Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Forfatterne vil også gerne takke Dr. Christopher Nelson for redaktionel assistance. Obduktions programmet understøttes delvis af R35 Grant NS097303 til BDT. Arbejdet i RD-laboratoriet understøttes af tilskud fra NINDS (NS096148) og det nationale multipel sklerose Society, USA (RG 5298).

Denne protokol er blevet godkendt af Cleveland Clinic institutions Review Board og følger retningslinjer fra Cleveland Clinic Human Research etik Committee.
1. MRI på stedet
<ol><li>Tag donor kroppen med til MRI-pakken, og Udfør en 2-h Mr-billedbehandlings protokol på MS Imaging Facility. Udføre MRI på en 3 T eller 7 T Imager. Bemærk: Prioritet er givet til 3T som størstedelen af Legacy data er blevet udført på 3 T, men når de ikke er tilgængelige, Imaging udføres med 7T. De angivne kerne sekvenser udføres i alle tilfælde (tabel 1), og yderligere sekvenser, der afhænger af aktuelle forskningsinteresser, udføres, hvis tiden tillader det (begrænset ved at opnå vævs fiksation mindre end 12 timer efter døden). Tabel 1 beskriver kerne sekvenserne.</li>
</ol>2. obduktion
Bemærk: Efter in-situ MRI transporteres kroppen til lighuset for hjerne-og rygmarv ekstraktion af en Diener og vævs behandling af Lab medlemmer.
<ol><li>Udfør følgende trin før kroppens ankomst til lighuset. To timer før, Forbered 3 L af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) og etiket beholdere og poser til vævs opbevaring. Forbered 3 L af 8% PFA og fortyndet 1,5 L 8% PFA til 4% PFA. De resterende 8% PFA placeres i 4 °C for dag 2.</li>
	<li>Før du rejser til lighuset, fyldes 2 rejse kølere til 50% kapacitet med tøris (store blokke brudt til at passe og små pellets).</li>
	<li>På lighuset, fylde en rustfri-stålbeholder halvvejs med 2-methylbutan og tøris og dække med et låg som forberedelse til snap frysning vævet.</li>
	<li>Afvejes og fotograferer hjernen, når den er fjernet ved Diener.</li>
	<li>Anbring enhver vedhæftet Dura i en beholder fyldt med PFA.</li>
	<li>Adskille cerebellum og hjernestammen fra cerebrum og fotografere cerebrum.</li>
	<li>Identificer syns nerverne, chiasm, og skrifter og adskille ved hjælp af en sonde og pincet. Resect strukturen med en skalpel. Bemærk: Den distale segment af den ene side af synsnerven er markeret med Higgins blæk til identifikation.</li>
	<li>Adskil de hjernehalvdele i længderetningen og fotograferer hver enkelt halvkugle enkeltvis.</li>
	<li>Blæk den primære motor cortex (PMC) for den venstre halvkugle, re-fotografere det, og placere den i en 3,3 L container til lang fiksation. Dokumentere starttidspunktet for hjerne fiksation.</li>
	<li>PMC for den højre halvkugle kan være inked eller skåret.
	<ol>
<li>Hvis der fjernes, først fjerne dækker meninges.</li>
		<li>Re-fotografi inked eller fjernet PMC.</li>
		<li>Hvis PMC er fjernet, skæres i 6 lige store sektioner.</li>
		<li>Blæk det rostrale aspekt af hver sektion.</li>
		<li>Placer sektioner med ulige nummerering i PFA-fyldte beholdere til kort fiksering.</li>
		<li>Snap-fryse jævnt nummererede sektioner og sted i forseglede fryseposer i køligere #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Skær højre halvkugle forreste til posterior i 1 cm-tykke koronale sektioner.
	<ol>
<li>Dokumentere grove abnormaliteter (f. eks. skære artefakt, blødning og læsioner).</li>
		<li>Placer ulige nummererede sektioner i beholdere fyldt med PFA for kort fiksering.</li>
		<li>Snap-fryse jævnt nummererede sektioner og sted i forseglede fryseposer.</li>
		<li>Dokumentets afslutning af hjernens fikserings tidspunkt.</li>
	</ol></li>
	<li>Adskil hjernestammen fra cerebellum, og Placer den i en PFA-fyldt beholder til kort fiksering.
	<ol>
<li>Separate cerebellare halvsfærer i længderetningen.</li>
		<li>Skær hver halvkugle i 4 lige tykke sagittale sektioner.</li>
		<li>Fotografi mediale og laterale synspunkter.</li>
		<li>Placer venstre cerebellar hemisfærisk skiver i en container fyldt med PFA for kort-fiksering.</li>
		<li>Snap-fryse højre cerebellar hemisfærisk skiver og sted i forseglede fryseposer i køligere #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Få rygmarven med nerve rødder fra Diener.
	<ol>
<li>Fjern rygmarven dura mater og opbevar Dura i en beholder med PFA.</li>
		<li>Adskille venstre og højre forreste og posterior nerve rødder. Skær den venstre forreste og bageste nerve rødder skåret fra rygmarven og sted i en PFA fyldt beholder til kort fiksering.</li>
		<li>Skær de højre forreste og bageste nerve rødder fra rygmarven, snap-Freeze, Placer i forseglede fryseposer, og Placer derefter i køligere #2.</li>
		<li>Fotografere den caudale-mest 20 cm af rygmarven. Dokumentere placeringen af lænde udvidelsen.</li>
		<li>Skær 2 cm tværgående sektioner af ledningen fra caudal til rostral.</li>
		<li>Blæk det rostrale aspekt af hver snit sektion.</li>
		<li>Placer ulige nummererede sektioner i beholdere fyldt med PFA for kort fiksering.</li>
		<li>Snap-fryse lige nummererede sektioner, sted i forseglede fryseposer, og derefter placere i køligere #2.</li>
		<li>Dokumentere starttid for rygmarv fiksering og eventuelle grove abnormiteter.</li>
		<li>Fotograferer den resterende rostrale del af rygmarven.</li>
		<li>Dokumentere positionen af den cervikale udvidelse. Følg trin 2.13.5 – 2.13.8 for den resterende rygmarv.</li>
	</ol></li>
	<li>Efter lighuset sted frosne væv i mærkede kasser i-80 °c frysere. Opbevar fast vævet ved 4 °C.</li>
	<li>Ved 24 timer efter obduktion (dag 2) fortyndes de resterende 8% PFA til 4%.</li>
	<li>Udskift 4% PFA i fikserings beholdere med frisk fortyndet 4% PFA.</li>
	<li>Ved 60 h efter obduktion forberede opløsninger af 2,5% glutaraldehyd i 4% PFA fra glutaraldehyd, PFA, dH2O og sorens's buffer (fremstillet ved blanding i rækkefølge: 0,2 M fosfatbuffer pH 7,4, polyvinylpyrolidon 1% w/v, saccharose 30% w/v, og ethylenglycol 30% v/v).</li>
	<li>Fjern brugte 4% PFA fra kort fikserings beholdere.</li>
	<li>Skyl vævet i Sorens's buffer, og Placer det i kryoprottionsopløsning (glycerol 20%, 0,4 M Sorens's buffer 20% og 0,02% natriumazid i dH2O).</li>
	<li>Fotografer korte hjerne skiver, cerebellum, hjernestammen og motorisk cortex (hvis relevant).</li>
	<li>Med en skalpel klinge skåret 2 mm tykke tværgående sektioner fra hver 2 cm kort-fast rygmarv sektion.</li>
	<li>Placer sektioner i 2 mL scintillationshætte glas og fyld med opløsning på 2,5% glutaraldehyd i 4% PFA.</li>
	<li>Returner den resterende del til det originale 20 mL scintillationshætte glas. Skyl afsnittet med Sorens's buffer og Udskift med kryoprotection opløsning.</li>
</ol>3. patologi
Bemærk: Korte skiver af den højre halvkugle samt den lang faste venstre halvkugle (placeret i 4% PFA i flere måneder) er enten skåret i 30 μm sektioner (benævnt fritflydende) eller indlejret i paraffin og skåret som 12 – 14 μm sektioner (benævnt paraffin-indlejret). Disse sektioner behandles sædvanligvis med proteolipid protein (PLP) til påvisning af demyelinerende læsioner og Major komplekse Complex II (MHC-II) for immunaktivitet ved brug af diaminobenzidin (DAB)-metoden. Disse protokoller er blevet standardiseret og anvendt i flere publikationer2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12.
<ol><li>
Fritflydende (30 μm) DAB-Avidin-biotin Complex (ABC) vævs farvning
	<ol>
<li>Fjern sektioner fra cryostorage Solution, Overfør sektioner til en seks-brønd plade, og vask dem 3x for 5 min hver i 2 mL 1x fosfat Buffered saltvand pH 7,0 (PBS). Når du overfører til den næste brønd i de seks-brønd plade bruge omhu ikke at rive vævet. Under hver vask og inkubations trin skal du placere seks-brønden på en shaker og lade vævet forsigtigt ryste. Bemærk: Vævs sektioner inkuberet i mindre mængder og i større plader (dvs. 12-og 24-brønd plader) har tendens til at udstille overflade og kant rive.</li>
		<li>Udfør antigen udtagning ved mikrovindende sektioner i et glasbæger, der indeholder ca. 30 mL 10 mM citratbuffer (pH 6,0). Sørg for, at vævene ikke foldes ved at manipulere med en pensel og mikrobølge sektioner for 2 – 3 min eller indtil citratbuffer kommer begynder at koge. Lad sektioner køle af til stuetemperatur (~ 20 min).</li>
		<li>Overfør sektioner tilbage til en seks-brønd plade og vask sektioner 3x for 5 min hver i 2 mL PBS/0,3% Triton X-100. Bloker endogene peroxidaser ved at inkuberere sektioner i 2 mL 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).</li>
		<li>Vask sektioner 3x for 5 min hver i 2 mL PBS/0,3% Triton X-100. Blok sektioner i 2 mL af 3% normalt gede serum/0,3% Triton X-100/1x PBS for 1 h ved RT.</li>
		<li>Incubate sektioner natten over til 5 dage (afhængigt af antistoffet) i primære antistoffer rettet mod microglia og myelin epitoper til påvisning betændelse (mhcii) og demyelinering (PLP) (Se tabellen over materialer) ved 4 °c. Bemærk: Sørg for, at sektioner ikke foldes, når de inkuberer i dette trin eller efterfølgende trin, da dette vil føre til, at områder inden for afsnittene er ugyldige af pletter.</li>
		<li>Vask sektioner 3x for 5 min hver i 2 mL 1x PBS. Derefter inkuberes sektioner i sekundære biotinylerede antistoffer (Se tabellen over materialer) i 1 time ved rt. Forbered Avidin-biotin Complex (ABC)-opløsningen under inkubation ca. 45 min før næste vask trin for at tillade ABC komplekser at danne.</li>
		<li>Vask sektioner 3x for 5 min hver i 2 mL 1x PBS. Derefter inkubere sektioner i ABC for 1 h ved RT.</li>
		<li>Vask sektioner i 2 mL 1x PBS tre gange i 5 min hver. Inkuber sektioner i filtreret DAB (2 mL/brønd/sektion), der indeholder H2o2 (1:500 fortynding på 30% H2o2 i DAB), indtil farven udvikler sig tilstrækkeligt (~ 3 – 8 min).</li>
		<li>Vask sektioner 3x for 5 min hver i 2 mL 1x PBS. For at forbedre signalet (valgfrit), osmicate ved hjælp af 0,04% OsO4 (~ 30 s).</li>
		<li>Vask sektioner tre gange i 5 minutter hver i 1x PBS. Individuelt, Overfør hver sektion fra seks-brønd pladen til en lille beholder fuld af 1x PBS og Placer vævs afsnittet på et glas skred så fladt som muligt.</li>
		<li>Løft forsigtigt sliden ud af PBS, samtidig med at vævs afsnittet er så fladt som muligt. Brug to malings børster til forsigtigt at flade og strække vævet ud på sliden og dup det overskydende vand væk med papirhåndklæde. Monter vævs sektioner med glycerol (eller et tilsvarende monterings medie), og forsegl dæksedlen med klar neglelak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. paraffin-indlejrede halvkugleformede sektioner: DAB-farvning
<ol><li>Smelt paraffin af gliderne i en 60 °C ovn i 5 – 10 minutter.</li>
	<li>De-paraffinize sektioner ved inkuberet i xylen 3x for 5 min hver.</li>
	<li>Rehydreret væv i klassificeret ethanol ved 100% (2x for 5 min hver), 95% (2x for 5 min), 70% (2x for 5 min hver), og 50% (1x for 5 min hver). Cover slides i PBS.</li>
	<li>Antigen hentes med mikrowaving-slides i et bægerglas med 10 mM citratbuffer (pH 6,0).</li>
	<li>Vask slides i 1x PBS (3x for 5 min hver), når afkølet til stuetemperatur. Bloker endogene peroxidaser ved at inkuberere væv i 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS i 30 min.</li>
	<li>Vask vævet i 1x PBS tre gange i 5 min hver. Blok væv med 6% normalt ged serum i PBS for 1 h.</li>
	<li>Inkuber sektioner i primært antistof (Se tabellen over materialer) i PBS ved stuetemperatur (RT) natten over (maks. 20 h).</li>
	<li>Vask sektioner 3x for 5 min hver i 1x PBS. Derefter inkubere sektioner i tilsvarende sekundært antistof (Se tabellen over materialer) i PBS for 1 t ved rt.</li>
	<li>Forbered ABC-opløsning ca. 45 min før næste vask trin under inkubation.</li>
	<li>Vask sektioner 3x for 5 min hver i 1x PBS og derefter inkubere i ABC for 1 h ved RT.</li>
	<li>Vask sektion 3x i 5 min hver i 1x PBS.</li>
	<li>Inkuber sektioner i filtreret (0,45 μm filter porestørrelse), der indeholder H2o2 (1:500 fortynding af 30% H2o2 i DAB), indtil farven udvikler sig tilstrækkeligt (~ 3-8 min).</li>
	<li>Vask sektioner (3x 5 min) i 1x PBS. For at øge signalet, osmicate ved hjælp af 0,04% osmium dinitrogentetraoxid (OsO4; ca. 30 s).</li>
	<li>Vask sektioner (3x 5min) i 1x PBS.</li>
	<li>Dehydrat vævet i en graderet serie af ethanol 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min) og 100% xylen (1x 5min). Lad xylener fordampe.</li>
	<li>Monter sektioner med toluen-baserede hurtige tørre monterings medier. Formuleringer, der indeholder anti-oxidanter anbefales for at forhindre pletter blegning. Fjern overskydende monterings medie fra slide kanter med en barberkniv for efterfølgende opbevaring.</li>
</ol>5. MRI/patologi korrelationer
Bemærk: For korrelation MRI med patologi, vi først udføre ex vivo MRI af den lang faste intakt hjerne halvkugle (trin 2,9 ovenfor) i en justerbar boks med MRI-synlige markører indikerer udskæring slots. Vi skærer derefter hjernen og fotograferer de 1 cm skiver for at muliggøre medregistrering af in situ-MRIs til de enkelte hjerne skiver. Vi kan derefter udføre MRI-guidede analyser, hvor regioner af interesse (ROIs) er identificeret på MRI til direkte vævsanalyse. Vi kan også udføre histopatologiske-guidede analyser, hvor ROIs er identificeret på væv (f. eks. hvide stof læsioner, hvidt stof uden demyelination osv.) og derefter karakteriseret ved de Co-lokaliserede MRI-målinger (tabel 1).
<ol><li>
Identifikation af MRI-baserede ROIs Bemærk: i tidligere undersøgelser har vi identificeret Rois i hvidt stof11,12,13,14,15 og grå stof16,17, 18. eksemplet nedenfor er til analyse af hvidt stof.<ol>
<li>Segment T2 hyperintense læsioner på in situ MRIs (fra trin 1,1), oprindeligt behandlet af en automatisk algoritme, og derefter korrigeret manuelt af erfarne brugere.</li>
		<li>Segment T1 hypointense læsioner inden for T2-læsioner som voxels med en signalintensitet mindre end eller lig med 80% af signal intensiteten af det omgivende, normalt forekommende hjernevæv.</li>
		<li>Segment hypointense områder i kort over overførings ratio (MTR) med en tærskel på 80%.</li>
		<li>Opret tre klassifikationer ved hjælp af ovenstående segmenteringer: (a) kun T2-læsioner, som er unormale ved T2-vægtede/FLAIR-scanninger, men normale på T1-vægtede eller MTR-scanninger, (b) T2T1MTR-læsioner, som er unormale på alle de T2-vægtede/FLAIR-, T1-vægtede og MTR-scanninger; og (c) normal-optræder hvidt stof (NAWM), som er normal på alle T2-vægtede/FLAIR, T1-vægtet, og MTR scanninger. Bemærk: Vores udvalg af udsnit er baseret på eksistensen af alle tre typer af interesseområder (T2-only, T2T1MTR og NAWM) på de samme udsnit.</li>
		<li>Beregn normaliserede intensiteter for hvert ROI for at minimere variabiliteten fra forskellige hjerner og forskellige hjerne steder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Co-registrering af in-situ-MRI til hjerne skiver
	<ol>
<li>Scan den faste hjerne halvkugle i en brugerdefineret udskæring boks med fire rækker af MRI-følsomme markører lokaliserer slots, hvor en kniv kan indsættes for at skære hjernen. Udfør en T1-vægtet 3D MPRAGE-anskaffelse med 1 mm isotropisk opløsning, der dækker den faste hjerne og alle markører. Bemærk: Dette kaldes efter fikserings-MRI og anvendes kun som et mellemliggende trin til medregistrering af in situ-Mri'er til hjerne skiver.</li>
		<li>Umiddelbart efter scanningen, Skive hjernen halvkugle i Slots placeret 1 cm fra hinanden, hvilket resulterer i ca 15 skiver.</li>
		<li>Fotografere hjerne skiver på både forreste og bageste sider.</li>
		<li>Medregistrér in situ-MRI og fotografier af hjerne skiver med følgende trin.<ol>
<li>For segmentering af efter fiksering og in situ-MPRAGE, forbehandling både efter fiksering og in situ MPRAGE MRIs for intensitet ikke-ensartethed19.<ol>
<li>Segmentér hjernen og fire rækker af markører fra forbehandlet post fikserings-MPRAGE.</li>
				<li>Segmentér den halvkugle, som svarer til den efter fiksering MRI20,21 fra den forbehandlede in situ-mprage.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Medregistrér de hjerne ekstraherede in situ-og post fikserings-Mri'er gennem en række lineære registreringsprocesser op til 12 grader af frihed (Affin registrering) ved hjælp af FSL FLIRT22. Komponenterne til skalering og klipning tegner sig for virkningen af en fikserings svind.</li>
			<li>Find den normale retning for udskæring-flyet ved at minimere summen af de maksimale forventede intensiteter ved hjælp af segmenterede markører. Disse re-orientering vinkler er indarbejdet i den omdannelse matrix opnået fra det foregående trin.</li>
			<li>Visuelt matche Mr-billeder til fotografier af faste bageste hjerne skiver ved hjælp af en in-House Billedfremviser, der giver mulighed for at ændre dybden og retningen af de normale vektorer. Små modifikationer er nødvendige, fordi hjernen udskæring er ufuldkomment.</li>
			<li>Påfør Affin billed transformation13 for hvert udsnit for at omdanne in situ-mri'er til de samme udskæring-steder som fotografierne af hjerne skiverne.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1-/T2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis.">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li><li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Vi beskriver en protokol, der er blevet brugt til hurtigt at skaffe og bearbejde væv fra over 150 personer med MS. Et vigtigt træk ved denne protokol er, at forskerne, der udnytter vævet, også er ansvarlige for at etablere protokollen og udføre vævs samlingen. Dette giver fleksibilitet til at opfylde de videnskabelige behov i de enkelte forskningsprojekter. Flere aspekter af denne protokol forbedre dens nytte. Patienterne er normalt velkarakteriserede før døden, da mange af dem er blevet efterfulgt af neurologer i vores Center. Et kritisk skridt er behandlingen af vævsdonationer kort efter døden, hvilket øger kvaliteten af det frosne væv i forhold til nogle andre hjerne banker. Dette muliggør molekylære undersøgelser, der er af stor værdi for at beskrive ændringer i transkriptionelle og translationelle genprodukter, som er væsentlige for dokumentation af histologiske og immunocytokemiske observationer. Gearing af morfologiske/immunocytokemiske og molekylære data på tværs af flere tilfælde øger pålideligheden af konklusioner. Dette illustreres bedst af vores beskrivelse af mitokondrie gen ændringer i hjernebarken og neuronal gen ændringer i demyelineret hippocampi. Nye genprofilerings protokoller udvikles hurtigt, og det frosne væv i vores bank bør give høj kvalitet RNA til vævs-og enkelt celle analyse.
Et andet værdsat aspekt af vores protokol er de kort faste hjerne skiver. Disse væv er skåret i 30 μm-tykke, fritflydende sektioner. Disse sektioner er ideelle til brug af Konfokal mikroskopi til at analysere to eller flere antigener i tre dimensioner. Gode eksempler omfatter samspillet mellem præ-myelinating oligodendrocyte processer med dystrofisk axoner i kroniske MS-læsioner, samt identifikation af enkelt-axonal forbindelser til transected axonal tilbagetrækning pærer. Dette er i modsætning til rutinemæssig brug af 7 μm-tykke paraffin sektioner, hvor 3D-billeder ikke er gennemførlige. Paraffin-indlejret væv har stor værdi for nogle spørgsmål, især kvantificering af neuronal tætheer i hemisfærisk 7 μm-tykke sektioner. Vores vævs forarbejdnings protokoller er derfor forskellige og giver fleksibilitet til at sikre faste og hurtigt frosne væv.
Et andet unikt træk ved vores protokol er den postmortem in situ-hjerne-MRI. Hjernen MRIs er en uerstattelig biomarkør af MS disease. Det er derfor vigtigt at etablere de patologiske korrelater af unormale MRI-signaler. Vores undersøgelser har påvist, at både T2 og T2T1MTR ROIs ofte er myelinerede. Dette fund understøtter behovet for mere specifikke billedbehandlings metoder, der pålideligt skelner mellem myelineret og demyelineret cerebral hvidt stof. MRI synes at være følsom for påvisning af myelin, men vores undersøgelser viser, at selv en kombination af T1/T2/MTR ikke er specifik for at identificere myelination. Vores post mortem-protokol giver en ideel platform til afprøvning af muligheden for nye billedbehandlings metoder til at skelne mellem myelineret og demyelineret cerebral hvidt stof. MRI giver også det ideelle køretøj til oversættelse af grundlæggende videnskabelige resultater til klinisk praksis, i betragtning af brugen af MRI i vores Translationel forskning og dens udbredte kliniske brug i levende patienter.
Mens skære kort-og lang-fast samt frosne skiver giver en fordel for behandling af væv i flere tilstande for forskellige undersøgelser, der er nogle begrænsninger med denne metode. En vurdering af hele en struktur kan være begrænset, da dele af den kan behandles forskelligt på tilstødende skiver. Den store mængde af vævs banken, dog, giver mulighed for at undersøge en struktur af interesse i flere til at forbedre prøvetagning. En anden generel begrænsning af undersøgelser, der udnytter postmortem væv, er, at de er tværsnits. Konklusioner vedrørende timing og progression af ændringer skal fortolkes i denne sammenhæng. Der kan være en udvælgelse bias til patienter, der donere deres væv, som kan begrænse generalisering af data til alle patienter med MS. Da de fleste donorer dør af komplikationer af avancerede MS, kan det ikke være hensigtsmæssigt at ekstrapolere fund fra disse patienter til dem i tidligere stadier af MS. Ikke desto mindre har vi modtaget væv fra yngre patienter, der døde af ikke-MS-relaterede sygdomme (dvs. akut myokardieinfarkt, overdosering af lægemidler, selvmord). Anvendelsesområdet for vores protokol omfatter ikke prøvetagning af andre organer (f. eks. gastrointestinal og knoglemarv), som har været impliceret i MS. Vi mener, at styrkerne i programmet i høj grad opvejer dets begrænsninger.

En af de bedste måder at studere en sygdom på er at undersøge det sygdomsramte væv selv. Dette præsenterer udfordringer for dem, der studerer sygdomme i centralnervesystemet (CNS). Biopsier af syge hjerne og rygmarv er ekstremt sjældne og involverer normalt atypiske tilfælde. Obduktions rater for personer med CNS-sygdomme er faldet dramatisk i de seneste år, og når de udføres, de ofte ikke giver hurtig udtagning af væv. Disse udfordringer har resulteret i etableringen af sygdoms centrerede hjerne banker, herunder flere fokuseret på indsamling af væv fra personer med multipel sklerose (MS). MS er en inflammatorisk-medieret sygdom i CNS, der ødelægger myelin, oligodendrocytter (myelin danner celler), neuroner, og axons. De fleste MS patienter har en bi-phasic sygdom kursus, der starter med anfald af neurologiske handicap med variabel opsving, der i sidste ende udvikler sig til en gradvist progressiv sygdom, der er sandsynligt neurodegenerative i naturen1. For størstedelen af doneret MS hjerner, post mortem intervaller (PMI) mellem død og vævs behandling overstiger 24 h. Mens disse væv har givet værdifulde oplysninger om patologiske ændringer i MS hjerner, de er ikke egnet til mere avancerede molekylære undersøgelser, der kan give en effektiv indsigt i sygdoms patofysiologi. Dette er især tilfældet for genprofilering undersøgelser, som kræver intakt RNA.
For at overvinde begrænsningerne diskuteret ovenfor, har vi udviklet en hurtig vævs donation program, der giver mulighed for MRI/patologiske korrelationer. Denne protokol giver velbevarede væv egnet til moderne molekylære undersøgelser og giver mulighed for direkte sammenligning af hjernens patologi og MRI abnormaliteter i MS hjerner. Cleveland Clinic multipel sklerose vævs donation program har eksisteret i over 20 år. Denne hurtige vævs donation program indkøber hjerner og rygmarv fra personer med MS og andre tilknyttede autoimmune neurologiske tilstande. Programmet har til formål at opnå in situ MRIs inden 6 h af døden, efterfulgt af fjernelse af hjernen og rygmarven til vævs behandling.
Rekruttering Donationer opnås enten gennem præ-mortem-samtykke, der er indhentet direkte fra patienter (forhåndsgodkendt) eller fra pårørende efter døden. Præ-samtykkede patienter er typisk identificeret fra den kliniske population på mellen Center for multipel sklerose behandling og forskning i Cleveland, Ohio. Selv om præference i rekruttering i Rapid tissue donation program gives til patienter, der er blevet fulgt i longitudinale forskningsundersøgelser, det er åbent for alle patienter set i midten. Deltagere, der tilmelder sig før døden, får instrukser til familiemedlemmer eller omsorgs udbydere om at kontakte forskerholdet, enten på dødstidspunktet, eller når døden menes at være overhængende. Den anden metode for enkeltpersoner at komme ind i vævs donation program er på tidspunktet for døden gennem samtykke fra pårørende. Staten Ohio kræver dødsfald for at blive henvist til en føderalt bemyndiget organ indkøbsorganisation ved navnet LifeBanc, som opererer i 20 amter i det nordøstlige Ohio. LifeBanc skærme alle dødsfald for en diagnose af MS, som er en udelukkelse for organdonation. Der blev indført ordninger for LifeBanc til at underrette efterforskere fra MS tissue donation program for alle dødsfald med en tilhørende diagnose af MS forekommer inden for en 75-mile radius fra Cleveland Clinic. Næste af pårørende og hospitalspersonale bliver derefter kontaktet af vævs donation program personale og samtykke er opnået for donation af hjernen og rygmarven væv. Disse to metoder til rekruttering før og efter slagtning gennem LifeBanc resulterer i ca. 10-12 hjerne donationer pr. år. Der foretages justeringer af den øvre aldersgrænse for dødsfald for at styre antallet af henvisninger fra LifeBanc.
Indkøb af donationer Programmet kræver 24 h dækning, 365 dage om året af medlemmer af vævs donation program for væv indkøb. En centraliseret vævs donation Notification e-mail/pager/mobil enhed tekstbesked system bruges af det kliniske team, der dækker vævsdonationer. LifeBanc er leveret numre til at kontakte On-Call personale til vævs donation program. Medlemmer underrettes om dødsfald af hospitals udbydere/pårørende (forhåndsgodkendte) eller af LifeBanc og andre henvisningskilder. For det første er der en bestemmelse af dødstidspunktet og gennemførligheden af vævs donation. Dødsfald screenes derefter for forhold, der potentielt kan resultere i væv af dårlig kvalitet, herunder forlænget præ-mortem-hypoksi, massiv destruktiv hjernevæv (f. eks. stor intrakraniel blødning, omfattende bi-hemispheriske slagtilfælde, omfattende tumor forlænget respirations støtte (> 3 dage) og langvarig brug af vasoaktive stoffer (> 3 dage) før døden. Når en medicinsk eksaminator er involveret i en død, kan undersøgelsen neurolog tale med den medicinske eksaminator til at udforske en måde at modtage rettidig væv uden at kompromittere den medicinske eksaminator ansvar. Hvis levedygtige væv mærkes at være til stede, derefter skriftligt samtykke er opnået (hvis ikke opnået præ-mortem) og præparater er lavet til krops transport. En tidligere kontraheret afdøde transport service er derefter kontaktet for transport til MRI faciliteter på Cleveland Clinic. Der skal udvises forsigtighed for at sikre, at kroppen forbliver ved stuetemperatur og ikke anbringes i køleanlæg, da lavere krops temperaturer er forbundet med ændringer i MRI-signal egenskaberne.
Kliniske historie Kliniske historie omfatter oplysninger om diagnosticering af MS, debut af symptomer, behandlinger, der anvendes, resultater af kliniske og para-kliniske test (fremkaldt potentialer, cerebrospinalvæske resultater, optisk kohærens tomografi), multipel sklerose funktionelle komposit , og udvidet handicapstatus skala (EDSS, faktiske eller anslåede), som er indsamlet fra den medicinske Journal (hvor tilgængelig), og direkte interview af pårørende. Der indsamles også præ-mortem-MRI.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

Vi beskriver en hurtig vævs donation program for personer med multipel sklerose (MS), der kræver videnskabsfolk og teknikere til at være on-Call 24/7, 365 dage om året. Deltagerne giver deres samtykke til at donere deres hjerne og rygmarv. De fleste patienter blev efterfulgt af neurologer på Cleveland Clinic mellen Center for MS behandling og forskning. Deres kliniske kurser og neurologiske handicap er velkarakteriserede. Kort efter døden transporteres kroppen til MS Imaging Center, hvor hjernen scannes in situ med 3 T magnetisk resonans imaging (MRI). Kroppen overføres derefter til obduktions rummet, hvor hjernen og rygmarven fjernes. Hjernen er opdelt i to halvkugler. En halvkugle er straks placeret i en udskæring boks og suppleant 1 cm-tykke skiver er enten fastgjort i 4% PARAFORMALDEHYD i to dage eller hurtigt frosset i tøris og 2-methylbutan. De kort faste hjerne skiver lagres i en kryopreserverings opløsning og anvendes til histologiske analyser og immunocytochemical påvisning af følsomme antigener. Frosne skiver opbevares ved-80 °C og anvendes til molekylære, immunocytokemiske og in situ-hybridiserings-/RNA-Scope-studier. Den anden halvkugle er placeret i 4% PARAFORMALDEHYD i flere måneder, placeret i udskæring boks, genscannet i 3 T magnetisk resonans (MR) scanner og skåret i centimeter-tykke skiver. Postmortem in situ MR images (MRIs) er co-registreret med 1 cm-tykke hjerne skiver for at lette MRI-patologi korrelationer. Alle hjerne skiver er fotograferet og hjerne hvide stof læsioner identificeres. Rygmarven skæres i 2 cm segmenter. Alternative segmenter er fastgjort i 4% PARAFORMALDEHYD eller hurtigt frosset. De hurtige indkøb af postmortem væv giver mulighed for patologiske og molekylære analyser af MS hjerner og rygmarv og patologiske korrelationer af hjernen MRI abnormiteter. Kvaliteten af disse hurtigt forarbejdede postmortem-væv (normalt inden for 6 timer af døden) er af stor værdi for MS Research og har resulteret i mange high-impact opdagelser.

Som nævnt ovenfor, næsten halvdelen af den cerebral halvkugle er frosset og tilgængelig for molekylære undersøgelser ved hjælp af DNA, RNA, eller protein. Historisk set har undersøgelser med postmortem-hjernevæv vist sig at være påvirket af præ-mortem-tilstande, alder, køn, vævs-pH, mRNA-integritet (RIN), postmortem-interval (PMI), diagnostisk sikkerhed, brug af comorbidstof og forudgående medicinering status23. Baseret på undersøgelser ved hjælp af hjernevæv, DNA og protein synes at være påvirket af mindre grad i forhold til RNA. Baseret på vores erfaring, er RNA isolation og downstream analyse dog blevet fundet at være mest påvirket af præ-mortem betingelser og postmortem interval af hjernevæv. Vi diskuterer derfor nogle af de betingelser, der skal følges for at udføre RNA-baseret analyse ved hjælp af postmortem-væv.
For alle vores undersøgelser, efter at hjernen er indsamlet ved obduktion, det er skåret (1 cm tyk) og derefter enten fastgjort i 4% PARAFORMALDEHYD for morfologiske undersøgelser eller hurtigt frosset til biokemiske analyse. Alle vævs blokke er karakteriseret for demyelinering ved immun farvning ved hjælp af PLP som beskrevet ovenfor. Der er vist en repræsentativ analyseordning i figur 1. Vævs sektioner undersøges for tilstedeværelsen af hvide stof læsioner (figur 1a). Udvalgte regioner er farves for immunaktivitet (figur 1b) og demyelinering (figur 1c). Det frosne væv er monteret på kryostat (figur 1d) og frosne 30 μm sektioner skæres. Dette efterfølges af indsamling af 3-4 efterfølgende sektioner, adskillelse fra de tilstødende væv, og opbevaring for DNA, RNA, eller protein isolation. Ved hjælp af denne protokol, har vi med succes isoleret DNA24,25, RNA5,6,7,8,9 samt proteiner26. Mens de vigtigste resultater fra nogle af de undersøgelser, der analyserer RNA fra MS hjerner diskuteres, her er nogle af de spørgsmål i forbindelse med analyse af RNA postmortem hjernen hjerner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig1.jpg"> Figur 1: indsamling af prøver til mRNA-analyse. A) obduktions vævet udvælges til analyse. Områder af væv er valgt, og en del af vævet er skåret. Alle sektioner er plettet med (B) MHC-II (Major komplekse Complex (MHC) klasse II HLA-DR CR3/43) antistof til påvisning af inflammatorisk aktivitet og med (C) proteolipid protein (PLP) til at bestemme myelin status ved hjælp af offentliggjorte protokoller. Baseret på myelin-status, er blokken scoret af en skalpel (D). Sektioner (60 μm) skæres (E), og de områder, der tidligere er blevet scoret, fjernes, adskilles i rør og mærkes (F). PLP og MHC-II pletter gentages efter hver 5 sektioner for at sikre korrekt indsamling af væv. Normal optræder hvidt stof (NAWM) er noteret og hvide substans læsioner (WML) er skitseret i rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Axonal transektion i læsioner af MS10. Et indledende videnskabeligt fokus i dette program var på karakterisering af cellulære komponenter af demyelinerede hvide stof læsioner. Blandt antigener lokaliseret var ikke-fosforylerede Neuro filamenter (NFs). De fleste NFs er fosforyleret i myelinerede axoner. Ved demyelination er axoner defosforylerede. Vi opdagede det forventede udtryk for ikke-phosphoryleret NFs i demyelinerede axoner. I akutte MS-læsioner sluttede mange af disse demyelinerede axoner sig som axonal tilbagetrækning pærer (figur 2a), som afspejler de proksimale ender af transected axoner. Transekterede axoner overstiger 11.000 mm3 i de akutte læsioner sammenlignet med tilstødende normale regioner10. Disse observationer bidrog til at katalysere et paradigmeskift i MS Research, der flyttede marken mod karakterisering af neurodegeneration som den vigtigste årsag til permanent neurologiske handicap hos personer med MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig2.jpg"> Figur 2: Axonal transektion under inflammatorisk demyelination. Axonal transektion opstår under inflammatorisk demyelinering (a, arrowheads) og inducerer dannelse af Terminal Axonal stenkulsbriketter lignende (a, pile). Når kvantificeret (B), transected axoner er RIGELIGE i MS læsioner og synes at korrelere med inflammatorisk aktivitet af læsion. Panel A gengivet fra Trapp et al.10 med tilladelse. Rød: proteolipid protein, grøn: anti nonfosforyleret Neuro filament. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Remyelination i kronisk MS hjerner3. Remyelination kan være robust i de tidlige stadier af MS. Mange kroniske MS læsioner, dog, er ikke remyelineret. Vi undersøgte, om tilstedeværelsen af oligodendrocyte progenitorceller (OPCs) eller genereringen af nye oligodendrocytter begrænser remyelinering af kronisk demyelinierede hvide stof læsioner. Mens OPC-tætheden ofte var faldet, var de til stede i alle kronisk demyelinerede læsioner3. Nyligt genererede oligodendrocytter var også til stede i mange kroniske MS læsioner. Oligodendrocyte processer forbundet med, men ikke myelinate demyelaterede axoner (figur 3). Disse undersøgelser indikerer, at OPCs og deres evne til at producere nye oligodendrocytter ikke begrænser remyelinering af kroniske hvide stof læsioner. Vi hypotese, at de kronisk demyeliniserede axoner, som ofte optrådte dystrofisk, var ikke modtagelig for remyelinering af nyligt producerede oligodendrocytter.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig3.jpg"> Figur 3: processer af præ-myelinating oligodendrocytter forbundet med axons. Konfokale mikrografer af MS-læsioner, der er plettet med PLP-antistoffer (rød i paneler a, b) og Neuro filament antistoffer (grøn i paneler a, b) vises. Et præ-myelinerende oligodendrocyt (rødt i panel A) i den subventrikulære zone (SVZ) udvidede processer ind i regionen med demyelineret axoner (grøn i panel A) i en kronisk MS læsion. Mange af disse processer (pile i panel A) spirede omkring axoner, som vist ved højere forstørrelse (panel B). Skala stænger repræsenterer 20 μm (A) og 5 μm (B). Gengivet fra Chang et al.3 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Mitokondriel dysfunktion i MS6. Vi udførte en upartisk søgning efter neuronal gen ændringer i hurtigt-frosne motor cortex opnået fra kroniske MS patienter (figur 4a). En upartisk søgning af dette datasæt identificerede signifikante reduktioner i 23 nukleare kodede mitokondrielle Mrna'er i MS (figur 4b). Ved hjælp af studier med immunocytokemi og in situ-hybridisering indikerede man, at disse gener var stærkt beriget med kortikale projektions neuroner (figur 4c), og at mitokondrier isoleret fra projektions-axoner viste reduceret glykolyse ( Figur 4d). Dette papir katalyserede et fokus på mitokondriel dysfunktion og reducerede ATP produktion som en stor bidragyder til axonal degeneration i MS.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig4.jpg"> Figur 4: mikroarray data og downstream-validerings teknikker udført i MS motor cortex. (A) hierarkisk klyngedannelse af væsentligt ændrede udskrifter fra kontrol (C1-C6) og SPMS (MS1-MS6) motoriske cortex prøver, der hver for sig understøtter sygdomsrelaterede genekspressions mønstre. Blandt de reducerede transkriptioner i MS motor cortex tilhørte twenty-Six elektrontransportkæden (B). Mitokondriel kompleks i (NDUFA6) mRNA blev nedsat i neuroner (n = 55-130) i MS motor cortex (CII) sammenlignet med Control (CI), mens PLP mRNA tætheder var ens mellem kontrol (CIII) og MS (CIV) hjernebarken. Aktiviteten af elektrontransport komplekser i og III blev reduceret i mitokondrie-berigede fraktioner fra motorisk cortex hos MS-patienter (n = 3) (D). Genoptrykt fra Dutta et al.6 med tilladelse. Fejllinjer repræsenterer SEM; Scale bar i CI-IV er 25 μm. * p < 0,05 elevernes t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Patogenesen af kognitiv dysfunktion i MS8. 40 til 60% af MS patienter har kognitiv tilbagegang og reduceret udøvende funktion. Vi identificerede hippocampus, som er et funktionelt site af hukommelse/læring, som et fælles sted for demyelinering i MS. Vi næste sammenlignede neuronal genekspression i myelineret og demyelineret hippocampi og fandt betydelige reduktioner i neuronal mRNAs kodning proteiner involveret i hukommelse/læring. Vi forlængede disse data ved at demonstrere, at udvalgte microRNAs er øget i demyelineret hippocampus, og at disse microRNAs kan nedsætte ekspression af glutamat receptorer. Vi har gengivet og udvidet disse observationer i gnaver modeller. Vi næste sammenlignede neuronal genekspression i myelineret og demyelineret hippocampi og fandt betydelige reduktioner i neuronal mRNA kodning proteiner involveret i hukommelse/læring.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig5.jpg"> Figur 5: vævs opsamling, histologisk analyse og genekspressions studier i MS hippocampus. Hjernen skiver, der indeholder hippocampus er valgt under obduktion (A) og hippocampus og tilstødende region er fjernet (rød boks) til yderligere analyse. Immunofarvning af PLP viste, at myelin blev konserveret i al kontrol (B) og 40% af MS hippocampi (C). Der blev påvist omfattende demyelinering i ~ 60% af MS hippocampi (D). Sammenlignet med kontrol hippocampi (E, G, I), blev der ikke påvist signifikant neuronal tab i de områder af den Demyelinerede MS hippocampi (F, H, J), som det fremgår af HuR Immunhistokemi. Dobbelt mærkning immunofluorescenstest for myelin (myelin grundlæggende protein (MBP), grøn) og axoner (SMI32, rød) viste tab af myelin (L) med relativ konservering af axoner (N) i MS demyelineret hippocampus sammenlignet med kontrol hippocampus ( MBP, K; SMI32, M). Dual klyngedannelse af mRNA-udtryks niveauer arrangerede prøver i diskrete klynger baseret på myelin-status (myelineret og demyelineret) og placering (hippocampus vs. motor cortex) (O). Høje mRNA-niveauer angives med rødt og blåt angiver lave udtryks niveauer. Paneler C-O er tilpasset fra Dutta et al.8 med tilladelse. B-D: 2 mm, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig5large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Patologiske korrelater af MRI ændringer12. Mens MRI er en værdsat indikator for MS diagnose og respons på behandling, og er også en forudsigelse af MS sygdomsprogression, de patologiske korrelater af Mr-ændringer er dårligt forstået. Vores postmortem MRI-studier har fokuseret på to MRI-ROIs. Cerebral hvidt stof ROIs, der var kun T2 hyperintens (T2 kun) og ROIs, der havde en kombination af T1 hypointensity, T2 hyperintensitet, og reduceret magnetisering overførsel ratio (MTR) (T2T1MTR). Ca. 45% af den cerebrale hvide substans T2-only ROIs var myelineret, hvilket bekræfter deres ikke-specifikke karakter. I modsætning hertil var 83% af T2T1MTR ROIs kronisk demyelineret og optrådte som sorte huller. T1 og MTR værdier er semi-kvantitative og deres værdier varierede udførligt i T2T1MTR ROIs. Hvis tabet af myelin er den eneste bidragyder til disse Mr-ændringer, skal værdierne være konstante. Hævede demyelinerede axoner korreleret med både T1 og MTR værdier.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig6.jpg"> Figur 6: overførings forhold for magnetisering (MTR) og T1-kontrastforhold lineært korrelerer med procentdelen af na+/K+ ATPase-positive AXONER i kroniske MS-læsioner. Kronisk demyelinerede læsioner for Na+/K+ ATPase (grøn) varierede fra næsten 100% (A) til nul (B) i Neuro filament (rød). Mange axoner uden na+/K+ ATPase havde forhøjede diametre (B). En sammenligning af procentdelen af na+/K+ ATPase-positive axoner i kronisk DEMYELINEREDE MS-læsioner korreleret med kvantitativ postmortem MTR (p < 0,0001, C) og T1 kontrastforhold (p < 0,0006, D). Hvert datapunkt er fra en enkelt læsion, og hver unik kombination af farve symboler betegner en af de undersøgt hjerner. Skalaer stænger = 5 μm. gengivet fra Young et al.12 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Neurodegeneration uafhængig af demyelinering11. Historisk set er neurodegeneration i MS blevet anset for at skyldes demyelination. Brain Imaging undersøgelser, dog, har rejst muligheden for, at neurodegeneration og demyelinering kan være uafhængige begivenheder. Vi har for nylig identificeret en delpopulation af MS-patienter, der har demyelinering af rygmarven og hjernebarken, men ikke af den cerebrale hvide substans. Vi har opfundet denne MS under type som myelokortical MS (MCMS). MCMs tilfælde leverede en platform til at undersøge forholdet mellem cerebral hvide substans demyelinering og kortikale neuronal tab. Sammenlignet med kontrol corticer, kortikale neuronal tab var signifikant større i MCMs corticer end i typiske MS corticer. Control Brain tissue blev hentet fra patologi afdelingen på Cleveland Clinic. Denne undersøgelse giver den første patologiske beviser for neurodegeneration i fravær af demyelination.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig7.jpg"> Figur 7: neuronal tab i fravær af cerebral hvid-stof demyelination. En cresylacetat violet-plettet koronal hemisfærisk sektion fra en person, der er klassificeret som havende typiske MS (A). Neuronal tætheder blev sammenlignet i kortikale lag III, V og VI i hvert af de fem mærkede områder. Neuroner med et område større end 60 μm2 (gul) er vist i et repræsentativt billede fra den overlegne temporale cortex (B). Mærkning for PLP og fordelingen af demyelinierede læsioner (demyelinering af hvidt stof er fremhævet med blåt; subpial demyelinering er fremhævet med pink) i halvkugleformede sektioner fra personer med typiske MS (C) og myelokortiske MS (D ) vises. En signifikant sammenhæng mellem reduceret kortikale neuronal tæthed og øget cerebral hvide stof læsion volumen blev fundet i typiske MS, men ikke i myelokortiske MS (E); stiplede linjer angiver 95% konfidensinterval (CI). IFG = ringere frontal gyrus. STG = Superior Temporal gyrus. INi = ringere Insula. INs = Superior Insula. CG = cingulate gyrus. Gengives fra Trapp et al.11 med tilladelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Varighed af sekvens</td>
			<td>Beskrivelse af sekvens</td>
			<td>Sekvens brug</td>
		</tr>
<tr>
<td>0:09</td>
			<td>Localizer</td>
			<td>Lokalisering for efterfølgende sekvenser</td>
		</tr>
<tr>
<td>9:14</td>
			<td>3D magnetisering forberedt hurtig gradient ECHO (MPRAGE)</td>
			<td>Strukturel billeddannelse volumetrisk vurdering af hjernestrukturer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:14</td>
			<td>3D Fluid svækket inversion Recovery (FLAIR)</td>
			<td>Læsion identifikation læsion segmentering volumetrisk læsion vurdering</td>
		</tr>
<tr>
<td>2:35</td>
			<td>2D T2-vægtet</td>
			<td>Læsion identifikation læsion segmentering volumetrisk læsion vurdering</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:12</td>
			<td>3D gradient-tilbagekaldt ekko med magnetiserings overførsel pre-Pulse, (MT-ON)</td>
			<td>Påståede mål af myelin indhold i normal optræder og hud væv</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:12</td>
			<td>3D gradient-tilbagekaldt ekko uden magnetiserings overførsel præ-puls, (MT-OFF)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0:27</td>
			<td>Tilknytning af diffusions tensor Imaging (DTI)</td>
			<td rowspan="3">Måling af vand diffusion i hjernevæv menes at afspejle hjernens væv integritet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10:27</td>
			<td>Diffusion tensor Imaging (DTI) multi-shell</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:18</td>
			<td>Diffusion tensor Imaging (DTI) multi-shell</td>
		</tr>
<tr>
<td>39:48:00</td>
			<td>SUBTOTAL: KERNE</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: protokol for postmortem Imaging.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Multipel sklerose er en inflammatorisk demyelinerende sygdom uden helbredelse. Analyse af hjernevæv giver vigtige fingerpeg til at forstå patogenesen af sygdommen. Her diskuterer vi den metode og downstream analyse af MS Brain tissue indsamlet gennem en unik Rapid obduktion program i drift på Cleveland Clinic.

Omfattende obduktions program for personer med multipel sklerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Målet med vores forskning er at studere patogenesen af multipel sklerose. For at nå dette mål har vi etableret en hurtig obduktion program for at opnå og studere hjerner fra personer med MS. Der er to særlige aspekter af vores obduktion program, den første er, at det er hurtigt. Vi samler hjernens under seks til otte timers død.Dette giver mulighed for state of the art molekylære undersøgelser. Det andet aspekt er, at vi gør en in situ MR, før vi flytter hjernen. Dette giver os mulighed for at korrelere patologiske ændringer med hjernen billeddannelse ændringer.Visuel demonstration giver seerne mulighed for at forstå, hvordan vi organiserer vores rum og tid for at opnå optimale resultater. Vævsbehandling, der sker hurtigt og omhyggeligt giver mulighed for RNA-analyse, immunstaining, immunoblotting og MR-korrelationer. Nye forskere kan kæmpe med behandling af væv med dårlig vævintegritet.Undgå lange post mortem fiksering gange er vigtigt, og MR-væv corde riller kan være udfordrende, så samråd med MR-analyse eksperter kan være meget nyttigt. Demonstrationen af proceduren vil være Emilie Christie og Christina Volsko. Teknikere fra vores laboratorium.Efter In situ magnetisk resonans imaging, veje og fotografere hjernen og placere eventuelle påsatte dura i en beholder med 4% Paraformaldehyd eller PFA. Adskælg lillehjernen og hjernestammen fra cerebrum og fotografere cerebrum. Brug en sonde til at adskille synsnerver, chiasm og skrifter og resect strukturen med en skalpel.Adskærv hjernehalvdel langsgående og fotografi hver halvkugle individuelt. Blæk den primære motoriske cortex eller PMC for venstre halvkugle, rephotograph vævet og placere vævet i en 3,3 liters beholder til lang fiksering. At punktafgifter PMC for højre halvkugle fjerne dækker meninges og rephotograph vævet.Næste resect PMC ved hjælp af en skalpel. Fotografer derefter den resected PMC ved siden af halvkuglen. Skær PMC i seks lige store sektioner og blæk rostral aspekt af hver sektion.Placer derefter hver anden sektion i PFA fyldte beholdere til kort fiksering. Og snap fryse de resterende sektioner til opbevaring i forseglede fryseposer, i køligere nummer et. Skær højre halvkugle forreste til posterior i en centimeter tykke koronale sektioner.Fastgør hver anden sektion i PFA og fastgør de resterende sektioner til opbevaring i forseglede fryseposer i køligere nummer et. Adskå hjernestammen fra lillehjernen og læg hjernestammen i en PFA fyldt beholder til kort fiksering. Skær hver cerebellar halvkugle i fire lige faste sagittal sektioner og fotografere den mediale og laterale synspunkter.Derefter placeres venstre cerebellar halvkugleformede skiver i en beholder med PFA til kort fiksering. Og snap fryse den rigtige cerebellar halvkugleformet skiver til opbevaring i forseglede fryseposer, i køligere nummer et. Efter at have fået rygmarven med nerve rødder fjerne rygmarven dura mater og gemme dura i PFA.Adskl venstre og højre forreste og bageste nerve rødder og skære venstre forreste og bageste nerve rødder fra rygmarven for kort fiksering i PFA. Skær den rigtige forreste og bageste nerve rødder fra spinal akkord og snap fryse disse væv til opbevaring i forseglede fryser poser, i køligere nummer to. Derefter fotografere caudal-mest 20 centimeter af rygmarven og skære to centimeter overførsel sektioner fra caudal til rostral retning af ledningen for PFA kort fiksering og snap frysning.Derefter fotografere den resterende rostral del af rygmarven. Og skær to centimeter overførselssektioner fra halebåndet til ledningens rostrale retning til PFA-kort fiksering og snapfrysning. Skær dele af interesse fra den korte eller lange faste væv.Spalterne i de enkelte brønde på en seks brøndplade og vask vævet med tre fem minutters vask i to milliliter frisk PBS pr. vask med omrystning. Til udtagning af antigen mikrobølgeovn må sektionerne mikrobølgeovn i to til tre minutter i et glasbæger, der indeholder ca. 30 milliliter 10 millimollar citratbuffer. Når sektionerne er afkølet til stuetemperatur, overføres prøverne til en ny seks brøndplade i tre fem minutters vaske og to milliliter PBS plus 0,3% Triton X-100 pr. brønd pr. vask.Efterfulgt af endogen peroxidase blokering i to milliliter 3% hydrogenperoxid plus 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter, ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes sektionerne tre gange i to milliliter PBS plus Triton X-100 pr. vask, som påvist. Efterfulgt af blokering i to milliliter 3% normal gedeserum og PBS plus Triton X-100 i en time ved stuetemperatur.Derefter inkuberes sektionerne fra natten til fem dage i de primære interesseantistoffer ved fire grader celsius efterfulgt af tre fem minutters vask i to milliliter PBS pr. vask. Inkuber sektionerne i avidin-biotin kompleks opløsning eller ABC kompleks i en time, ved stuetemperatur. Følg dette op med tre fem minutters vask i PBS.Mærke sektioner med to milliliter filtreret Diaminobenzidin suppleret med hydrogenperoxid per brønd i tre til otte minutter. Når farven er tilstrækkeligt udviklet, vaskes sektionerne tre gange i PBS, og hver sektion overføres individuelt til en PBS-fyldt beholder. Placer hver sektion fladt, under individuelle vævsdias.Løft forsigtigt hver rutsjebane ud af PBS, så sektionerne er så flade som muligt. Brug to pensler til forsigtigt flade og strække ud hvert væv. Og brug en køkkenrulle til at duge det overskydende vand væk.Derefter monteres sektionerne med et passende monteringsmedium, og forsegle hver dæksel slip med klar neglelak. Vævssektioner undersøges for tilstedeværelsen af læsioner i hvidt stof, og de udvalgte områder farves for immunaktivitet og demyelinisering. I akutte multipel sceloris læsioner mange af disse demyelinerede axoner fungere som axonal tilbagetrækning pærer, der afspejler de proksimale ender af transected axoner.Tætheden af transected axoner i akutte læsioner overstiger 11000 pr. kubikm millimeter i aktive læsioner sammenlignet med kun 15 i tilstødende ikke-læsionale hvide stofregioner. Nyligt genererede oligodendrocytter er også til stede i mange kroniske MS læsioner. Disse processer forbinder med, men ikke myelinate demyelinerede axoner.En repræsentativ, upartisk søgen efter neuronale genændringer i hurtigt frosne motoriske cortext opnået fra kroniske MS-patienter, identificeret betydelige reduktioner i 23 nukleare og kodede mitokondrielle messenger RNA's Credentialing undersøgelser ved hjælp af immunocytochemistry og in situ hybridisering viste, at disse gener var stærkt beriget i kortikale projektion neuroner og at mitokondrier isoleret fra projektion axons vise reduceret glycose. Sammenligning af neuronode genekspression i myelinerede og demyelinerede hippocampi afslører reduktioner i neuronal messenger RNA's herunder proteiner involveret i hukommelse og læring. Yderligere, sammenlignet med kontrol cortices, kortikal neuronal tab er betydeligt større i en sub population af MS-patienter, der har demyelinisering af rygmarven og hjernebark, men ikke af den cerebrale hvide stof.Under vævsbehandling skal du sørge for, at når koronale sektioner skæres de skæres konsekvent med hensyn til tykkelse og orientering. Og at de ligger fladt, når de flyder i et fiksativ, eller når de er frosne. Ud over den immunohistokemiske analyse den frosne vævssamling giver os mulighed for at foretage genetiske og proteomiske analyser.Disse teknikker har hjulpet med at identificere en ny kohorte af MS-patienter med cerebral hvid stof læsioner på MR, men uden nogen væsentlig hvid stof demyelinisering. Betegnes myelokortical MS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

En omfattende protokol for manuel segmentering af Medial temporallap Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunohistokemi og Multiple Mærkning med antistoffer fra den samme vært Arter at studere Voksen Hippocampal Neurogenese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Måling fremadskridende neurologisk handicap i en musemodel af multipel sklerose

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generaliseret psykosomatisk interaktion (PPI) analyse af hukommelse relaterede Connectivity hos personer med genetisk risiko for Alzheimers sygdom

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Funktionel MRI i forbindelse med en roman MRI-kompatibel hånd-induceret robot enhed til at evaluere rehabilitering af enkeltpersoner inddrive fra håndgreb underskud

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation af flere fleksible polymer elektrode systemer

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Computer baseret Multitaper spektrogram program til elektro Encephalografiske data

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...