Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Vi tackar Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo och Fanny Fernández Melo för att göra vävnad samling i Peru möjlighet. Vi tackar också alla medlemmar i Grupo Jaragua och Yolanda León för att göra vävnads insamling i Dominikanska republiken möjligt, liksom till Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, och alla på La Selva biologiska forsknings station i Costa Rica, för att göra provtagning möjlig. Vi tackar Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe för tillgång och provinsamling av Wing stansar från Phyllostomus missfärgar fladdermöss för cellkultur generation. Phyllostomus missfärgar fladdermöss påbörjade från en Avelkoloni i avdelning bio Logi II av Ludwig-Maximilians-universitetar i Munich. Godkännande för att behålla och föda upp fladdermöss utfärdades av München District Veterinary Office. LMD, SJR, KTJD och LRY finansierades av NSF-DEB 1442142. LMD finansierades av NSF-DEB 1838273. LRY finansierades av NSF-PRFB 1812035. SCV och PD finansierades av en Max Planck Research Group Award, och ett Human Frontiers Science program (HFSP) forskningsbidrag (RGP0058/2016). SJR, JHTP och KTJD finansierades av Europeiska forskningsrådet (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) som tilldelades SJR, ECT finansierades genom Europeiska forskningsrådets bidrag (ERC-2012-StG311000).

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Stony Brook University (protokoll #2013-2034).
1. dödshjälp
<ol><li>Fukta en bomullstuss med en isofluran bedövningsmedel eller annan tillgänglig bedövningsmedel.</li>
	<li>Placera bomullstuss i en återförslutningsbar, lufttät plastpåse. Påsen bör vara tillräckligt stor för att hålla en påse i en trasa bat väska bekvämt.</li>
	<li>Efter flera minuter att låta...

Det protokoll som diskuteras i detta manuskript beskriver de bästa provtagningsmetoderna för olika molekylära analyser av fladdermöss med hög kapacitet. Alla lyckade omics-studier kräver vävnad av hög kvalitet, men provtagning av fladdermusvävnad, liksom andra icke-modellorganismer, förekommer ofta i fältförhållanden som inte kan ställas in på samma standarder som för kontrollerade laboratoriemiljöer. Provtagning sker ofta på avlägsna platser, med minimala resurser, inklusive begränsad tillgång till ...

Hög dataflöde sekvensering (HTS) metoder har snabbt avancerade i effektivitet och minskade i kostnad, och det är nu möjligt att skala dessa metoder till hundratals eller tusentals exempel. Insikter erhållna genom tillämpning av dessa tekniker har enorma effekter över flera vetenskapliga discipliner, från biomedicin till evolution och ekologi1,2,3. Men många HTS applikationer förlitar sig kritiskt på hög kvalitet nukleinsyror från en levande källa. Denna begränsning kommer sannolikt att bli alltmer problematiskt med utvecklingen av tredje generationens sekvensering baserad på långlästa molekyler4. Av dessa skäl finns det ett behov av att inrikta insatserna på att fastställa bästa praxis för insamling av färska vävnadsprover från vilda organismer utanför laboratoriet, vilket maximerar nyttan av materialet och minskar antalet individer som behöver Samlas in.
Bat1K är ett internationellt konsortium av forskare med ett pågående initiativ för att sekvensera genomet av varje art av fladdermus till kromosomnivå församling5. Fladdermöss representerar 20% av däggdjurs mångfalden och har exceptionella anpassningar som har betydelse för förståelsen av åldrande, sjukdoms ekologi, sensorisk biologi och metabolism5,6. Många fladdermöss är också hotade eller hotade på grund av mänsklig exploatering7 eller snabbt minskar på grund av patogener8,9, och genom-nivå sekvensering är av stor betydelse för bevarandet av dessa arter. Även om Bat1K för närvarande syftar till att sekvensera arvsmassan hos alla fladdermöss, är standardiseringen av insamling av vävnadsprover för högkvalitativ genomisk sekvensering fortfarande en central utmaning i hela gemenskapen av organismers biologer. Förutom genomiska data kräver funktionell förståelse av mångfalden av BAT-anpassningar vävnadsspecifika transkriptome-och protein analyser, som ofta kräver separata insamlings protokoll. Dessutom, liksom för alla taxonomiska grupper, samtidigt som optimal vävnads insamling och bevarande är avgörande för att erhålla data av högsta kvalitet för-omics-analyser, är det ofta svårt att kommunicera bästa praxis på grund av snabbt föränderliga teknologier och flera forskargrupper som arbetar självständigt.
Behovet av att anta bästa praxis för forskning om BAT-omics är särskilt brådskande med tanke på att många fladdermusarter är sällsynta eller hotade. Till skillnad från andra små däggdjur som gnagare och nävar, fladdermöss är långlivade, som hänför sig till exceptionella mekanismer DNA-reparation10 och långsam reproduktion11, med de flesta arter som föder bara en eller (i några fall) två unga per år. Av dessa skäl, fladdermöss populationer kan vara långsam att återhämta sig från störningar, och samla in många individer från naturen är varken tillrådligt eller genomförbart. Med andra ord måste protokollen optimeras för att erhålla den maximala mängden data för ett enda prov, vilket minskar behovet av att i onödan replikera provtagnings insatserna.
Här fokuserar detta protokoll specifikt på standardiserade metoder för insamling och provtagning av BAT-vävnad för genomisk och transkriptomisk sekvensering och protein analyser. Dess högsta prioritet är att se till att bat-vävnaderna samlas in på ett etiskt och ansvarsfullt sätt, alltifrån tillståndsprocessen för insamling, export av vävnader till minimering av stress till djuret och långtidslagring. Utarbetade dissektioner har utvecklats i syfte att framtidssäkra nyttan av olika material som samlats in. Detta manuskript ger en steg-för-steg-guide för att samla fladdermöss på ett humant sätt som är avsett att minimera påverkan på populationer och maximera vetenskapligt värde. Medan fokus för detta protokoll är specifikt för användning i fladdermöss, är många av stegen relevanta för andra arter av ryggradsdjur, särskilt däggdjur.
Översikt över vävnads insamling Förfarandet för insamling av vävnader, inklusive temperaturen för lagring och valet av konserveringsmedel, kommer att bestämmas av arten av de planerade analyser som planeras i efterföljande led. Det rekommenderas dock starkt att, när det är möjligt, vävnad samlas in under en rad metoder för att maximera dess framtida nytta även om ingen specifik analys planeras. I allmänhet, vävnad samlas in och bevaras för efterföljande analyser av antingen nukleinsyror (DNA och RNA), eller protein. För vart och ett av dessa tillämpningar kan vävnaden bevaras optimalt genom direkt blixt nedfrysning i flytande kväve (LN2). Dock är omedelbar nedsänkning i LN2 inte alltid möjligt på fältet. Som teknik framsteg, resurser såsom specialiserade flaskor för att lagra DNA och RNA vid omgivningstemperaturer blir mer lättillgängliga. Även om vi inte har validerat alla sådana material i detta protokoll, uppmuntrar vi andra forskare att jämförelsevis analysera resultatet av nya material i förhållande till vad vi presenterar här. Vi tillhandahåller metoder för att helst bevara vävnad för olika tillämpningar i situationer där LN2 inte kan nås, till exempel när LN2 transport inte är möjlig på grund av platsåtkomst via litet flygplan i Amazonas. Dessutom tillhandahåller vi en metod för att samla in vävnad från vilka levande celler kan odlas och spridas. Nedan beskriver vi viktiga överväganden för insamling av material för vart och ett av dessa respektive ändamål och en översikt över insamlingsmetoder ges i tabell 1.
Vävnad för DNA För all skördad vävnad som samlats in, kommer lagringsmediet avgöra om det kan användas för antingen standard eller hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion. HMW krävs för lång läsning sekvensering och för närvarande krävs för att generera kromosomnivå arvsmassa sammansättningar, eller en "Platinum standard" genomet. Låg molekylvikt (LMW) DNA kan extraheras från Flash fryst, AllProtect (hädanefter kallad "Tissue stabiliserande lösning"), eller till och med RNAlater (hädanefter "RNA stabiliserande lösning")-konserverade prover (även om Flash frysta prover förblir optimala ). DNA som isolerats av standardiserade laboratoriemetoder (t. ex. kiselgel membran spinn pelare, fenol-kloroform) kan fortfarande ge DNA-fragment på upp till ~ 20 kilobaser (KB). Därför, förutsatt att det finns tillräcklig avkastning, denna form av isolerade DNA kan användas för enstaka skär storlek bibliotek förberedelse, där insatsen storlek är ofta ~ 500 Base-par (BP), och kort sekvens läsningar av ~ 100 BP genereras12. Detta DNA är särskilt användbart för "resekvensering" projekt eller studier där fullängds kromosomala data inte krävs. HMW DNA (10-150 kB) är mer utmanande och kan endast fås på ett tillförlitligt sätt med hjälp av vävnad som snabbt har Blixts fryst i LN2 efter skörd och underhålls vid ett maximum av-80 ° c till extraktion.
Låg molekylvikt eller fragmenterat DNA är ofta tillräckligt för riktade metoder, inklusive genamplifiering via PCR och kortläst sekvensering13. PCR-baserade undersökningar som använder LMW-DNA som endast riktar sig till en eller några få gener har varit mycket informativa i förståelsen av anpassning och den molekylära utvecklingen av fladdermussensorisk biologi6,14, fysiologi15, fylogenetik 5,16, och bevarande17,18. Framgångsrik riktad sekvens återbildning av låg molekylvikt och fragmenterad DNA har också visats för många ryggradsdjur grupper, inklusive fladdermöss19. Dessa metoder är ofta kostnadseffektiva och minimalt invasiva till bat, som fekal prover och icke-dödande vävnad provtagning via buckala svabbbarna eller vingar biopsi stansar är också vanliga sätt att få DNA för låg molekylvikt analyser20, 21.
Kvaliteten beror dock i hög grad på vilken typ av media som provet är lagrat i22. Efter systematiska och kvantitativa jämförelser av buckala kompresser och biopsi stansar, vinge biopsi stämplingar har visat sig ge genomgående högre nivåer av DNA och var mindre stressande att bat under samling22. Dessa jämförelser visade också att de bästa resultaten erhölls när vingslag var bevarad i indikator kiseldioxid (dvs, en typ av torkmedel av kiselgel pärlor som ändrar färg när fukt observeras) snarare än i andra populära lagringsmedia såsom etanol eller DMSO22; även andra lagringsmedia inklusive vävnads stabilisering lösning inte undersökts. Wing stansar kan också användas för att odla fibroblastceller i kulturen, såsom i Kacprzyk et al.23 och som beskrivs nedan (se avsnitt 6). För dessa metoder bör vinge eller uropatagium utökas försiktigt, och en ren biopsi Punch, typiskt 3 mm i diameter, bör användas för att få provet. Detta tillvägagångssätt verkar orsaka någon bestående skada, med ärr läkning över inom veckor i de flesta fall24.
HMW DNA (10-150 kB) är mer utmanande och är för närvarande endast tillförlitligt erhålls med hjälp av vävnad som har snabbt blinkar fryst i LN2 efter skörd och upprätthålls vid ett maximum av-80 ° c till extraktion. HMW DNA (10-150 kB) är avgörande för lång-läsa DNA-sekvensering och därför för de Novo genommontering. I själva verket, medan de flesta kommersiella Kit kan användas för att isolera vissa standard HMW DNA, de resulterande molekyl storlekar ofta inte uppfyller kraven i tredje generationens sekvenserings teknik [t. ex. de som lanserades av företag som Pacific Biosciences (PacBio), Oxford Nanopore Technologies, och 10X genomik, eller genom monteringsmetoder som erbjuds av Bionano Genomics eller dovetail Genomics]. Som sådan, det finns en ny efterfrågan på "Ultra HMW" DNA (> 150 kB). När du skaffar Ultra HMW DNA från fladdermöss, färska prover av lever, hjärna, eller muskler är alla lämpliga, men dessa måste omedelbart blinka fryst i LN2 utan någon lagringbuffert eller cryoprotectant. En fullständig beskrivning av dessa steg ligger utanför tillämpningsområdet för detta dokument, men finns på andra ställen25.
Vävnad för RNA RNA är en enkelsträngad molekyl som är mindre stabil än DNA. Även om det finns många former av RNA,-omics analyser tenderar att fokusera på mRNA (Messenger RNA) och små RNAs (t. ex. microRNAs). Efter transkription, är mRNA skarvas för att bilda en mogen avskrift som inte innehåller några introner och representerar kodnings delen av gener/genomer. Kodninggener står för en bråkdel av genomets storlek (1%-2%), vilket gör målgruppen mRNA till ett kostnadseffektivt sätt att erhålla sekvensdata för gener. MicroRNAs är en klass av RNAs som reglerar processen för översättning av mRNA till proteiner och är därmed viktiga regulatoriska effektorer. RNA-utskrifter kan sekvenseras individuellt, eller mer allmänt för-omics analyser26,27,28,29,30, som en del av en transkriptome; det vill, summan av alla RNA-transkriptioner som finns i ett givet prov.
Sekvensering kan utföras efter flera metoder (dvs. via kortlästa RNA-SEQ eller långlästa hela isoform SEQ), vilket möjliggör analys av både RNA-överflöd och isoform-användning. Eftersom mängden och mångfalden av mRNA-transkriptioner varierar mellan celler och vävnader gör RNA-sekvenseringen det möjligt att studera och jämföra genuttryck och reglering över prover. Intresset för att sekvensera små RNAs och hela isoform sekvensering växer, eftersom dessa metoder blir allt mer biologiskt informativ. Beredning av vävnadsprover för att sekvensera olika klasser av RNA kan utföras på samma sätt som presenteras i detta manuskript, med endast de efterföljande extraktionsmetoderna skiljer31,32. Slutligen, eftersom transkriptom erbjuder en hög täckning delmängd av protein-kodning arvsmassan, den sammansatta datauppsättningen kan vara användbar i genommontering och anteckning, vilket gör insamling av RNA-SEQ data över en rad olika vävnader en viktig del av Bat1K initiativ.
I motsats till DNA, RNA är kemiskt instabil och även riktad av RNase enzymer, som är ubiquitously närvarande i vävnad celllysat som en defensiv strategi mot RNA-baserade virus. Av dessa skäl börjar RNA-fraktionen i celler och vävnader att brytas ned kort efter provtagnings-och/eller dödshjälp. Att bevara RNA kräver därför åtgärder för att förhindra dess nedbrytning. Detta innebär vanligtvis att bevara nyinsamlad vävnad vid 4 ° c i ett stabiliserande medel såsom RNA stabiliserande lösning för att inaktivera de RNases naturligt i vävnader, följt av frysning för längre sikt lagring. Som ett föredras alternativ, kan vävnad vara Flash fryst i LN2; även som nämnts ovan, transporterar LN2 in i fältet och bibehålla nivåer för att förhindra att vävnaden upptinning kan vara logistiskt utmanande.
Vävnad för protein Protein sammansättning och relativ överflöd varierar mellan celler och vävnader på ett liknande sätt som diskuterades för RNA; proteiner är dock i genomsnitt stabilare än RNA. Protein identifiering med proteomik matchar vanligtvis en bråkdel av, och inte hela, proteinsekvensen, men den kan tillhandahålla information om uttryck över vävnader och karakterisera patogener närvarande. Eftersom många proteinsekvenser bevaras över däggdjur, kan bat prover för proteomik lätt kontamineras med bevarade mänskliga proteiner, kräver sterila protokoll (t. ex. handskar, pincett) under insamling. Medan Flash-frysning i LN2 är det bästa sättet att förhindra nedbrytning av proteiner, användning av torris,-20 ° c frysar, och även is är lämpliga om det inte finns några andra medel. När temperaturerna ökar stiger också risken för differential proteinnedbrytning. Stabiliserande medel såsom vävnads stabilisering lösning är effektiva för att bevara proteinfraktion av vävnader vid rumstemperatur och är lämpliga för korttids bevarande (upp till en vecka) när blixten fryser inte är lönsamt.
Den enzymatiska profilen för en given vävnad påverkar direkt bevarandet av proteinet däri. Vävnader med låg enzymatisk aktivitet såsom muskler kan bevara protein profiler även vid högre temperaturer i ett hushåll frys. Däremot är levervävnad enzymatiskt reaktiv, och dess proteiner har högre sannolikheter för förnedrande under beredning. Det ökande antalet protokoll för att erhålla mänskliga proteomiska profiler från formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE) prover tyder på att PARAFORMALDEHYD fastställande av vävnader har löfte om låg kostnad protein bevarande när frysning vid insamling är inte genomförbar33,34. Även om det är mycket beroende av bevarandetid och tillstånd, proteiner har identifierats via immunohistokemi från formalin-fasta, etanol-konserverade bat exemplar35. Denna metod är inte skalbar till proteomic-nivåprovtagning men belyser potentialen för formalin-fasta bat-vävnader att ge protein profiler när blixt nedfrysningen inte är tillgänglig och andra stabiliserande medel är för kostsamma.
Vävnad för cellodling Provtagning vävnad och blixt-frysning erbjuder en ändlig mängd material som skall användas, och när materialet används, är det inte längre tillgänglig. Alternativt, cellkulturer ger levande celler som omedelbart kan användas eller bevaras för framtida studier. Kulturer underlättar också expansion av celler för att öka avkastningen när vävnadsprover är små. Det är särskilt användbart i fall där vävnads insamling är begränsad, såsom experiment med sällsynta arter där icke-dödande provtagning är viktigt och därför har stora konsekvenser för bevarandet. Beskrivs är ett protokoll där cellkultur är möjligt via icke-dödande provtagning av Ving membran vävnad, men odling är möjlig med flera vävnadstyper36,37. Det protokoll som anges här väljer för adherenta celler. Kombinationen av källa vävnad och tillväxt medier som används gör detta protokoll lämpar sig för att välja och odla fibroblaster, men om så önskas, kan alternativa protokoll användas för att välja för andra celltyper. I samband med projektet Bat1K förutspås det att för sällsynta och hotade arter, är icke-dödande provtagning av Ving membran och expansion av prover genom odling viktigt att generera den volym av DNA som behövs för de många tekniker som används5 .
Bat Capture Alla som hanterar fladdermöss bör utbildas av en bat-kompetent forskare och vaccineras mot rabies med en serie före exponerings injektioner. Om biten, en ytterligare serie av efter exponering injektioner är fortfarande nödvändigt. Standard metoder för att fånga fladdermöss är bland annat dim nät (figur 1) och Harpan (figur 2). Mist Nets används oftast och är idealiska för områden med låg till måttlig aktivitet, eftersom de kräver mest omsorg för att minimera bat nöd. Små fladdermöss är särskilt sårbara och kan dö av stress om de inte tenderade att snabbt. Täta netto inspektioner minimerar bat-skador och dödlighet samt skador på dimnätet. Denna detalj är viktig eftersom en ordentlig vävnads uppsamling kräver att vävnaden är fräsch, och olämplig uppmärksamhet på dimnäten i fladdermöss kan leda till onödig dödlighet eller förtida dödlighet innan forskaren kan bearbeta prover på rätt sätt. Eftersom flera fladdermöss kan vila i en harpa fälla med minimal nöd, är denna metod idealisk för områden med hög fladdermus aktivitet, såsom nära en grotta eller stor hönshus. Detaljerade instruktioner för korrekt hantering av fladdermöss och databehandling för insamling av morfologisk och demografisk information finns i kompletterande metoder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

I och med att sekvenstekniker med hög kapacitet avancerar kan standardiserade metoder för vävnads anskaffning och bevarande av hög kvalitet möjliggöra en utvidgning av dessa metoder till icke-modellorganismer. En serie protokoll för att optimera vävnads insamling från fladdermöss har utvecklats för en rad sekvenserings metoder med höga dataflöden. Beskrivs här är protokoll för fångst av fladdermöss, önskad demografi som ska samlas in för varje bat, och optimerade metoder för att minimera stress på en fladdermus vid vävnads insamling. Specifikt beskrivs metoder för att samla in och behandla vävnad för att erhålla (i) DNA för högmolekylära genomiska analyser, (II) RNA för vävnadsspecifika transkriptomer, och (III) proteiner för proteomisk nivå analyser. Slutligen, också beskrivs är en metod för att undvika dödliga provtagning genom att skapa livskraftiga primära cellkulturer från Wing klipp. En central motivation av dessa metoder är att maximera mängden potentiella molekylära och morfologiska data för varje bat och föreslå optimala sätt att bevara vävnader så att de behåller sitt värde som nya metoder utvecklas i framtiden. Denna standardisering har blivit särskilt viktig eftersom initiativ för att sekvensera kromosomnivå, felfria genomar av arter över hela världen har uppstått, där flera vetenskapliga partier går i spetsen för sekvenseringen av olika taxonomiska Grupper. De protokoll som beskrivs häri definierar den idealiska vävnad insamling och vävnads Bevarandemetoder för Bat1K, konsortiet som sekvenserar genomen av varje art av fladdermus.

Dna För standardanalyser av låg molekylvikt (LMW) utvunnits DNA från tre arter av neotropiska fladdermöss. Vävnadsprover samlades in på fältet från Dominikanska republiken och Costa Rica, enligt de protokoll som beskrivs i detta dokument. Efter dissektion, små bitar (< 0,5 cm vid den tunnaste delen) av blandade vävnader (hjärna, lever, och tarm) placerades i RNA-stabiliserande lösning, blixt fryst, sedan lagras vid-80 ° c. Extraktioner utfördes med standa...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Detta är ett protokoll för optimal vävnads beredning för genomisk, transkriptomisk och proteomisk analys av fladdermöss som fångats i naturen. Den innehåller protokoll för BAT fånga och dissektion, vävnad bevarande, och cellodling av BAT vävnad.

Vävnads insamling av fladdermöss för-omics-analyser och primär cell kultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

I den här videon ger vi en steg för steg guide till att samla fladdermöss på ett humant sätt, avsedda att minimera påverkan på populationer och maximera vetenskapligt värde. Fördelarna med vår strategi är att vi maximerar mängden potentiella molekylära och morfologiska data för varje fladdermus, bevarar vävnader för att behålla sitt framtida värde och minimera skörden av vilda individer. Dissektion protokoll är svåra att verbalt demonstrera.Många av de vävnadsprepareringstekniker vi presenterar här kommuniceras bäst genom att visualisera hur olika organ identifieras, och sedan korrekt dissekeras och lagras. Förbered alla injektionsflaska innan du startar några dissektioner för att undvika förseningar. För RNA, ställ undan det antal injektionsflaska som behövs för varje preparat.Märk varje rör med den vävnadstyp som kommer att samlas in, samt standardinformation om preparatidentifiering. Fyll injektionsflaskan 50%full av RNA stabiliserande lösning, och kyla till fyra grader celsius. Var noga med att inte fylla injektionsflaskan helt med RNA-stabiliserande lösning, eftersom röret kan explodera när det placeras i flytande kväve.Omedelbart efter dödshjälp, utföra halshuggning av bat exemplaret som beskrivs i textprotokollet. Flå skallen från håret, fascia, och kraniet muskler, inklusive huden på näsan. Var noga med att inte bryta den främre änden av näsan.Ta bort ögonen med tivnim, med stark nog kraft att lossa synnerven. Placera ögonen i en två milliliter injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning. Använd sax för att göra en sagittal skära på ryggdelen av skallen börjar vid halsen, var noga med att inte skada hjärnan.Använd sedan tens för att försiktigt dra tillbaka båda sidor av skallen, tills den är sprucken öppen för att exponera hjärnan. Se till att kraniets skalle har tagits bort, så att tuppar lätt kan skrapa bort hjärnan. Skrapa försiktigt hjärnan med tuppar.Hjärnan kommer att vara väldigt mjuk. Luktbulben kommer att bli synlig, sitter vid den ventrala delen av det inre av skallen. Försök att hålla luktbulben bifogas.Om möjligt, hålla hjärnans form intakt, och omedelbart placera den på torris, eller i en fem milliliter injektionsflaska med RNA stabiliserande lösning. På skallens caudalände bör cochlei nu i sidled synas på varje sida av huvudet. Använd forceps för att försiktigt dra cochlei.Lägg dem sedan i en två milliliter injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning. Gör två snitt där toppen och underkäken går, och ta bort underkäken. Cribriformplattan kommer att bli uppenbar.Detta är ett kritiskt ben för att hålla forskaren orienterad. Det kan identifieras som den mest främre regionen av skallen, med flera foramen, och med två spår där luktbulben vilar. När mandibeln har avlägsnats, ta bort talarstolen från den återstående delen av skallen.Se till att käften inkluderar cribriformplattan. Placera näsan i RNA-stabiliserande lösning, och förvara på fyra grader celsius över natten. Från den nedre underkäken, skär tungan med sax, och placera i en två milliliter injektionsflaska av RNA stabiliserande lösning.Placera nosflaskan i flytande kväve efter över natten blöt i RNA stabiliserande lösning. Efter 24 timmars blötläggning på is, eller i kylen, placera proverna i flytande kväve. Använd en skalpell för att genomborra bukhålan, vilket gör ett längsgående snitt upp till revbenen.Detta förverkar skelettet ram. Strip huden att avslöja bröstmuskeln, och ta minst två prover av muskler. Vävnader för både RNA och DNA samlas in under dessa dissektioner.Placera vävnader för hög molekylvikt DNA i torra cryovials, och flash frysa i flytande kväve. Placera vävnader för RNA i RNA-stabiliserande lösning. Skär genom bröstbenet, och dra bort revbenen.Hämta lungan och hjärtat nu. Använd skalpell och tent för att separera hjärtat från lungan. Använd en skalpell för att bryta upp lungan, och placera i RNA stabiliserande lösning.Samla hjärtat, som kan tas hela, men bör sektions i halvor, så att RNA stabiliserande lösning blöter ordentligt. Ta prover från levern nu. Ta minst två prover av lever.Placera ett prov i en injektionsflaska för att förbli frusen för hög molekylvikts-DNA och placera det andra provet i RNA-stabiliserande lösning. Följ den lever trumman för att hitta bukspottkörteln och gallblåsan. Överför gallblåsan till en injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning.Hitta magen, och fjäder-liknande mjälte på sin bas, visas som en annan nyans av lila. Bukspottkörteln bör också vara synlig här som en viktstruktur. Samla magen, mjälten, och bukspottkörteln, i respektive injektionsflaska med RNA stabiliserande lösning.Samla små prover av små och tjocktarmen. Placera i respektive injektionsflaska med RNA-stabiliserande lösning. Ta en av njurarna, och följ deras kanaler till urinblåsan, sedan placera i respektive injektionsflaska med RNA stabiliserande lösning.Använd den andra njuren som en guide för att hitta testiken om manliga, eller livmoder och äggstockar om hona. Samla en eller båda gonads om möjligt. Också ta prover av olika delar av huden på vingen, och hålla i separata injektionsflaska.Den största fördelen med vårt tillvägagångssätt är att det gör det möjligt för oss att prova djur på ett icke-dödligt sätt, samtidigt som det genererar tillräckligt med material för genomiska studier, samt funktionella molekylära studier. Vårt protokoll tillåter beredning av primära fibroblaster från vingvävnad. Cellerna representerar en dyrbar förnybar källa av genetiskt material, samt en modell för funktionella och molekylära utforskningar i fladdermöss.Wing klipp som har bevarats i tillväxt media enligt avsnitt sex i det skriftliga protokollet bör överföras till vävnadskultur anläggningen. Överför rörets innehåll till ett 15 milliliter koniskt centrifugrör. Vingmembranbiopsin används för denna demonstration.Ta försiktigt bort tillväxtmediet. Tvätta försiktigt biopsin två gånger med 500 mikroliter sterila PBS. Lägg till 500 mikroliter på ett milligram per milliliter kollagenas fyra till röret.Detta kommer att orsaka matsmältning av vävnaden i enskilda celler. Inkubera över natten vid 37 grader celsius utan agitation. På dag två, gör en ny tillväxt medium, och före kriget det till 37 grader celsius.Förbered en sex väl vävnad kultur tallrik genom att lägga till två milliliter av färska förvärmda tillväxt medium i varje brunn av plattan som ska användas. Förvara denna platta i en 37 grader celsius och 5%koldioxid inkubator tills det behövs. Ta bort 15 milliliter röret som innehåller cellerna från inkubatorn, och släcka matsmältningen reaktion genom att lägga till en milliliter av färskt tillväxtmedium.Resuspend cellerna genom att noggrant triturating lösningen med en P1000 pipett spets för att uppnå en enda cell suspension. Snurra försiktigt ner cellerna i en bordsskiva centrifug i tre minuter vid 300 gånger G.Kassera supernatanten genom att försiktigt ta bort 80 till 90%av vätskan med en P1000-pipett. Resuspend pelleten i 500 mikroliter av förvärmda tillväxtmedium.Försiktigt triturate suspensionen för att säkerställa att pelleten inte längre är synlig, och att cellerna är tillräckligt upphängda, se till att undvika små bitar av vävnad som fortfarande kan vara synliga på väggarna. Försiktigt pipettera hela volymen av cellfjädring i en enda brunn av de sex brunnsplattan som var beredd tidigare, innehållande förkrigstillväxtmediet. Försiktigt klippa plattan från sida till sida och fram till rygg två till tre gånger för att hjälpa celler att distribuera över brunnen ytan i ett enda lager.Kontrollera de pläterade cellerna under ett mikroskop. De bör vara enstaka celler som visas balled upp och flytande, men mycket tät. Placera försiktigt plattan i en inkubator förinställd till 37 grader celsius och 5%koldioxid.Efter ungefär 24 timmar, observera cellerna under mikroskopet för att bestämma hälsan hos kulturen. Celler ska nu fästas på plattans yta, och visas tillplattade. Underhåll cellerna i en befuktad inkubator förinställd till 37 grader celsius och 5%koldioxid.Celler bör observeras under mikroskopet regelbundet för att fastställa behovet av media förfriskning eller uppdelning. När det är nödvändigt, aspirera noggrant cirka 50%av mediet från brunnen, och tillsätt försiktigt en milliliter av förkrigsmed tillväxtmedium till sidan av brunnen, för att inte störa cellerna. När det är nödvändigt att passage cellerna, försiktigt aspirera cirka 90%av tillväxtmediet.Tvätta cellerna mycket försiktigt genom att lägga till en milliliter steril PBS till väggen i brunnen, för att inte störa cellerna. Försiktigt klippa plattan fram och tillbaka och sida till sida två till tre gånger. Aspirera försiktigt alla PBS från plattan innan du tvättar cellerna igen.Lägg trypsin EDTA till brunnen, och försiktigt klippa plattan för att täcka hela ytan av brunnen med trypsin EDTA, och inkubera i en och en halv minut i rumstemperatur. Släck reaktionen genom att lägga till en milliliter färskt förvärmt tillväxtmedium. Pipett upp och ner ungefär fem gånger för att tvätta cellerna från ytan av plattan, och se till att cellerna är i suspension.Placera cellupphängningen i ett 15 milliliterrör och snurra ner cellerna i en bordsskiva centrifug i tre minuter vid 300 gånger G.Kassera supernatanten genom att försiktigt ta bort 80 till 90 procent av vätskan med en P1000-pipett. Resuspend pelleten i en milliliter av förvärmda tillväxt medium, och försiktigt triturate suspensionen. Se till att pelleten eller stora fragment av pelleten inte längre är synliga, och celler är i en enda cell suspension.För att räkna cellen med hjälp av en automatiserad cellräknare, blanda en tio microliter alikvot av de upphängda cellerna en till en med trypan blå för att upptäcka livskraftiga celler. Inkubera i en minut, och pipetter 10 mikroliter av lösningen på räkneglaset. Infoga räknesbilden i en automatiserad cellräknare för att räkna cellerna med hjälp av lämpliga inställningar.Förbered frysning media genom att kombinera tillväxt medium med DMSO för att få en slutlig koncentration på 10%DMSO. Pelleten ska vara beredd från en 80 till 90%konfluent brunn av en sex brunnsplatta. Resuspend pelleten i en och en halv milliliter frysmedium.Placera cirka 750 mikroliter cellfjädring i var och en av två separata cryovials. Placera injektionsflaskan i en kryogen frysbehållare, så att cellerna fryser långsamt för att bibehålla cellens vitalitet. Placera dem omedelbart på minus 80 grader celsius.För att tina de frusna cellerna, förbereda en sex brunnsplatta som innehåller två milliliter förkrigsväxtmedium i varje brunn som kommer att användas. Bibehåll plattan i 37 grader celsius och 5%koldioxidinkubator tills det behövs. Ta en flaska celler från flytande kväve, och placera den i ett varmt vattenbad för att snabbt tina cellerna.Det här borde ta två till tre minuter. Så snart lösningen i injektionsflaskan tinat, försiktigt pipetteras uppåt och nedåt för att homogenisera lösningen, och omedelbart placera hela lösningen i en brunn av den sex brunnsplattan. Försiktigt klippa plattan från sida till sida och fram till rygg två till tre gånger för att hjälpa celler att distribuera över brunnen ytan i ett enda lager.Placera cellerna i inkubatorn på 37 grader celsius och fem procent koldioxid i 24 till 48 timmar. Övervaka och passage cellerna som visat. Representativa resultat av DNA-extraktioner visas för standard-DNA-analyser från tre fladdermusarter.Ett enda stort band indikerar minimal fragmentering, och liknande stora fragment av DNA från varje respektive extraktion. En vanlig indikator på framgång för RNA extraktioner är RNA integritet nummer, eller RIN, med värden över åtta representerar hög kvalitet i takt RNA. Här visas RIN-värden för RNA-extraktioner från 13 olika vävnadstyper av neotropiska fladdermusarter, som provsmakas på fyra olika orter.Vävnader som provsmakas från arter i Anderna, Costa Rica och Dominikanska republiken placerades direkt i flytande kväve efter blötläggning i RNA stabiliserande lösning vid fyra grader celsius över natten. Vävnader som provsmakas från arter i Amazonas placerades i flytande kväve ungefär en vecka efter att ha placerat en RNA-stabiliserande lösning, och hölls vid fyra grader celsius kontinuerligt. Även i sådana fall var RIN-värden jämförbara med de som omedelbart placerades i RNA-stabiliserande lösning, och direkt till flytande kväve.Efter vävnadskultur bör bat cellkulturer täcka 80 till 90% av plattan ytan, och behålla sin ursprungliga morfologi. Detta representerar den optimala scenen för uppdelning. Efter mer än sex passager, celler kommer att ändra sin morfologi för att bli större och längre, och cellerna kommer att träda senescence.Ljusa balled upp celler representerar döda celler. Celler i kultur representerar en förnybar källa till material, som DNA, RNA och protein. Dessa cellinjer kan frysas, vilket ger en resurs som kan användas under många års forskning.Detta möjliggör genomiska, transkriptomiska och funktionella studier som kommer att vara utmanande med hjälp av primära vävnader. Till exempel, celler kan modifieras genetiskt eller kemiskt för att observera effekter på cellulära fenotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Aktin Co-Sedimentering-analys, för analys av proteinbindning till F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Primär kultur Vuxen myocyter Rat hjärta

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Electrospinning Fibrer Polymer Byggnadsställningar för tissue engineering och cellodling

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Induktion och testning av Hypoxi i cellodling

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanoguld Märkning av jäst endosomal System för Ultra Analyser

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollet av retroviral infektion i Primär Intestinal organoid kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Förbättrad Swiss-rullande Teknik för tarmvävnad Förberedelse för immunhistokemisk och immunofluorescens Analyser

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...