Name: culturing and measuring fetal and newborn murine long bones
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00
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Nous aimerions remercier Alexandra Joyner pour son soutien lorsque ce protocole a été établi, Edwina McGlinn et Yi-Cheng Chang pour le partage de l’acide rétinoïque. L’Institut australien de médecine régénérative est appuyé par des subventions du gouvernement de l’état de Victoria et du gouvernement australien.

Toutes les expériences doivent être menées suivant les directives locales gouvernementales et institutionnelles de la manipulation éthique des animaux de laboratoire.
1. préparations avant la journée de la culture osseuse
<ol><li>Configurez les accouplements de souris chronométrés pour obtenir des foetus et des chiots du jour embryonnaire 14,5 (E 14.5) et en avant. Remarque: La culture des os longs peut être appliquée avec succès à différentes souches de sour...

<ol>
	<li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+endochondral+skeleton.">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).</li><li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endochondral+ossification:+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton.">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li><li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+chondrogenesis.">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li><li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+the+growth+plate.">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li><li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skeleton:+a+multi-functional+complex+organ:+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification.">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li><li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast+precursors,+but+not+mature+osteoblasts,+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels.">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts:+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage.">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li><li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation.">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development,+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice.">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).</li><li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats.">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li><li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions.">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li><li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+1alpha,+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora.">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).</li><li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage.">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography.">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li><li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals:+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification.">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies.">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone &amp; Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li><li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions.">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).</li><li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways.">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).</li><li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. 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A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+ex+vivo+explant+cultures:+applications+in+bone+research.">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).</li><li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates.">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306 (2013).</li><li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system.">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).</li><li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage.">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li><li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage.">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression.">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li><li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis.">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li><li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance.">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).</li><li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium.">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li><li>Erben, R. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+strain+history+of+bone:+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains.">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li><li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain.">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li></ol>

Les méthodes de culture osseuse ex vivo ont été utilisées pendant un certain temps pour évaluer la biologie de la croissance osseuse28, mais ont été rarement appliquées à des os longs murins. Avec le développement de techniques d’imagerie, la culture osseuse ex vivo offre un moyen attrayant d’étudier la croissance osseuse en temps réel dans un cadre ressemblant étroitement aux conditions in vivo. Dans ce scénario, il est important de définir les conditions dans lesquelles la cro...

La croissance de l’organe doit être étroitement accordée pour prévenir l’apparition de troubles de la croissance, et implique la régulation de plusieurs types de cellules, voies moléculaires et Diaphonie entre les différentes parties du corps. Les techniques d’imagerie sont essentielles pour remédier aux changements survenant au fil du temps dans un embryon en croissance, dans des conditions normales, ainsi qu’après une perturbation est induite dans le système. Les embryons avec développement intra-utérin, comme les modèles de rongeurs largement utilisés, présentent un défi supplémentaire pour l’imagerie en direct et le traitement médicamenteux, qui peut être partiellement surmonté en utilisant des techniques de culture ex vivo. Pour récapituler avec succès les processus in vivo et obtenir des résultats significatifs, il devient crucial de trouver les bonnes conditions culturantes pour chaque organe ou tissu.
La plupart des os du squelette mammalien poussent à travers l’ossification endochondrale, où le cartilage embryonnaire (composé de cellules appelées chondrocytes) entraîne une croissance longitudinale et est graduellement remplacé par l’OS. Ce processus se déroule aux plaques de croissance, situées à la fin des longs os, où trois zones peuvent être distinguées: repos, proliférative et hypertrophique1,2. Tout d’abord, les chondrocytes ronds de progéniteur dans la zone de repos se transforme en chondrocytes en colonnes cycloaires dans la zone proliférative. Au cours de la prochaine étape de différenciation, ces chondrocytes deviennent hypertrophiques et commencent à sécréter le collagène de type X. Les chondrocytes hypertrophiques orchestrent les étapes suivantes de l’ossification: ils sécrètent des molécules de signalisation clés, telles que le facteur de croissance du tissu conjonctif, les protéines morphogénétiques des os et le hérisson indien, et dirigent la minéralisation de la matrice, recrutent les vaisseaux sanguins de la partie centrale de l’OS, et, sur l’apoptose, permettent aux ostéoblastes (cellules formant des os) d’envahir la matrice pour former le centre d’ossification primaire3,4. La matrice minéralisée facilite la pénétration des vaisseaux sanguins à travers lesquels les ostéoblastes migrent pour remplacer ce cartilage dégradé par une matrice osseuse5. La plupart des ostéoblastes envahissent la matrice du cartilage du périchondrium, une couche fibreuse qui enveloppe le cartilage6. Alternativement, une proportion de chondrocytes hypertrophiques sont capables de survivre et de se transdifférencier en ostéoblastes7,8,9. La longueur finale de l’OS est due à la croissance accumulée du cartilage transitoire, dont le taux de croissance dépend à son tour du nombre et de la taille des chondrocytes hypertrophiques, et de leur production matricielle10. En outre, il a été récemment montré que la durée de la dernière phase d’hypertrophie est corrélée avec la longueur finale de l’OS11. Par conséquent, une régulation serrée de la prolifération et de la différenciation de ces cellules est nécessaire pour assurer une taille osseuse appropriée.
Malgré les connaissances substantielles acquises au fil des ans sur l’organisation et le développement des plaques de croissance, la plupart de ces conclusions reposent sur l’observation de sections histologiques fixes. Le sectionnement tissulaire fournit des informations précieuses sur ce processus, mais peut être monté avec des artefacts techniques, de sorte qu’il ne peut pas être toujours utilisé de manière fiable pour estimer les changements morphologiques ou de taille entre les différentes étapes. En outre, comme la croissance osseuse est un processus dynamique, les images statiques en deux dimensions (2D) offrent un aperçu limité du mouvement des cellules dans la plaque de croissance, tandis que l’imagerie Time-lapse sur les tissus vivants pourrait offrir des informations précieuses sur le comportement de la chondrocytes dans la plaque de croissance.
Toutes ces limitations peuvent être potentiellement résolues à l’aide de cultures osseuses ex vivo. Alors que les protocoles de culture osseuse ont été développés il y a quelque temps, ils ont été appliqués de près aux os longs murins. La plupart des études utilisent Chick Bones en raison des avantages techniques offerts par le poussin modèle12,13. Des cultures organotypiques (interface air/liquide) ont été appliquées aux fémurs embryonnaires de poussins, qui ont été maintenus en culture pendant 10 jours14. Les outils génétiques sophistiqués disponibles dans la souris rendent ce modèle très attrayant pour être utilisé dans la culture osseuse ex vivo. Les études qui utilisaient des souris pour examiner la croissance osseuse travaillaient principalement avec des os métatarsiens15, probablement en raison de leur petite taille et de plus grands nombres obtenus par embryon16. Bien que traditionnellement considérés comme des os longs, les métatarsiens entrent dans la sénescence (caractérisée par une réduction de la prolifération et de l’involution de la plaque de croissance17) plus tôt que d’autres os longs in vivo, et par conséquent leur croissance continue ex vivo ne vraiment récapituler le processus in vivo. Aux fins du présent article, nous utiliserons le terme «os longs» pour les os des régions proximales et des membres intermédiaires. Plusieurs études antérieures utilisaient de longs os murins, comme le tibia, dans des cultures ex vivo et observaient une croissance substantielle du cartilage mais peu d’ossification18. Nous avons également utilisé les cultures tibiales récemment, principalement pour étudier la dynamique des chondrocytes19. D’autres études ont utilisé des têtes fémorales de jeunes souris20 ou seulement la partie distale du fémur pour la culture21. Quelques travaux plus récents combinent avec succès la culture ex vivo des os complets avec l’imagerie Time-lapse pour acquérir des films tridimensionnels (3d) de chondrocytes dans le tissu de souris vivant22,23. Les auteurs ont réussi à observer des événements précédemment inaperçus dans le réarrangement des chondrocytes à la zone proliférative23 dans un bon exemple de l’application potentielle de la culture osseuse ex vivo. L’alternative, c’est-à-dire l’analyse d’images statiques, nécessite des techniques indirectes et complexes. Cela a été illustré par une étude récente évaluant l’importance des clones à orientation transversale pour la croissance du cartilage, où le traçage génétique avec des souches de souris de reporter multicolore couplé avec la modélisation mathématique ont été utilisés24. Par conséquent, la culture ex vivo peut aider à mieux comprendre les processus dynamiques de manière plus rapide et plus directe.
Ici, nous présentons une méthode pour la culture des os longs murins, qui peut être combinée avec différents traitements moléculaires et/ou avec l’imagerie en direct Time-lapse. Ce protocole adapte les méthodes utilisées dans les rapports précédents15,18,25, mais aborde quelques problèmes supplémentaires et se concentre sur les os longs tels que le tibia, plutôt que les os métatarsiens. Enfin, il explore le potentiel d’utiliser des comparaisons appariées statistiquement puissantes en cultivant les os gauche et droit séparément en présence de différentes substances.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">CAS 61135-33-9</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td>353037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adobe Photoshop</td>
			<td style="width:132px;">Adobe</td>
			<td>CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td>A92902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Base unit for the scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td>435425-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Betaglycerophosphate</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Binocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">STEMI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v</td>
			<td style="width:132px;">Roche/Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10735086001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DigiRetina 500 camera</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Dissection kit</td>
			<td style="width:132px;">Cumper Robbins</td>
			<td style="width:119px;">PFS00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMSO</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Eppendorf 2-mL tubes</td>
			<td style="width:132px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Ethanol 96%</td>
			<td style="width:132px;">Merk</td>
			<td style="width:119px;">159010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Forceps Dumont#5 Inox08</td>
			<td style="width:132px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">T05811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heracell 150 CO2 incubator</td>
			<td style="width:132px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">51026282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Minimum Essential Medium Eagle</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M2279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Multiwell 24 well</td>
			<td style="width:132px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Plastic pipettes 1mL Sterile Individually wrapped</td>
			<td style="width:132px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Syringe filter 0.2 um&#160;</td>
			<td style="width:132px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">PN4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Terumo syringe 20 mL</td>
			<td style="width:132px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">DVR-5174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tretinoin (retinoic acid)</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">PHR1187-3X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Trinocular scope</td>
			<td style="width:132px;">Aunet</td>
			<td style="width:119px;">AZS400T</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and measuring fetal and newborn murine long bones

Les os longs sont des structures complexes et dynamiques, qui résultent de l’ossification endochondrale via un intermédiaire de cartilage. L’accès limité à des os humains sains rend particulièrement utile l’utilisation de modèles de mammifères, tels que la souris et le rat, pour examiner différents aspects de la croissance osseuse et de l’homéostasie. En outre, le développement d’outils génétiques sophistiqués chez la souris permet des études plus complexes de la croissance osseuse longue et demande une expansion des techniques utilisées pour étudier la croissance osseuse. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la culture osseuse murin ex vivo, qui permet l’étude de l’os et du cartilage d’une manière étroitement contrôlée tout en récapitulant la plupart du processus in vivo. La méthode décrite permet la culture d’une gamme d’os, y compris le tibia, le fémur et les os métatarsiens, mais nous nous sommes concentrés principalement sur la culture tibiale ici. En outre, il peut être utilisé en combinaison avec d’autres techniques, telles que l’imagerie en direct Time-lapse ou le traitement médicamenteux.

La culture osseuse peut être réalisée à partir de différentes étapes. Dans la figure 1a-D, on montre une comparaison entre le tibia cultivé et les fraîchement extraits à des stades équivalents. La première observation est que jusqu’à deux jours de culture, la taille obtenue est comparable à la croissance osseuse in vivo pour le cartilage et l’os minéralisé (figure 1a, B, D). De...

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Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né

Ici, nous présentons une méthode pour la culture ex vivo de longs os murins aux stades fœtal et nouveau-né, approprié pour analyser le développement osseux et le cartilage et l’homéostasie dans des conditions contrôlées tout en récapitulant le processus in vivo.

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cette méthode adapte le protocole de culture métatarsienne aux os plus gros, permettant de combiner la manipulation osseuse directe avec des modèles génétiques complexes pour traiter les processus liés au développement osseux. Cette technique permet la manipulation et l’analyse de la croissance osseuse qui ne sont pas possibles in vivo, comme l’imagerie en direct ou la manipulation physique et pharmacologique directe. Cette méthode de culture ex vivo permet l’étude spécifique des effets locaux de l’encart génétique dans l’os le séparant de l’effet systémique du traitement sur l’organisme.Commencez par stériliser la région abdominale d’un jour gestationnel enceinte 14,5 à 18,5 souris avec 80% d’éthanol et en utilisant de petits ciseaux pour ouvrir la peau et les muscles abdominaux pour accéder aux cornes utérinnes. Pour extraire l’utérus de la cavité abdominale, retirez le mésometrium et coupez la base des cornes. Ensuite, transférez l’utérus dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant un milieu de dissection glacé sur la glace.Dans une armoire de biosécurité coupée entre les sacs avec des ciseaux pour séparer les fœtus individuels, et transférer un sac individuel dans un nouveau plat de 60 millimètres avec milieu de dissection fraîche sous un microscope stéréo dissection. Utilisez des pinces à épiler pour séparer les fœtus des placentas et nettoyer les fœtus des membranes. Utilisez une pipette en plastique parée pour transférer le corps dans un nouveau plat de 60 millimètres et décapiter l’embryon avant d’autres dissections.Ensuite, utilisez des pinces à épiler pour enlever la peau, à partir du dos et l’épluchage vers les ateils. Utilisez la pince à épiler pour couper près de la colonne vertébrale et séparer les membres postérieurs du corps. Transférez les membres postérieurs dans un plat propre contenant un milieu de dissection glacé et insérez les pinces entre le cartilage de surface du fémur distal et le tibia proximal pour séparer le tibia du fémur.Retirer les os de la hanche du fémur proximal et l’os du calcanée et le péroné du tibia. Pincez soigneusement et tirez les tissus mous des fémurs et des tibias et utilisez une pipette stérile d’un millilitre pour transférer les quatre os de jambe dans le premier puits d’une plaque de 24 puits contenant le milieu frais de dissection. Il est important de montrer que le tissu mou qui relie le pouls de l’os est enlevé.Sinon, l’os se pliera et n’atteindra pas la croissance appropriée. Lorsque les os ont été disséqués à partir du nombre expérimental approprié de fœtus, imagez les os dans chaque puits parfois zéro sous un microscope léger avec un bon contraste et remplacez le milieu de dissection dans chaque puits par un millilitre de milieu de culture par puits en prenant soin de ne pas aspirer les os. Pour observer l’effet de l’inhibition de croissance dans les conditions de culture, traitez les tibias gauches avec l’acide rétinoïque nanomolaire de 500 nanomolar et incubez les tibias droit avec un volume équivalent de véhicule comme contrôle.Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions standard de culture cellulaire. Après deux jours, traiter les os avec un analogue approprié de thymidine pendant une à deux heures pour évaluer la prolifération de cellules d’os avant de transférer les os aux tubes individuels de deux millilitres de 4% paraformaldéhyde pendant 10 minutes. Ensuite, transférez les os à PBS pour l’image des os au point de temps final avant de retourner les échantillons au paraformaldéhyde pour la fixation de nuit à quatre degrés Celsius.Pour mesurer la longueur et la région minéralisée des os, ouvrez un logiciel d’imagerie approprié, et en tenant compte de l’échelle de l’image, mesurez à la fois la longueur totale de l’os et la région minéralisée. Démarrage des mesures à partir des premières cellules sombres à une extrémité jusqu’aux dernières cellules sombres à l’autre extrémité. Pour calculer le taux de croissance qui est défini comme l’augmentation moyenne de la longueur par jour, répartir la différence entre la longueur finale de l’os et la longueur initiale par le nombre de jours en culture.Ici, une comparaison entre le tibia cultivé et le tibia fraîchement extrait à des stades équivalents est montrée. Après jusqu’à deux jours de culture, la taille atteinte est comparable à la croissance osseuse in vivo pour le cartilage et l’os minéralisé. De plus longues périodes de culture conduisent à de plus grandes différences entre les os cultivés et les os fraîchement extraits.Notez que le tibia cultivé avec un ablation incomplète du tissu mou peut entraîner une flexion du tibia cultivé. Le traitement à l’acide rétinoïque a un effet robuste sur la croissance tibiale dès après deux jours de traitement. Bien qu’il y ait une augmentation constante de la longueur totale du tibia après deux jours dans la culture, cette croissance correspond à une augmentation approximative de seulement neuf à 29% de la longueur initiale.Moins que l’augmentation de la croissance osseuse qui serait observée in vivo. En effet, l’étiquetage analogique de thymidine montre moins de cellules positives dans cette région après culture comparées aux os fraîchement extraits d’un stade équivalent. En outre, dans le tibia cultivé in vitro, la longueur totale de l’élément squelettique augmente considérablement, tandis que presque aucune augmentation dans la région minéralisée n’est observée.En plus de l’analyse histologique et moléculaire, la compensation et l’imagerie 3D peuvent être effectuées après la culture pour caractériser l’effet cellulaire des traitements appliqués aux os cultivés. Cette technique nous permet d’aborder les questions liées à la communication interorganique. Par exemple, en co-culture des os des différents modèles génétiques dans une sorte d’expérience de parabiosis sans douleur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Une chambre simple pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants

Conséquences à long terme de comportements et reproduction d’exposition embryonnaire à faible dose des substances toxiques

Bisphenols, such as bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday-use ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

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Zika Virus Infection du cerveau foetal humain cultivé des cellules souches neurales pour analyse immunocytochimique

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

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Souris foetale Cardiovascular Imaging à l’aide d’un système à ultrasons de haute fréquence (30 / 45MHZ)

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

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L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

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Intraveineuse amniotique et In Utero une Transplantation chez le modèle murin

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

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Échographie de haute fréquence pour l’analyse du développement foetale et placentaire In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...