev lysater som en defensiv strategi mot RNA-baserte virus. Av disse grunner begynner RNA-fraksjonen i celler og vev å brytes ned kort tid etter det punktet av prøvetaking og/eller døds aktiv. Å bevare RNA-en krever derfor trinn for å hindre nedbrytning. Dette innebærer vanligvis å bevare ferskt samlet vev ved 4 ° c i et stabiliserende middel som RNA stabiliserende løsning for å deaktivere RNases naturlig tilstede i vev, etterfulgt av frysing for lengre tids lagring. Som et foretrukket alternativ, kan vevet blinke frosset i LN2; men som nevnt ovenfor, transport LN2 inn i feltet og opprettholde nivåer for å hindre at vevet tine kan være logistisk utfordrende.
Vev for protein Protein sammensetning og relativ overflod varierer mellom celler og vev på en lignende måte som det som ble diskutert for RNA; men proteiner er i gjennomsnitt mer stabile enn RNA. Protein identifisering bruker Proteomikk vanligvis samsvarer med en brøkdel av, og ikke hele, protein sekvensen, men det kan gi informasjon om uttrykk på tvers av vev og karakterisere patogener stede. Så mange protein sekvenser er bevart på tvers av pattedyr, kan bat prøver for Proteomikk lett bli forurenset med bevarte menneskelige proteiner, krever sterile protokoller (f. eks, hansker, tang) under innsamling. Mens Flash-frysing i LN2 er den beste måten å hindre degradering av proteiner, bruk av tørr is,-20 ° c frysere, og selv isen er egnet hvis det ikke er andre midler. Ettersom temperaturene øker, stiger også risikoen for differensial protein sammenbrudd. Stabiliserende midler som vev stabilisering løsning er effektive i å bevare protein brøkdel av vev ved romtemperatur og er egnet for kortsiktig bevaring (opptil en uke) når Flash-frysing er ikke levedyktig.
Enzymatisk profil av et gitt vev direkte påvirker bevaring av protein deri. Vev med lav enzymatisk aktivitet som muskel kan bevare protein profiler selv ved høyere temperaturer i en husholdning fryser. Til sammenligning er leveren vev enzymatisk reaktive, og dens proteiner har høyere sannsynlighet for nedverdigende under forberedelse. Det økende antallet protokoller for innhenting av menneskelige Proteomikk profiler fra formalin para fin-innebygde (FFPE) prøver tyder på at paraformaldehyde innfesting av vev holder løftet om rimelig protein bevaring når frysing ved oppsamling ikke er gjennomførbart33,34. Selv om det er svært avhengig av bevaring tid og tilstand, har proteiner blitt identifisert via immunhistokjemi fra formalin-faste, etanol-bevarte bat eksemplarer35. Denne tilnærmingen er ikke skalerbar til Proteomikk-nivå prøvetaking, men fremhever potensialet for formalin-fast bat vev å gi protein profiler når Flash-frysing er utilgjengelig og andre stabiliserende agenter er for kostbare.
Vev for cellekultur Prøvetaking vev og Flash-frysing tilbyr en begrenset mengde materiale som skal brukes, og når materialet er brukt, er det ikke lenger tilgjengelig. Alternativt, cellen kulturen skaffe bo celler det kan med det samme anvendt eller bevart for fremtid studier. Kulturer også lette utvidelse av celler for å øke utbyttet når vevsprøver er små. Det er spesielt nyttig i tilfeller der vev samling er begrenset, for eksempel eksperimenter med sjeldne arter der ikke-dødelige prøvetaking er viktig og derfor har bred implikasjoner for bevaring. Beskrevet er en protokoll der cellekultur er mulig via ikke-dødelige prøvetaking av vinge membran vev, men dyrking er mulig med flere vevstyper36,37. Protokollen som er angitt her, velger for tilhenger celler. Kombinasjonen av kilde vev og vekst medier som brukes gjør denne protokollen egnet til å velge og vokse fibroblaster, men hvis ønskelig, kan alternative protokoller brukes til å velge for andre celletyper. I sammenheng med Bat1K prosjektet, er det spådd at for sjeldne og truede arter, ikke-dødelige prøvetaking av vinge membraner og utvidelse av prøvene via dyrking er avgjørende for å generere volumet av DNA som trengs for flere teknologier ansatt5 .
Bat-opptak Alle mennesker håndtering av ball bør trenes av en bat-kompetent forsker og vaksinert mot rabies med en rekke pre-eksponering injeksjoner. Hvis bitt, en ytterligere serie av post-eksponering injeksjoner er fortsatt nødvendig. Standard metoder for å fange opp ball inkluderer tåke garn (figur 1) og harpe feller (figur 2). Mist garn er mest brukt og ideelt for områder med lav til moderat aktivitet, som de krever mest forsiktighet for å minimere bat nød. Små ball er spesielt sårbare og kan dø av stress hvis ikke en tendens til å raskt. Hyppige netto inspeksjoner minimerer bat skader og dødelighet, samt skade på tåke nettet. Denne detaljen er viktig fordi riktig vev samlingen krever vevet å være frisk, og uriktig oppmerksomhet til tåke garn i ball kan føre til unødvendig dødelighet eller tidlig dødelighet før forskeren kan riktig prosess prøver. Fordi flere ball kan hvile i en harpe felle med minimal nød, er denne tilnærmingen ideell for områder med høy bat aktivitet, for eksempel i nærheten av en hule eller store hønsehus. Detaljerte instruksjoner for riktig bat fangst og databehandling for innsamling av morfologiske og demografisk informasjon er tilgjengelig i supplerende metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

Som høy gjennomstrømming sekvensering teknologier forhånd, standardiserte metoder for høy kvalitet vev oppkjøp og bevaring tillate forlengelse av disse metodene til ikke-modell organismer. En rekke protokoller for å optimalisere vev samling fra ball er utviklet for en rekke høy gjennomstrømming sekvensering tilnærminger. Skissert her er protokoller for fangst av ball, ønsket demografi skal samles for hver bat, og optimaliserte metoder for å minimere stress på en bat under vev samling. Spesielt skissert er metoder for innsamling og behandling av vev for å oppnå (i) DNA for høy molekylvekt genomisk analyser, (II) RNA for vevs spesifikke transcriptomes, og (III) proteiner for Proteomikk-analyser. Til slutt, også skissert er en metode for å unngå dødelige prøvetaking ved å skape levedyktig primær cellekulturer fra vingen klipp. En sentral motivasjon av disse metodene er å maksimere mengden av potensielle molekylære og morfologiske data for hver bat og foreslå optimale måter å bevare vev slik at de beholder sin verdi som nye metoder utvikles i fremtiden. Dette standardisering har blitt spesielt viktig som initiativer for å sekvens kromosom nivå, feilfri genomer av arter over hele verden har dukket opp, der flere vitenskapelige partier er spissen sekvensering av ulike taksonomisk Grupper. Protokollene skissert her definerer den ideelle vev innsamling og vev bevaring metoder for Bat1K, konsortiet som er sekvensering av genomer av alle arter av bat.

Dna For standard lav molekylvekt (LMW) analyser, ble DNA Hentet fra tre Neotropical bat arter. Vevsprøver ble samlet inn i feltet fra den dominikanske republikk og Costa Rica, etter protokollene beskrevet i dette papiret. Etter disseksjon, ble små biter (< 0,5 cm i den tynneste delen) av blandet vev (hjerne, lever og tarm) plassert i RNA stabiliserings løsning, blits frosset, deretter lagret ved-80 ° c. Utdrag ble utført ved hjelp av standard DNA utvinnings protok...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Dette er en protokoll for optimal vev forberedelse for genomisk, transcriptomic, og Proteomikk analyser av ball fanget i naturen. Det inkluderer protokoller for bat fangst og disseksjon, vev bevaring, og celle dyrking av bat vev.

Tissue innsamling av ball for-omics analyser og primær Cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

I denne videoen gir vi en trinnvis veiledning for å samle på en human måte, ment å minimere innvirkning på populasjoner og maksimere vitenskapelig verdi. Fordelene med vår tilnærming er at vi maksimerer mengden potensielle molekylære og morfologiske data for hver, bevare vev for å beholde sin fremtidige verdi, og minimere høsting ville individer. Disseksjonsprotokoller er vanskelige å demonstrere verbalt.Mange av vevsforberedelsesteknikkene vi presenterer her kommuniseres best gjennom å visualisere hvordan forskjellige organer identifiseres, og deretter riktig dissekert og lagres. Forbered alle hetteglass før du starter disseksjoner for å unngå forsinkelser. For RNA, sett til side antall hetteglass som trengs for hver prøve.Merk hvert rør med vevstypen som skal samles inn, samt standard informasjon om identifisering av prøver. Fyll hetteglassene 50% full av RNA stabiliserende løsning, og chill til fire grader celsius. Vær forsiktig så du ikke fyller hetteglassene helt med RNA-stabiliseringsløsning, da røret kan eksplodere når det plasseres i flytende nitrogen.Umiddelbart etter eutanasi, utføre halshugging av prøven som beskrevet i tekstprotokollen. Skin skallen fra håret, fascia, og skallen muskler, inkludert huden på nesen. Vær forsiktig så du ikke brekker nesens fremre ende.Fjern øynene med tang, ved hjelp av sterk nok kraft til å løsne optisk nerve. Plasser øynene i et to milliliter hetteglass med RNA stabiliserende løsning. Bruk saks for å lage en sagittal kutt på den dorsale delen av skallen som starter på nakken, pass på ikke å skade hjernen.Deretter bruker du tang til å forsiktig trekke tilbake begge sider av skallen, til den er sprukket åpen for å avsløre hjernen. Sørg for at skallen på kranialenden er fjernet, slik at tang lett kan skrape bort hjernen. Skrap forsiktig hjernen med tang.Hjernen vil være veldig myk. Den olfaktoriske pæren vil bli synlig, sitter ved ventraldelen av det indre av skallen. Prøv å holde olfaktorisk pære festet.Hvis mulig, hold hjerneformen intakt, og legg den umiddelbart på tørris, eller i et fem milliliter hetteglass med RNA stabiliserende løsning. På den kaudale enden av skallen skal cochlei nå være sideveis synlig på hver side av hodet. Bruk tang til å trekke cochlei forsiktig.Deretter legger du dem i ett to milliliter hetteglass med RNA-stabiliserende løsning. Lag to snitt der topp og bunn kjeve sammenføyning, og fjerne mandible. Cribriform platen vil bli tydelig.Dette er et kritisk bein for å holde forskeren orientert. Det kan identifiseres som den mest fremre regionen av skallen, med flere foramen, og med to spor hvor olfactory pære hviler. Når mandible er fjernet, fjern rostrum fra den gjenværende delen av skallen.Kontroller at kjeven inneholder cribriformplaten. Plasser nesen i RNA stabiliserende løsning, og lagre på fire grader celsius over natten. Fra den nedre mandible, kutt tungen med saks, og legg i et to milliliter hetteglass med RNA stabiliserende løsning.Legg nesehettealet i flytende nitrogen etter natten suge i RNA stabiliserende løsning. Etter 24 timer med bløtlegging på is, eller i kjøleskapet, legg prøvene i flytende nitrogen. Bruk en skalpell til å pierce gjennom bukhulen, noe som gjør et langsgående snitt opp til ribbeina.Dette mister skjelettrammen. Strip huden for å avsløre pectoral muskelen, og ta minst to prøver av muskel. Vev for både RNA og DNA samles inn under disseksjonene.Plasser vev for høymolekylært DNA i tørre kryovialer, og flash fryse i flytende nitrogen. Plasser vev for RNA i RNA stabiliserende løsning. Skjær gjennom brystbenet, og trekk bort ribbeina.Hent lungen og hjertet. Bruk skalpell og tang for å skille hjertet fra lungene. Bruk en skalpell til å bryte opp lungene, og plasser i RNA stabiliserende løsning.Samle hjertet, som kan tas hele, men bør seksjoneres i halvdeler, slik at RNA stabiliserende løsning soaks grundig. Ta prøver fra leveren. Ta minst to prøver av lever.Plasser en prøve i et hetteglass for å forbli frosset for høymolekylært DNA, og plasser den andre prøven i RNA-stabiliseringsløsning. Følg leverkanalen for å finne bukspyttkjertelen og galleblæren. Overfør galleblæren til et hetteglass med RNA stabiliserende løsning.Finn magen, og fjærlignende milt på basen, som vises som en annen nyanse av lilla. Bukspyttkjertelen bør også være synlig her som en vektstruktur. Samle magen, milten og bukspyttkjertelen, i respektive hetteglass med RNA stabiliserende løsning.Samle små prøver av tynn og tykktarmen. Plasser i respektive hetteglass med RNA-stabiliseringsløsning. Ta en av nyrene, og følg kanalene til blæren, og plasser deretter i respektive hetteglass med RNA-stabiliserende løsning.Bruk den andre nyren som en guide for å finne testiklene hvis hann, livmor og eggstokker hvis hunn. Samle en eller begge gonads hvis mulig. Ta også prøver av ulike deler av vingens hud, og hold i separate hetteglass.Den største fordelen med vår tilnærming er at det tillater oss å prøve dyr på en ikke-dødelig måte, samtidig som vi genererer nok materiale til genomiske studier, samt funksjonelle molekylære studier. Vår protokoll tillater fremstilling av primære fibroblaster fra vingevev. Cellene representerer en verdifull fornybar kilde til genetisk materiale, samt en modell for funksjonelle og molekylære utforskninger i.Vingeklipp som er bevart i vekstmedier i henhold til avsnitt seks i den skriftlige protokollen, bør overføres til vevskulturanlegget. Overfør innholdet i røret til et konisk sentrifugerør på 15 milliliter. Vingemembranbiopsien brukes til denne demonstrasjonen.Fjern forsiktig vekstmediet. Vask biopsien forsiktig to ganger med 500 mikroliter steril PBS. Tilsett 500 mikroliter på ett mg per milliliter kollagenase fire til røret.Dette vil føre til fordøyelse av vevet i individuelle celler. Inkuber over natten ved 37 grader celsius uten agitasjon. På dag to, lage en frisk vekst medium, og prewarm det til 37 grader celsius.Forbered en seks brønnvevskulturplate ved å legge til to milliliter med friskt forutvarmet vekstmedium i hver brønn av platen som skal brukes. Oppbevar denne platen i en 37 grader celsius og 5% karbondioksid inkubator til det trengs. Fjern 15 milliliter røret som inneholder cellene fra inkubatoren, og slukke fordøyelsesreaksjonen ved å legge til en milliliter frisk vekstmedium.Resuspend cellene ved å forsiktig triturating løsningen med en P1000 pipette tips for å oppnå en enkelt celle suspensjon. Snurr forsiktig ned cellene i en bordplate sentrifuge i tre minutter ved 300 ganger G.Kast supernatanten ved å forsiktig fjerne 80 til 90% av væsken med en P1000 pipette. Resuspend pellet i 500 mikroliter av prewarmed vekst medium.Triturate suspensjonen forsiktig for å sikre at pelleten ikke lenger er synlig, og at cellene er tilstrekkelig suspendert, og sørg for å unngå små biter av vev som fortsatt kan være synlige på veggene. Pipette forsiktig hele volumet av cellesuspensjon i en enkelt brønn av de seks brønnplatene som ble forberedt tidligere, som inneholder de førkrigsbelagte vekstmediene. Rock platen forsiktig fra side til side og foran til bak to til tre ganger for å hjelpe celler fordele over brønnoverflaten i ett enkelt lag.Kontroller de belagte cellene under et mikroskop. De bør være enkeltceller som vises balled opp og flytende, men veldig tett. Plasser platen forsiktig i en inkubator forhåndsinnstilling til 37 grader celsius og 5% karbondioksid.Etter ca. 24 timer, observere cellene under mikroskopet for å bestemme helsen til kulturen. Celler skal nå festes til plateoverflaten, og vises flatt. Oppretthold cellene i en fuktet inkubator forhåndsinnstilling til 37 grader celsius og 5%karbondioksid.Celler bør observeres under mikroskopet regelmessig for å bestemme behovet for medieoppdatering eller splitting. Når det er nødvendig, aspirer forsiktig ca 50% av mediet fra brønnen, og legg forsiktig til en milliliter førkrigsvekstmedium til siden av brønnen, for ikke å forstyrre cellene. Når det er nødvendig å passere cellene, aspirerer du forsiktig ca 90% av vekstmediet.Vask cellene veldig forsiktig ved å legge til en milliliter steril PBS til veggen av brønnen, for ikke å forstyrre cellene. Klipp platen forsiktig frem og tilbake og side til side to til tre ganger. Aspirer forsiktig alle PBS fra platen før du vasker cellene igjen.Tilsett trypsin EDTA til brønnen, og forsiktig rock platen for å dekke hele overflaten av brønnen med trypsin EDTA, og inkubere i ett og et halvt minutt ved romtemperatur. Slukke reaksjonen ved å legge til en milliliter frisk prewarmed vekst medium. Pipetten opp og ned omtrent fem ganger for å vaske cellene fra overflaten av platen, og sikre at cellene er i suspensjon.Plasser cellefjæringen i et 15 milliliter rør, og spinn ned cellene i en bordplate sentrifuge i tre minutter ved 300 ganger G.Kast supernatanten ved å forsiktig fjerne 80 til 90 prosent av væsken med en P1000 pipette. Resuspend pellet i en milliliter av prewarmed vekst medium, og forsiktig triturate suspensjon. Kontroller at pellet eller store fragmenter av pellet er ikke lenger synlig, og cellene er i en enkelt celle suspensjon.For å telle cellen ved hjelp av en automatisert celleteller, bland en ti mikroliter aliquot av de suspenderte cellene en til en med trypan blå for å oppdage levedyktige celler. Inkuber i ett minutt, og pipette 10 mikroliter av løsningen på tellelysbildet. Sett inn tellelysbildet i en automatisert celleteller for å telle cellene ved hjelp av de riktige innstillingene.Forbered frysemedier ved å kombinere vekstmedium med DMSO for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10% DMSO. Pelleten skal tilberedes fra en 80 til 90% samløpet brønn av en seks brønnplate. Resuspend pellet i en og en halv milliliter frysing medium.Plasser ca. 750 mikroliter cellefjæring i hver av to separate kryovialer. Plasser hetteglassene i en kryogen frysebeholder, slik at cellene fryser sakte for å opprettholde celle vitalitet. Plasser dem umiddelbart på minus 80 grader celsius.For å tine de frosne cellene, lag en seks brønnplate som inneholder to milliliter med forvarmet vekstmedium i hver brønn som skal brukes. Hold platen i 37 grader celsius og 5% karbondioksid inkubator til nødvendig. Ta ett hetteglass med celler fra flytende nitrogen, og legg det i et varmt vannbad for raskt å tine cellene.Dette bør ta to til tre minutter. Så snart oppløsningen i hetteglasset har tint, pipette forsiktig opp og ned for å homogenisere løsningen, og legg umiddelbart hele løsningen i en brønn av de seks brønnplatene. Rock platen forsiktig fra side til side og foran til bak to til tre ganger for å hjelpe celler fordele over brønnoverflaten i ett enkelt lag.Plasser cellene i inkubatoren ved 37 grader celsius og fem prosent karbondioksid i 24 til 48 timer. Overvåk ogpass cellene som vist. Representative resultater av DNA-ekstraksjoner er vist for standard DNA-analyser fra tre flaggermusarter.Et enkelt stort bånd indikerer minimal fragmentering, og lignende størrelse fragmenter av DNA fra hver respektive utvinning. En vanlig indikator på suksess for RNA-ekstraksjoner er RNA-integritetsnummeret, eller RIN, med verdier over åtte som representerer høy kvalitet i takt RNA. Vist her er RIN-verdier av RNA-ekstraksjoner fra 13 forskjellige vevstyper av neotropiske flaggermusarter, samplet på fire forskjellige lokaliteter.Vev samplet fra arter i Andesfjellene, Costa Rica, og Den dominikanske republikk ble plassert direkte i flytende nitrogen etter soaking i RNA stabiliserende løsning på fire grader celsius over natten. Vev samplet fra arter i Amazonas ble plassert i flytende nitrogen omtrent en uke etter å ha plassert en RNA stabiliserende løsning, og holdt på fire grader celsius kontinuerlig. Selv i slike tilfeller var RIN-verdiene sammenlignbare med de som umiddelbart ble plassert i RNA-stabiliseringsløsning, og direkte i flytende nitrogen.Etter vevskultur bør flaggermuscellekulturer dekke 80 til 90% av plateoverflaten, og opprettholde sin opprinnelige morfologi. Dette representerer den optimale fasen for splitting. Etter mer enn seks passasjer, celler vil endre sin morfologi til å bli større og lengre, og cellene vil gå inn senescence.Lyse balled opp celler representerer døde celler. Celler i kultur representerer en fornybar kilde til materiale, som DNA, RNA og protein. Disse cellelinjene kan fryses, og dermed gi en ressurs som kan brukes over mange års forskning.Dette tillater genomiske, transkripsjonsmiske og funksjonelle studier som vil være utfordrende ved hjelp av primærvev. For eksempel kan celler endres genetisk eller kjemisk for å observere effekter på cellulære fenotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Merking av gjær endosomal System for Ultrastructural Analyser

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen av retroviral infeksjon i Primær Intestinal Organoid Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Forbedret Swiss-rullende teknikk for tarmvevet Forberedelse til Immunhistokjemisk og Immunofluorescent Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...