Omfattende obduktions program for personer med multipel sklerose

Målet med vores forskning er at studere patogenesen af multipel sklerose. For at nå dette mål har vi etableret en hurtig obduktion program for at opnå og studere hjerner fra personer med MS. Der er to særlige aspekter af vores obduktion program, den første er, at det er hurtigt. Vi samler hjernens under seks til otte timers død.

Dette giver mulighed for state of the art molekylære undersøgelser. Det andet aspekt er, at vi gør en in situ MR, før vi flytter hjernen. Dette giver os mulighed for at korrelere patologiske ændringer med hjernen billeddannelse ændringer.

Visuel demonstration giver seerne mulighed for at forstå, hvordan vi organiserer vores rum og tid for at opnå optimale resultater. Vævsbehandling, der sker hurtigt og omhyggeligt giver mulighed for RNA-analyse, immunstaining, immunoblotting og MR-korrelationer. Nye forskere kan kæmpe med behandling af væv med dårlig vævintegritet.

Undgå lange post mortem fiksering gange er vigtigt, og MR-væv corde riller kan være udfordrende, så samråd med MR-analyse eksperter kan være meget nyttigt. Demonstrationen af proceduren vil være Emilie Christie og Christina Volsko. Teknikere fra vores laboratorium.

Efter In situ magnetisk resonans imaging, veje og fotografere hjernen og placere eventuelle påsatte dura i en beholder med 4% Paraformaldehyd eller PFA. Adskælg lillehjernen og hjernestammen fra cerebrum og fotografere cerebrum. Brug en sonde til at adskille synsnerver, chiasm og skrifter og resect strukturen med en skalpel.

Adskærv hjernehalvdel langsgående og fotografi hver halvkugle individuelt. Blæk den primære motoriske cortex eller PMC for venstre halvkugle, rephotograph vævet og placere vævet i en 3,3 liters beholder til lang fiksering. At punktafgifter PMC for højre halvkugle fjerne dækker meninges og rephotograph vævet.

Næste resect PMC ved hjælp af en skalpel. Fotografer derefter den resected PMC ved siden af halvkuglen. Skær PMC i seks lige store sektioner og blæk rostral aspekt af hver sektion.

Placer derefter hver anden sektion i PFA fyldte beholdere til kort fiksering. Og snap fryse de resterende sektioner til opbevaring i forseglede fryseposer, i køligere nummer et. Skær højre halvkugle forreste til posterior i en centimeter tykke koronale sektioner.

Fastgør hver anden sektion i PFA og fastgør de resterende sektioner til opbevaring i forseglede fryseposer i køligere nummer et. Adskå hjernestammen fra lillehjernen og læg hjernestammen i en PFA fyldt beholder til kort fiksering. Skær hver cerebellar halvkugle i fire lige faste sagittal sektioner og fotografere den mediale og laterale synspunkter.

Derefter placeres venstre cerebellar halvkugleformede skiver i en beholder med PFA til kort fiksering. Og snap fryse den rigtige cerebellar halvkugleformet skiver til opbevaring i forseglede fryseposer, i køligere nummer et. Efter at have fået rygmarven med nerve rødder fjerne rygmarven dura mater og gemme dura i PFA.

Adskl venstre og højre forreste og bageste nerve rødder og skære venstre forreste og bageste nerve rødder fra rygmarven for kort fiksering i PFA. Skær den rigtige forreste og bageste nerve rødder fra spinal akkord og snap fryse disse væv til opbevaring i forseglede fryser poser, i køligere nummer to. Derefter fotografere caudal-mest 20 centimeter af rygmarven og skære to centimeter overførsel sektioner fra caudal til rostral retning af ledningen for PFA kort fiksering og snap frysning.

Derefter fotografere den resterende rostral del af rygmarven. Og skær to centimeter overførselssektioner fra halebåndet til ledningens rostrale retning til PFA-kort fiksering og snapfrysning. Skær dele af interesse fra den korte eller lange faste væv.

Spalterne i de enkelte brønde på en seks brøndplade og vask vævet med tre fem minutters vask i to milliliter frisk PBS pr. vask med omrystning. Til udtagning af antigen mikrobølgeovn må sektionerne mikrobølgeovn i to til tre minutter i et glasbæger, der indeholder ca. 30 milliliter 10 millimollar citratbuffer. Når sektionerne er afkølet til stuetemperatur, overføres prøverne til en ny seks brøndplade i tre fem minutters vaske og to milliliter PBS plus 0,3% Triton X-100 pr. brønd pr. vask.

Efterfulgt af endogen peroxidase blokering i to milliliter 3% hydrogenperoxid plus 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter, ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning vaskes sektionerne tre gange i to milliliter PBS plus Triton X-100 pr. vask, som påvist. Efterfulgt af blokering i to milliliter 3% normal gedeserum og PBS plus Triton X-100 i en time ved stuetemperatur.

Derefter inkuberes sektionerne fra natten til fem dage i de primære interesseantistoffer ved fire grader celsius efterfulgt af tre fem minutters vask i to milliliter PBS pr. vask. Inkuber sektionerne i avidin-biotin kompleks opløsning eller ABC kompleks i en time, ved stuetemperatur. Følg dette op med tre fem minutters vask i PBS.

Mærke sektioner med to milliliter filtreret Diaminobenzidin suppleret med hydrogenperoxid per brønd i tre til otte minutter. Når farven er tilstrækkeligt udviklet, vaskes sektionerne tre gange i PBS, og hver sektion overføres individuelt til en PBS-fyldt beholder. Placer hver sektion fladt, under individuelle vævsdias.

Løft forsigtigt hver rutsjebane ud af PBS, så sektionerne er så flade som muligt. Brug to pensler til forsigtigt flade og strække ud hvert væv. Og brug en køkkenrulle til at duge det overskydende vand væk.

Derefter monteres sektionerne med et passende monteringsmedium, og forsegle hver dæksel slip med klar neglelak. Vævssektioner undersøges for tilstedeværelsen af læsioner i hvidt stof, og de udvalgte områder farves for immunaktivitet og demyelinisering. I akutte multipel sceloris læsioner mange af disse demyelinerede axoner fungere som axonal tilbagetrækning pærer, der afspejler de proksimale ender af transected axoner.

Tætheden af transected axoner i akutte læsioner overstiger 11000 pr. kubikm millimeter i aktive læsioner sammenlignet med kun 15 i tilstødende ikke-læsionale hvide stofregioner. Nyligt genererede oligodendrocytter er også til stede i mange kroniske MS læsioner. Disse processer forbinder med, men ikke myelinate demyelinerede axoner.

En repræsentativ, upartisk søgen efter neuronale genændringer i hurtigt frosne motoriske cortext opnået fra kroniske MS-patienter, identificeret betydelige reduktioner i 23 nukleare og kodede mitokondrielle messenger RNA's Credentialing undersøgelser ved hjælp af immunocytochemistry og in situ hybridisering viste, at disse gener var stærkt beriget i kortikale projektion neuroner og at mitokondrier isoleret fra projektion axons vise reduceret glycose. Sammenligning af neuronode genekspression i myelinerede og demyelinerede hippocampi afslører reduktioner i neuronal messenger RNA's herunder proteiner involveret i hukommelse og læring. Yderligere, sammenlignet med kontrol cortices, kortikal neuronal tab er betydeligt større i en sub population af MS-patienter, der har demyelinisering af rygmarven og hjernebark, men ikke af den cerebrale hvide stof.

Under vævsbehandling skal du sørge for, at når koronale sektioner skæres de skæres konsekvent med hensyn til tykkelse og orientering. Og at de ligger fladt, når de flyder i et fiksativ, eller når de er frosne. Ud over den immunohistokemiske analyse den frosne vævssamling giver os mulighed for at foretage genetiske og proteomiske analyser.

Disse teknikker har hjulpet med at identificere en ny kohorte af MS-patienter med cerebral hvid stof læsioner på MR, men uden nogen væsentlig hvid stof demyelinisering. Betegnes myelokortical MS.