Name: tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Centro de Ecología y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sánchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vásquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruíz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo ve Fanny Fernndeáz Melo'ya doku yapımı için teşekkür ederiz. Peru'da toplama mümkün. Ayrıca Dominik Cumhuriyeti'nde doku toplama mümkün hale getirmek için Grupo Jaragua ve Yolanda León tüm üyelerine teşekkür yanı sıra Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita, ve Kosta Rika La Selva Biyolojik Araştırma İstasyonu'nda herkes, yapmak için örnekleme mümkündür. Biz erişim ve hücre kültürü üretimi için Phyllostomus derenk yarasalar kanat yumruklar örnek toplama için Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe teşekkür ederiz. Phyllostomus renk değişikliği yarasalar Münih Ludwig-Maximilians-Üniversitesi Bölümü Biyoloji II bir üreme koloni kökenli. Yarasaların bakım ve üremesi için Münih bölge veterinerlik ofisi tarafından onay verildi. LMD, SJR, KTJD ve LRY NSF-DEB 1442142 tarafından finanse edilmiştir. LMD NSF-DEB 1838273 tarafından finanse edilmiştir. LRY NSF-PRFB 1812035 tarafından finanse edilmiştir. SCV ve PH, Max Planck Araştırma Grubu Ödülü ve Human Frontiers Science Program (HFSP) Araştırma hibesi (RGP0058/2016) tarafından finanse edilmiştir. SJR, JHTP ve KTJD, SJR'a verilen Avrupa Araştırma Konseyi (ERC Başlangıç hibesi 310482 [EVOGENO]) tarafından finanse edilmiş, EKT Avrupa Araştırma Konseyi hibesi (ERC-2012-StG311000) tarafından finanse edilmiştir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Stony Brook Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol #2013-2034).
1. Ötenazi
<ol><li>Bir isoflurane anestezi veya başka bir mevcut anestezik ile bir pamuk topu nemlendirin.</li>
	<li>Bir resealable, hava geçirmez plastik torba içine pamuk topu yerleştirin. Çanta rahat bir bez yarasa çantası bir çanta tutmak için yeterince büyük olmalıdır.</li>
	<li>Poşetin anestezi ile nüfuz et...

Bu el yazmasında tartışılan protokol yarasaların çeşitli yüksek işlemmoleküler analizleri için en iyi örnekleme uygulamalarını açıklayınız. Tüm başarılı -omics çalışmaları yüksek kaliteli doku gerektirir, ancak örnekleme yarasa dokusu, yanı sıra diğer model olmayan organizmalar, genellikle kontrollü bir laboratuvar ayarı ile aynı standartlara ayarlanamayan alan koşullarında oluşur. Örnekleme genellikle elektrik ve donduruculara sınırlı erişim de dahil olmak üzere en az kaynaklar...

Yüksek verimli sıralama (HTS) yöntemleri hızla verimlilik gelişmiş ve maliyet azalmıştır, ve şimdi yüzlerce veya binlerce örnek bu yaklaşımları ölçeklendirmek mümkündür. Bu teknolojilerin uygulanması ile elde edilen anlayışlar, biyotıp evrim veekoloji1,2,3,birden fazla bilimsel disiplinler arasında büyük etkileri vardır. Ancak, birçok HTS uygulamaları kritik bir canlı kaynaktan yüksek kaliteli nükleik asitler güveniyor. Bu sınırlama, uzun okunanmoleküller4dayalı üçüncü nesil sıralama gelişimi ile giderek daha sorunlu hale gelmesi muhtemeldir. Bu nedenlerden dolayı, laboratuvar dışında yabani organizmalardan taze doku örnekleri nin toplanması için en iyi uygulamaların oluşturulmasına odaklanmak gerekir, bu da malzemenin yararını en üst düzeye çıkarır ve ihtiyaç duyulması gereken bireylerin sayısını azaltır. Toplanan.
Bat1K kromozom düzeyinde montaj5yarasa her türün genom dizilimi için devam eden bir girişim ile bilim adamları uluslararası bir konsorsiyum . Yarasalar memeli çeşitliliğinin% 20 temsil ve yaşlanma, hastalık ekolojisi, duyusal biyoloji ve metabolizma5,6anlamak için etkileri var olağanüstü adaptasyonları var. Birçok yarasa da tehdit veya insan sömürüsü nedeniyle tehlike altında7 veya hızla patojenler nedeniyle azalan8,9, ve genom düzeyinde sıralama bu türlerin korunması için büyük önem taşımaktadır. Bat1K şu anda tüm yarasa türlerinin genomlarını dizilemeyi amaçlasa da, yüksek kaliteli genomik sıralama için doku örneklerinin toplanmasının standartlaştırılması organizma biyologları topluluğu nda önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Genomik verilere ek olarak, yarasa adaptasyonlarının çeşitliliğinin işlevsel olarak anlaşılması dokuya özgü transkripsiyon ve protein analizleri gerektirir ve genellikle ayrı toplama protokolleri gerektirir. Ayrıca, tüm taksonomik gruplarda olduğu gibi, -omik analizler için en yüksek kalitede veri elde etmek için optimum doku toplama ve koruma şartiken, hızla değişen teknolojiler ve bağımsız olarak çalışan birden fazla araştırma ekibi.
Yarasa-omics araştırma için en iyi uygulamaları benimsemeihtiyacı, birçok yarasa türünün nadir veya tehdit altında olduğu göz önüne alındığında, özellikle acildir. Kemirgenler ve sivri fareler gibi diğer küçük memelilerin aksine, yarasalar uzun ömürlüdür, olağanüstü DNA onarım mekanizmaları10 ve yavaş üreme11atfedilebilir , çoğu tür sadece bir veya (birkaç durumda) yılda iki genç doğurma ile. Bu nedenlerden dolayı, yarasa popülasyonları rahatsızlıktan kurtarmak için yavaş olabilir, ve vahşi birçok kişi toplama ne tavsiye edilebilir ne de uygulanabilir. Başka bir deyişle, protokoller tek bir örnek için maksimum veri miktarını elde etmek için optimize edilmeli ve böylece örnekleme çabalarını gereksiz yere çoğaltma gereksinimini azaltmalıdır.
Burada, bu protokol özellikle genomik ve transkripsiyon dizilimi ve protein analizleri için yarasa dokusunun toplanması ve örnekleştirilmesi için standartlaştırılmış yöntemlere odaklanmaktadır. En önemli önceliği, yarasa dokularının toplanması, dokuların ihracatı, stresin hayvana en aza itilmesi ve uzun süreli depolama koşullarına kadar etik ve sorumlu bir şekilde toplanmasını sağlamaktır. Toplanan farklı malzemelerin kullanışlılığını gelecekte de ön plana etmek amacıyla ayrıntılı diseksiyonlar geliştirilmiştir. Bu el yazması, yarasaları popülasyonlar üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve bilimsel değeri en üst düzeye çıkarmak amacıyla insancıl bir şekilde toplamak için adım adım bir kılavuz sağlar. Bu protokolün odak yarasalar kullanılmak üzere özel iken, adımların çoğu diğer omurgalı takson, özellikle memeliler ile ilgilidir.
Doku koleksiyonuna genel bakış Depolama sıcaklığı ve koruyucu madde seçimi de dahil olmak üzere doku toplama prosedürü, planlanan herhangi bir downstream analizlerin niteliğine göre belirlenecektir. Ancak, mümkün olduğunda, belirli bir analiz planlanmamış olsa bile, doku gelecekteki yarar maksimize etmek için yöntemler bir dizi altında toplanır şiddetle tavsiye edilir. Genel olarak, doku toplanır ve nükleik asitler (DNA ve RNA) veya protein sonraki analizleri için korunur. Bu uygulamaların her biri için, doku en iyi sıvı azot (LN2) doğrudan flaş donma ile korunabilir. Ancak, LN2 hemen daldırma her zaman alanında mümkün değildir. Teknoloji ilerledikçe, DNA ve RNA'yı ortam sıcaklıklarında depolamak için özel şişeler gibi kaynaklar daha kolay kullanılabilir hale gelmektedir. Bu protokoldeki tüm bu materyalleri doğrulamamış olsak da, diğer araştırmacıları burada sunduklarına göre yeni malzemelerin performansını karşılaştırmalı olarak analiz etmeye teşvik ediyoruz. LN2'ye erişilemediği durumlarda, örneğin Amazon'daki küçük uçak üzerinden siteye erişim nedeniyle LN2 taşımacılığının mümkün olmadığı durumlarda, farklı uygulamalar için ideal olarak dokuları korumak için yöntemler salıyoruz. Buna ek olarak, canlı hücrelerin yetiştirilip yayıldığı dokuları toplamak için bir yöntem salıyoruz. Aşağıda, bu ilgili amaçlariçin malzeme toplamak için önemli hususlar ı özetliyoruz ve toplama yöntemlerine genel bir bakış Tablo 1'deverilmiştir.
DNA için doku Toplanan tüm toplanan dokular için, depolama ortamı standart veya yüksek molekül ağırlıklı (HMW) DNA çıkarma için kullanılabilir olup olmadığını belirleyecektir. HMW uzun okuma sıralama için gereklidir ve şu anda kromozom düzeyinde genom derlemeleri oluşturmak için gerekli, ya da bir "platin standart" genom. Düşük molekül ağırlığı (LMW) DNA flaş dondurulmuş elde edilebilir, AllProtect (bundan böyle "doku dengeleme çözümü" olarak anılacaktır), hatta RNAlater (bundan böyle "RNA stabilizasyon çözümü")-korunmuş numuneler (flaş dondurulmuş numuneler optimal kalsa da ). Standart laboratuvar yöntemleriyle izole edilen DNA (örn. silika jel membran spin kolonları, fenol-kloroform), yine de ~20 kilobaza (kb) kadar DNA parçaları verebilir. Bu nedenle, yeterli verim olması koşuluyla, bu izole DNA formu tek bir kesici uç boyutu kitaplığı hazırlığı için kullanılabilir, hangi insert boyutu genellikle ~ 500 baz çiftleri (bp) ve ~ 100 bp kısa sıra okuma12oluşturulur . Bu DNA özellikle tam uzunlukta kromozomel verilerin gerekli olmadığı "sıralama" projeleri veya çalışmaları için yararlıdır. HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve sadece hasat tan sonra LN2'de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C'de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilebilir.
Düşük molekül ağırlığı veya parçalanmış DNA genellikle PCR ve kısa okunur sıralama13ile gen amplifikasyonu da dahil olmak üzere hedefli yaklaşımlar için yeterlidir. SADECE bir veya birkaç genhedef LMW DNA kullanarak PCR tabanlı araştırmalar adaptasyon ve yarasa duyusal biyoloji6molekülerevrimi anlamak son derece bilgilendirici olmuştur ,14, fizyoloji15, filogenetik 5,16, ve koruma17,18. Düşük molekül ağırlığı ve parçalanmış DNA'nın başarılı hedefli sekans ları yeniden ele geçirilirken, yarasalar19dahil olmak üzere çok sayıda omurgalı grubu da gösterilmiştir. Bu yöntemler genellikle düşük molekül ağırlığı analizleri için DNA elde etmek için yaygın yollar olduğu gibi, dışkı örnekleri ve bukkal swabs veya kanat biyopsisi yumruklar yoluyla öldürücü olmayan doku örnekleme, yarasa için maliyet-etkin ve minimal invaziv20, 21. yıl.
Ancak, kalite büyük ölçüde örneğin22depolandığı ortam türüne bağlıdır. Bukkal swabs ve biyopsi yumruklarının sistematik ve kantitatif karşılaştırmalar sonra, kanat biyopsi salgı yumruklar DNA sürekli daha yüksek seviyelerde verim gösterilmiştir ve toplama sırasında yarasa için daha az stresli22. Bu karşılaştırmalar aynı zamanda kanat yumruğu nun gösterge silikasında korunduğunda en iyi sonuçların elde edildiğini de gösterdi (örneğin, nem gözlendiğinde renk değiştiren silika jel boncuklardan yapılmış bir desiccant türü) etanol veya DMSO22; ancak doku stabilizasyon solüsyonu dahil diğer depolama ortamları incelenmemekle birlikte. Kanat yumrukları da kültür fibroblast hücreleri büyümek için kullanılabilir, Kacprzyk ve ark23 gibi ve aşağıda açıklandığı gibi (bölüm 6 bakınız). Bu yöntemler için, kanat veya üropatagium hafifçe uzatılmalı ve temiz bir biyopsi yumruğu, genellikle çapı 3 mm, örnek elde etmek için kullanılmalıdır. Bu yaklaşım kalıcı bir hasara neden gibi görünüyor, çoğu durumda hafta içinde iyileşiyor yaralarile 24.
HMW DNA (10-150 kb) daha zorludur ve şu anda sadece hasat tan sonra LN2'de hızla yanıp sönen ve ekstraksiyona kadar en fazla -80 °C'de tutulan doku kullanılarak güvenilir bir şekilde elde edilir. HMW DNA (10-150 kb) uzun okunan DNA dizilimi ve dolayısıyla de novo genom montajı için çok önemlidir. Gerçekten de, çoğu ticari kitleri bazı standart HMW DNA izole etmek için kullanılabilir iken, ortaya çıkan molekül boyutları genellikle üçüncü nesil sıralama teknolojilerinin gereksinimlerini karşılamak değil [örneğin, Bu Pasifik Biosciences (PacBio) gibi şirketler tarafından başlatılan, Oxford Nanopore Teknolojileri, ve 10x Genomik, ya da Biyonano Genomik veya Dovetail Genomics tarafından sunulan montaj yöntemleri ile]. Bu nedenle, "ultra HMW" DNA (>150 kb) için yeni bir talep vardır. Yarasalardan ultra HMW DNA elde ederken, karaciğer, beyin veya kas taze örnekleri tüm uygundur, ancak bu hemen herhangi bir depolama tampon veya kriyoprotektif olmadan LN2 dondurulmuş flaş olmalıdır. Bu adımların tam bir açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak başka bir yerde25mevcuttur.
RNA için doku RNA, DNA'dan daha az kararlı olan tek iplikçikli bir moleküldür. RNA'nın birçok şekli olmasına rağmen, -omik analizler mRNA (haberci RNA) ve küçük RNA'lara (örneğin mikroRNA'lar) odaklanma eğilimindedir. Transkripsiyondan sonra, mRNA intron içermeyen ve genlerin/genomların kodlama kısmını temsil eden olgun bir transkript oluşturmak üzere birleştirilmiştir. Kodlama genleri genom boyutunun küçük bir kısmını (%1-2) oluşturuyor ve bu da mRNA'nın hedefalınmasını genler için dizi verilerini elde etmek için uygun maliyetli bir araç haline getiriyor. MikroRNA'lar, mRNA'nın proteinlere çevrilme sürecini düzenleyen bir RNA sınıfıdır ve bu nedenle önemli düzenleyici efektörlerdir. RNA transkriptleri tek tek sıralanabilir, ya da daha yaygın olarak -omics analizleri için26,27,28,29,30, bir transkriptom un bir parçası olarak; diğer bir deyişle, belirli bir örnekte bulunan tüm RNA transkriptlerinin toplamıdır.
Sıralama çeşitli yöntemler (yani, kısa okunan RNA-seq veya uzun okunan tüm izoform Seq yoluyla) aşağıdaki yapılabilir, hem RNA bolluğu ve izoform kullanımı analizi sağlayan. mRNA transkriptlerinin miktarı ve çeşitliliği hücreler ve dokular arasında değiştiğinden, RNA dizilemesi gen ekspresyonunu ve regülasyonunun örnekler arasında incelenmesini ve karşılaştırılmasını mümkün kılabilir. Bu yöntemler giderek biyolojik olarak bilgilendirici hale geldikçe, küçük RNA'ların ve bütün isoform sıralamanın sıralanmasına olan ilgi artmaktadır. RNA farklı sınıflarda sıralamak için doku örneklerihazırlanması bu el yazması sunulan aynı şekilde yapılabilir, sadece sonraki çıkarma yöntemleri31,32farklı . Son olarak, transkripsiyonlar protein kodlayan genomun yüksek kapsama alanı alt kümesini sunduğundan, biraraya getirilen veri seti genom montajı ve ek açıklamalarında yararlı olabilir, bu da farklı dokular arasında RNA-seq verilerinin toplanmasını Bat1K girişimi.
DNA'nın aksine, RNA kimyasal olarak kararsızdır ve rna bazlı virüslere karşı savunma stratejisi olarak doku lysates'inde her yerde bulunan RNase enzimleri tarafından da hedef alınır. Bu nedenlerden dolayı, hücre ve dokularda RNA fraksiyonu örnekleme ve/veya ötenazi noktasından kısa bir süre sonra bozulmaya başlar. Bu nedenle RNA'nın korunması, bozulmasını önlemek için adımlar gerektirir. Bu genellikle 4 °C'de taze toplanan dokunun, dokularda doğal olarak bulunan RNa'ları inaktive etmek için RNA stabilizasyon çözeltisi gibi bir stabilizatör ajanda korunmasını ve ardından uzun süreli depolama için dondurulmayı içerir. Tercih edilen bir alternatif olarak, doku LN2 dondurulmuş flaş olabilir; yukarıda belirtildiği gibi, ln2'nin sahaya taşınması ve doku ların erimesini önlemek için seviyelerinin korunması lojistik açıdan zor layıcı olabilir.
Protein için doku Protein bileşimi ve göreceli bolluk rna için tartışılan benzer bir şekilde hücre ve dokular arasında değişir; ancak proteinler rna'dan ortalama olarak daha kararlıdır. Proteomik kullanılarak protein tanımlaması tipik olarak protein dizisinin bir kısmıyla eşleşir, tam olarak değil, ancak dokular arasında ifade hakkında bilgi sağlayabilir ve mevcut patojenleri karakterize edebilir. Birçok protein dizisi memeliler arasında korunduğundan, proteomik yarasa örnekleri toplama sırasında steril protokoller (örneğin eldivenler, forsepsler) gerektiren korunmuş insan proteinleriyle kolayca kontamine edilebilir. LN2'de parlama dondurma, proteinlerin bozulmasını önlemenin en iyi yolu olsa da, kuru buz, -20 °C'lik dondurucular ve hatta buz başka bir yol yoksa uygundur. Sıcaklıklar arttıkça diferansiyel protein arızası riski de artar. Doku stabilizasyon çözümü gibi stabilizasyon ajanları oda sıcaklığında dokuların protein fraksiyonunun korunmasında etkilidir ve flaş donma uygun olmadığında kısa süreli koruma için uygundur (bir haftaya kadar).
Belirli bir dokunun enzimatik profili doğrudan orada proteinin korunmasını etkiler. Kas gibi düşük enzimatik aktiviteye sahip dokular, ev dondurucuda yüksek sıcaklıklarda bile protein profillerini koruyabilir. Buna karşılık, karaciğer dokusu enzimatik reaktif, ve proteinleri hazırlık sırasında aşağılayıcı yüksek olasılıklar var. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) örneklerinden insan proteomik profilleri elde etmek için protokollerin giderek artan sayıda dokuların paraformaldehit sabitleme toplama üzerine donma düşük maliyetli protein korunması için söz tutar düşündürmektedir uygulanabilir33,34. Koruma süresine ve durumuna son derece bağlı olmasına rağmen, proteinler formalin-sabit, etanol le korunmuş yarasa örneklerinden immünohistokimya ile tespit edilmiştir35. Bu yaklaşım proteomik düzeyde örnekleme için ölçeklenebilir değildir, ancak flash-donma kullanılamadığında ve diğer stabilizasyon ajanları çok pahalı olduğunda formalin sabit yarasa dokularının protein profilleri verme potansiyelini vurgular.
Hücre kültürü için doku Örnekleme dokusu ve parlama dondurma kullanılacak sonlu miktarda malzeme sunar ve malzeme kullanıldıktan sonra artık kullanılamaz. Alternatif olarak, hücre kültürleri hemen kullanılabilir veya gelecekteki çalışmalar için korunmuş canlı hücreler sağlar. Kültürler de doku örnekleri küçük olduğunda verimi artırmak için hücrelerin genişlemesini kolaylaştırmak. Özellikle doku toplamanın sınırlı olduğu durumlarda yararlıdır, örneğin öldürücü olmayan örneklemenin gerekli olduğu ve bu nedenle koruma için geniş etkileri olan nadir türlerle yapılan deneyler gibi. Açıklanan hangi hücre kültürü kanat membran dokusunun öldürücü olmayan örnekleme yoluyla mümkün olduğu bir protokol, ancak birden fazla doku tipleri ile culturing mümkündür36,37. Burada sağlanan protokol yapışık hücreler için seçer. Kullanılan kaynak doku ve büyüme ortamının birleşimi bu protokolü fibroblastları seçmek ve büyütmek için uygun hale getirir, ancak istenirse diğer hücre tipleri için alternatif protokoller kullanılabilir. Bat1K projesi kapsamında, nadir ve tehdit altındaki türler için kanat zarlarının öldürücü olmayan örneklemesi ve numunelerin kültürlenme yoluyla genişlemesinin, kullanılan çoklu teknolojiler için gerekli DNA hacmini oluşturmak için gerekli olduğu tahmin edilmektedir5 .
Yarasa yakalama Yarasaları kullanan tüm insanlar yarasa yetkin bir araştırmacı tarafından eğitilmeli ve bir dizi ön maruziyet enjeksiyonu ile kuduz aşısı yapılmalıdır. Isırılırsa, bir dizi daha maruz kalma sonrası enjeksiyonları hala gereklidir. Yarasaları yakalamak için standart yöntemler sis ağları(Şekil 1) ve arp tuzakları(Şekil 2)içerir. Sis ağları en yaygın olarak kullanılan ve düşük ve orta aktivite ile alanlar için ideal, onlar yarasa sıkıntıen en aza indirmek için en çok bakım gerektiren gibi. Küçük yarasalar özellikle savunmasızdır ve hızlı bir şekilde eğiliminde değilse stresten ölebilir. Sık yapılan net denetimler yarasa yaralanmasını ve mortalitenin yanı sıra sis ağına zarar verebilir. Uygun doku toplama doku taze olmasını gerektirir, çünkü bu ayrıntı önemlidir, ve yarasalar sis ağları nauygun dikkat araştırmacı düzgün örnekleri işlemeden önce gereksiz mortalite veya erken mortaliteye yol açabilir. Birkaç yarasa en az sıkıntı ile bir arp tuzağında dinlenebilir çünkü, bu yaklaşım yüksek yarasa aktivitesi olan alanlar için idealdir, bir mağara veya büyük tünek yakın gibi. Morfolojik ve demografik bilgilerin toplanması için uygun yarasa yakalama ve veri işleme için ayrıntılı talimatlar ek yöntemler mevcuttur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Safelock tubes</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10509691</td>
			<td>1.5 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,002</td>
			<td>15 mL sterile tubes used during cell culture protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL cryovials</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1154P75</td>
			<td>cryogenic vials for tissues to be stored in liquid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-mm biopsy punch</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MIL3332</td>
			<td>wing biopsy punch for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>83,392</td>
			<td>Culture vessle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allprotect Tissue Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>76405</td>
			<td>for fecal samples; tissue stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides for TC10/TC20 cell counter, dual chamber</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0011</td>
			<td>Chambers for the count cells using the automated cell counter TC20 by Bio-Rad</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase IV</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td>For dissociation of primary cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-5X5ML</td>
			<td>Prevents crystalization of water during freezing of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM&#8211;Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12491-015</td>
			<td>culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190169</td>
			<td>Balanced salt solution used for washing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>10270106</td>
			<td>Serum-supplement for in vitro cell culture of eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1264-250MG</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0050</td>
			<td>Freezing container which provides 1&#176;C/min cooling rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793</td>
			<td>Wrapping tubes etc for sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (pen-strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140130</td>
			<td>Antibiotic for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 10x, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td>salt buffer used for washes and storage of bone tissue; dilute to 10X using de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>RNA stabilizing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse away</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>83931-250mL</td>
			<td>breaks down enzymes that lead to RNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>7631-86-9</td>
			<td>dessicant agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0013</td>
			<td>Cell stain used to assess cell viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>For dissociation of cells during splitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue collection of bats for -omics analyses and primary cell culture

Yüksek iş hacmi ne kadar çok yönlü sektirme teknolojileri ilerledikçe, yüksek kaliteli doku edinimi ve korunması için standartlaştırılmış yöntemler, bu yöntemlerin model olmayan organizmalara uzatılmasına olanak sağlar. Yarasalardan doku toplanmasını optimize etmek için bir dizi protokol, bir dizi yüksek iş elde li sıralama yaklaşımı için geliştirilmiştir. Burada özetlenen yarasaların yakalanması için protokoller, her yarasa için toplanacak istenen demografik ve doku toplama sırasında bir yarasa üzerinde stresi en aza indirmek için optimize yöntemleri vardır. Yüksek molekül ağırlıklı genomik analizler için (i) DNA, (ii) dokuya özgü transkripsiyonlar için RNA ve proteomik düzey analizleri için (iii) proteinler elde etmek için doku toplama ve tedavi yöntemleri özellikle özetlenmiştir. Son olarak, aynı zamanda kanat klipleri canlı birincil hücre kültürleri oluşturarak ölümcül örnekleme önlemek için bir yöntemdir. Bu yöntemlerin temel motivasyonu, her yarasa için potansiyel moleküler ve morfolojik veri miktarını en üst düzeye çıkarmak ve gelecekte yeni yöntemler geliştikçe değerlerini koruyabilmeleri için dokuları korumak için en uygun yolları önermektir. Bu standardizasyon, dünya çapında türlerin kromozom düzeyinde, hatasız genomlarını sıralama girişimleri ortaya çıktıkça özellikle önemli hale gelmiştir ve birçok bilimsel taraf farklı taksonomik dizilimi ne lerdir? Grup. Burada özetlenen protokoller Bat1K için ideal doku toplama ve doku koruma yöntemlerini tanımlar, yarasa her türün genomlarını sıralamak olan konsorsiyum.

Dna Standart düşük molekül ağırlığı (LMW) analizleri için DNA üç neotropikal yarasa türünden çıkarıldı. Bu yazıda açıklanan protokoller izleyerek Dominik Cumhuriyeti ve Kosta Rika'dan bölgede doku örnekleri toplanmıştır. Diseksiyonun ardından, rna stabilizasyon çözeltisine (beyin, karaciğer ve bağırsak) küçük parçalar (en ince kısımda 0,5 cm) yerleştirildi, flaş donduruldu ve -80 °C'de depolandı. Ekstraksiyonlar RNase tedavisi<...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture at JoVE.com

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Bu, vahşi doğada yakalanan yarasaların genomik, transkripsiyonik ve proteomik analizleri için en uygun doku hazırlığı için bir protokoldür. Bu yarasa yakalama ve diseksiyon, doku koruma ve yarasa dokusunun hücre culturing için protokoller içerir.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Bu videoda, popülasyonlar üzerindeki etkiyi en aza indirmek ve bilimsel değeri en üst düzeye çıkarmak amacıyla yarasaları insancıl bir şekilde toplamak için adım adım kılavuz salıyoruz. Yaklaşımımızın avantajları, her yarasa için potansiyel moleküler ve morfolojik veri miktarını en üst düzeye çıkarmak, gelecekteki değerlerini korumak için dokuları korumak ve yabani bireylerin hasat en aza indirmek tir. Diseksiyon protokollerini sözlü olarak göstermek zordur.Burada sunduğumuz doku hazırlama tekniklerinin çoğu, farklı organların nasıl tanımlandığını görselleştirerek en iyi şekilde iletilir ve daha sonra düzgün bir şekilde incelenir ve depolanır. Gecikmeleri önlemek için herhangi bir diseksiyon başlamadan önce tüm şişeleri hazırlayın. RNA için, her numune için gerekli şişe sayısını bir kenara koyun.Her tüpü, toplanacak doku tipive standart numune tanımlama bilgilerini etiketle. Şişeleri %50 dolu RNA stabilizatör çözeltisi doldurun ve dört dereceye kadar soğutun. Tüp sıvı nitrojene yerleştirirken patlayabilir gibi, şişeleri RNA stabilizatör çözeltisi ile tamamen doldurmamaya dikkat edin.Ötenaziden hemen sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi yarasa örneğinin kafasının kesilmesini gerçekleştirin. Deri saç kafatası, fasya, ve kafatası kasları, burun deri de dahil olmak üzere. Burnun ön ucunu kırmamaya dikkat edin.Optik sinir ayırmak için yeterince güçlü güç kullanarak, forceps ile gözleri çıkarın. Gözleri iki mililitrelik rna stabilizatör çözeltisi içine yerleştirin. Boyundan başlayarak kafatasının dorsal kısmında sagital bir kesik yapmak için makas kullanın, beyne zarar vermemeye özen.Daha sonra, kafatasının her iki tarafını da nazikçe geri çekmek için forseps kullanın, ta ki beyni ortaya çıkarmak için çatlayana kadar. Kafatasının kafatasının çıkarıldığından emin olun, böylece forcep'ler beyni kolayca kazıyabilir. Beyni ponplarla hafifçe kazıyın.Beyin çok yumuşak olacak. Koku ampul görünür hale gelecektir, kafatasıiç ventral kısmında oturan. Koku ampulü bağlı tutmaya çalışın.Mümkünse, beyin şeklini sağlam tutun ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin, ya da RNA stabilize çözeltisi beş mililitrelik şişe. Kafatasının kaudal ucunda, koklei şimdi yanal başın her iki tarafında görünür olmalıdır. Kokleiyi yavaşça çekmek için forceps kullanın.Sonra, rna stabilize çözeltisi bir iki mililitrelik şişe onları koyun. Üst ve alt çenenin birleştiği yerde iki kesi yapın ve çeneyi çıkarın. Kribriform plaka belirgin hale gelecektir.Bu araştırmacı odaklı tutmak için kritik bir kemiktir. Kafatasının en ön bölgesi olarak tanımlanabilir, birden fazla foramen ile, ve koku ampul dinlenir iki oluklar ile. Mandibula çıkarıldıktan sonra, kafatasının kalan kısmından rostrum çıkarın.Çenenin kribriform plakayı içerdiğinden emin olun. Burnu RNA stabilizatör çözeltiye yerleştirin ve bir gecede dört derece santigrat derecede saklayın. Alt mandibula itibaren, makas ile dil kesti, ve RNA stabilize çözeltisi iki mililitrelik şişe yerleştirin.Burun şişesini rna stabilizatör çözeltisinde bir gece bekletmeden sonra sıvı nitrojene yerleştirin. Buz üzerinde veya buzdolabında ıslatma 24 saat sonra, sıvı nitrojen örnekleri yerleştirin. Karın boşluğu ile delmek için bir neşter kullanın, kaburga kadar uzunlamasına bir kesi yapma.Bu iskelet çerçevesini kaybeder. Pektoral kas ortaya çıkarmak için cilt şerit, ve kas en az iki örnek almak. Bu diseksiyonlar sırasında hem RNA hem de DNA dokuları toplanır.Kuru cryovials içine yüksek molekül ağırlıklı DNA için dokular yerleştirin ve sıvı nitrojen flaş dondurma. RNA stabilizatör çözeltisindeki RNA için dokuları yerleştirin. Göğüs kafesini kes ve kaburgaları çek.Şimdi, akciğeri ve kalbi geri al. Kalbi akciğerden ayırmak için neşter ve terpsesi kullanın. Akciğer kırmak için bir neşter kullanın, ve RNA stabilize çözeltisi yerleştirin.Tüm alınabilir kalp toplamak, ancak yarıya kesilmelidir, böylece RNA stabilize çözeltisi iyice ıslatır. Şimdi, karaciğerden örnek al. En az iki karaciğer örneği alın.Yüksek molekül ağırlıklı DNA için donmuş kalması için bir numuneyi bir şişeye yerleştirin ve diğer örneği RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirin. Pankreas ve safra kesesi bulmak için hepatik kanalı izleyin. Safra kesesini bir şişe RNA stabilizatör çözeltisine aktarın.Mideyi ve tabanındaki tüy benzeri dalağını bulun, morun farklı bir tonu gibi görünün. Pankreas da burada bir ağırlık yapısı olarak görünür olmalıdır. RNA stabilize çözeltisi ilgili şişelerde mide, dalak ve pankreas toplamak.Küçük ve kalın bağırsak küçük örnekleri toplamak. RNA stabilizatör çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin. Böbreklerden birini alın ve kanallarını mesaneye kadar takip edin, sonra rna stabilizasyon çözeltisinin ilgili şişelerine yerleştirin.Eğer erkek, ya da rahim ve yumurtalıklar eğer kadın testisleri bulmak için bir rehber olarak diğer böbrek kullanın. Mümkünse bir veya her iki gonad toplayın. Ayrıca, kanat derisinin çeşitli bölgelerinden örnekler almak ve ayrı şişelerde tutmak.Yaklaşımımızın en büyük avantajı, hayvanları öldürücü olmayan bir şekilde örneklememize olanak sağlarken, genomik çalışmalar ve fonksiyonel moleküler çalışmalar için yeterli malzeme üretmemizdir. Protokolümüz kanat dokusundan primer fibroblastların hazırlanmasına olanak sağlar. Hücreler değerli bir yenilenebilir genetik malzeme kaynağını ve yarasalarda fonksiyonel ve moleküler keşifler için bir model temsil eder.Yazılı protokolün altıncı bölümü ne göre büyüme medyasında korunmuş kanat klipleri doku kültür tesisine aktarılmalıdır. Tüpün içeriğini 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Bu gösteriiçin kanat zarı biyopsisi kullanılır.Büyüme ortamını dikkatlice çıkarın. Biyopsiyi 500 mikrolitre steril PBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Tüpe mililitre kollajenaz başına bir miligram 500 mikrolitre ekleyin.Bu tek tek hücrelere doku sindirimine neden olacaktır. Bir gecede 37 derecede ajitasyon olmadan kuluçkaya yat. İkinci gün, yeni bir büyüme ortamı yaratın ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.Kullanılacak plakanın her kuyunun her bir kuyunun ait taze önceden ısıtılmış büyüme ortamına iki mililitre ekleyerek altı kuyulu doku kültür plakası hazırlayın. Bu plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit kuvözde ihtiyaç duyulana kadar saklayın. Hücreleri içeren 15 mililitrelik tüpü kuvözden çıkarın ve bir mililitre taze büyüme ortamı ekleyerek sindirim reaksiyonu söndürün.Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için p1000 pipet ucu ile çözeltiyi dikkatlice triturating ederek hücreleri yeniden askıya alın. P1000 pipetli sıvının %80 ila %90'ını hafifçe çıkararak 300 kez G.At'ta üç dakika boyunca bir masa üstü santrifüjdeki hücreleri yavaşça aşağı doğru çevirin. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının 500 mikrolitreiçinde pelet resuspend.Peletin artık görünür olmadığından ve hücrelerin yeterince askıya alınmasını sağlamak için süspansiyonu hafifçe triturate, duvarlarda hala görülebilecek küçük doku parçalarından kaçınmayı unutmayın. Daha önce hazırlanan altı kuyu plakasının tek bir kuyusu içine hücre süspansiyonunun tüm hacmini hafifçe pipetlendirin, önceden ısınma ortamını içerir. Hücreleri tek bir tabaka halinde kuyu yüzeyi üzerinde dağıtmak yardımcı olmak için yavaşça yan yana ve önden arkaya 2-3 kez plaka sallayın.Mikroskop altında kaplanmış hücreleri kontrol edin. Onlar toplanmış ve yüzen görünen tek hücreler olmalı, ama çok yoğun. Plakayı dikkatlice 37 santigrat derece ve %5 karbondioksite önceden ayarlanmış bir kuvöze yerleştirin.Yaklaşık 24 saat sonra, kültürün sağlığını belirlemek için mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin. Hücreler artık plaka yüzeyine iliştirilmeli ve düzleştirilmiş görünmelidir. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit önceden ayarlanmış bir nemlendirilmiş kuluçka hücreleri koruyun.Hücreler düzenli olarak medya ferahlık veya bölme ihtiyacını belirlemek için mikroskop altında gözlenmelidir. Gerektiğinde, dikkatlice kuyudan orta yaklaşık% 50 aspire, ve yavaşça kuyunun tarafına önceden ısıtılmış büyüme ortamı bir mililitre ekleyin, böylece hücreleri rahatsız değil. Hücrelerin geçişi gerektiğinde, büyüme ortamının yaklaşık %90'ını dikkatlice aspire edin.Hücreleri rahatsız etmemek için kuyunun duvarına bir mililitre steril PBS ekleyerek hücreleri çok nazikçe yıkayın. Yavaşça ileri ve geri ve yan yan 2-3 kez plaka kaya. Hücreleri tekrar yıkamadan önce tüm PBS'yi plakadan dikkatlice aspire edin.Kuyuya tripsin EDTA ekleyin ve incelikle detektifi yüzeyini trypsin EDTA ile kaplayacak şekilde kayalayın ve oda sıcaklığında bir buçuk dakika kuluçkaya yatırın. Taze önceden ısıtılmış büyüme ortamı bir mililitre ekleyerek reaksiyon söndürmek. Pipet yukarı ve aşağı yaklaşık beş kez plaka yüzeyinden hücreleri yıkamak ve hücrelerin süspansiyon olduğundan emin olun.Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve hücreleri 300 kez g.Atla ve p1000 pipetli sıvının yüzde 80 ila 90'ını hafifçe çıkararak üç dakika boyunca bir masa üstü santrifüjünde döndürün. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının bir mililitreiçinde pelet resuspend, ve yavaşça süspansiyon triturate. Peletveya peletin büyük parçalarının artık görünmediğinden ve hücrelerin tek hücreli süspansiyonda olduğundan emin olun.Hücreyi otomatik bir hücre sayacı kullanarak saymak için, asılı hücrelerin on mikrolitrelik aliquot'unu bire bir trypan mavisi ile karıştırarak canlı hücreleri tespit edin. Bir dakika kuluçka ve pipet 10 mikrolitre çözeltiyi sayma slaytına. Uygun ayarları kullanarak hücreleri saymak için sayım slaytını otomatik bir hücre sayacına ekleyin.%10 DMSO'luk son konsantrasyonu elde etmek için büyüme ortamını DMSO ile birleştirerek dondurucu ortam hazırlayın. Pelet bir 80 ila% 90 bir altı kuyu plaka sıyrık iyi hazırlanmalıdır. Bir buçuk mililitre dondurucu ortamda peleti yeniden askıya alın.İki ayrı cryovial'ın her birine yaklaşık 750 mikrolitre hücre süspansiyonu yerleştirin. Hücreleri hücre canlılığını korumak için yavaş yavaş donma böylece bir kriyojenik donma kabına şişeleri yerleştirin. Hemen eksi 80 santigrat derece yerleştirin.Dondurulmuş hücreleri eritmek için, kullanılacak her kuyuda önceden ısıtılmış büyüme ortamı iki mililitre içeren altı kuyu plaka sıhazırlayın. Plakayı 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit inkübatöründe ihtiyaç duyulana kadar saklayın. Sıvı nitrojen den hücrelerin bir şişe alın ve hızla hücreleri eritmek için Sıcak bir su banyosu yerleştirin.Bu 2-3 dakika sürer. Şişedeki çözelti çözülür çözülmez, çözeltiyi homojenize etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet alın ve hemen tüm çözeltiyi altı kuyunun bir kuyuya yerleştirin. Hücreleri tek bir tabaka halinde kuyu yüzeyi üzerinde dağıtmak yardımcı olmak için yavaşça yan yana ve önden arkaya 2-3 kez plaka sallayın.Hücreleri 37 derecede kuvöze yerleştirin ve %5 karbondioksiti 24 ila 48 saat boyunca. Gösterildiği gibi hücreleri izleyin ve iletin. DNA ekstraksiyonlarının temsili sonuçları üç yarasa türünün standart DNA analizleri için gösterilmiştir.Tek bir büyük bant en az parçalanma ve her ilgili çıkarma DNA benzer büyüklükte parçaları gösterir. RNA ekstraksiyonları için başarının ortak bir göstergesi, tact RNA'da yüksek kaliteyi temsil eden sekizin üzerindeki değerlere sahip RNA bütünlük numarası veya RIN'dir. Burada gösterilen neotropikal yarasa türlerinin 13 farklı doku türünden RNA ekstraksiyonrisi, dört farklı yerde örneklenmiştir.Andes, Kosta Rika ve Dominik Cumhuriyeti'ndeki türlerden alınan dokular, bir gecede dört derece santigrat derecede RNA stabilizasyon çözeltisinde ıslatıldıktan sonra doğrudan sıvı nitrojene yerleştirildi. Amazon'daki türlerden alınan dokular, RNA stabilizatör çözeltisi yerleştirildikten yaklaşık bir hafta sonra sıvı nitrojene yerleştirildi ve sürekli olarak dört derece santigrat derecede tutuldu. Bu gibi durumlarda bile RIN değerleri hemen RNA stabilizatör çözeltisine yerleştirilenlerle ve doğrudan sıvı nitrojene karşılaştırılabilirdi.Doku kültürünü takiben, yarasa hücre kültürleri plaka yüzeyinin %80-90'ını kapsamalı ve orijinal morfolojilerini sürdürmelidir. Bu, bölme için en uygun aşamayı temsil eder. Altıdan fazla pasajdan sonra, hücreler morfolojilerini değiştirerek daha büyük ve daha uzun hale gelecekler ve hücreler senescence'a girecekler.Parlak toplanmış hücreler ölü hücreleri temsil eder. Kültürdeki hücreler DNA, RNA ve protein gibi yenilenebilir bir malzeme kaynağını temsil eder. Bu hücre hatları dondurulabilir, böylece araştırma uzun yıllar boyunca kullanılabilecek bir kaynak sağlayan.Bu, birincil dokular kullanılarak zor olacak genomik, transkripsiyonel ve fonksiyonel çalışmalar sağlar. Örneğin, hücreler hücresel fenotipler üzerindeki etkilerini gözlemlemek için genetik veya kimyasal olarak değiştirilebilir.

tissue-collection-of-bats-for-omics-analyses-and-primary-cell-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimantasyon Testi; F-Aktin Bağlayıcı Protein Analizi

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biyoloji

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

Doku Mühendisliği ve Hücre Kültürü için Lifli Polimer Yapı iskeleleri elektrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Ultrastrüktürel Analizler için Maya endozomal Sisteminin Nanogold Etiketleme

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding primary 3D epithelial structures in vitro. Both the architecture and physiological properties of these &#39;mini-guts&#39;, also called organoids, closely resemble their in vivo counterparts. This makes them an attractive model system for the small intestinal epithelium. Using retroviral transduction, functional genetics can now be performed by conditional gene overexpression or knockdown. This video demonstrates the procedure of organoid culture, the generation of retroviruses, and the retroviral transduction of organoids to assist phenotypic analysis of the small intestinal epithelium in vitro. This novel organotypic model system in combination with retroviral mediated gene expression provides a valuable tool for rapid analysis of gene function in vitro without the need of costly and time-consuming generation for transgenic animals.

This protocol explains primary Lgr5-positve organoid culture and the subsequent performance of retroviral transduction. This enables Cre-inducible overexpression or knockdown of the delivered transgene and allows functional studies to be carried out in the novel in vitro organotypic model system.

İlköğretim Bağırsak organoid Kültür Retrovirütik Enfeksiyon Bir Video Protokolü

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

Immünohistokimyasal ve immünofloresan Analizleri için Bağırsak Doku Hazırlama için geliştirilmiş Swiss-haddeleme Tekniği

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

Birincil sığır Granulosa östrojen üreten bir doku kültürü Model hücreleri

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...