Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

De auteurs willen ook Dr. Christopher Nelson bedanken voor de redactionele hulp. Het autopsie programma wordt deels ondersteund door R35 Grant NS097303 aan BDT. Het werk in het laboratorium van RD wordt ondersteund door beurzen van NINDS (NS096148) en de National Multiple Sclerose Society, VS (RG 5298).

Dit protocol is goedgekeurd door de Cleveland Clinic Institutional Review Board en volgt richtlijnen van de Cleveland Clinic Human Research Ethics Committee.
1. in situ MRI
<ol><li>Neem het donor lichaam mee naar de MRI-Suite en voer een 2 h MRI Imaging protocol uit bij de MS Imaging Facility. Voer een MRI uit op een 3 T of 7 T Imager. Opmerking: Er wordt prioriteit gegeven aan 3T omdat de meeste verouderde gegevens op 3 T zijn uitgevoerd, maar wanneer deze niet beschikbaar zijn, wordt Imaging uitgevoerd met 7T. Aangewezen kern sequenties worden uitgevoerd voor alle gevallen (tabel 1) en aanvullende sequenties die afhankelijk zijn van de huidige onderzoeksinteresses worden uitgevoerd als de tijd het toelaat (beperkt door het bereiken van weefsel fixatie minder dan 12 h na de dood). Tabel 1 beschrijft de kern sequenties.</li>
</ol>2. autopsie
Opmerking: Na de in-situ MRI wordt het lichaam getransporteerd naar de mortuarium voor hersenen en ruggenmerg extractie door een Diener en weefsel verwerking door lableden.
<ol><li>Voer de volgende stappen uit voorafgaand aan de Body aankomst in de Morgue. Twee uur vóór, bereiden 3 L van 4% Paraformaldehyde (PFA) en etiket containers en zakken voor weefsel opslag. Bereid 3 L van 8% PFA en Verdun 1,5 L van 8% PFA tot 4% PFA. Plaats de resterende 8% PFA in 4 °C voor dag 2.</li>
	<li>Voorafgaand aan het reizen naar de Morgue, vul 2 reizende koelers tot 50% capaciteit met droogijs (grote blokken gebroken om te passen en kleine pellets).</li>
	<li>Vul in de Morgue een roestvrijstalen container halverwege met 2-methylbutaan en droogijs en dek af met een deksel ter voorbereiding op snap bevriezing van het weefsel.</li>
	<li>Weeg en foto van de hersenen eenmaal verwijderd door de Diener.</li>
	<li>Plaats een bevestigde Dura in een container gevuld met PFA.</li>
	<li>Scheid het cerebellum en de hersenstam van het hersenen en fotografeer de hersenen.</li>
	<li>Identificeer de optische zenuwen, Chiasme, en Tracts en scheiden met behulp van een sonde en pincet. Resect de structuur met een scalpel. Opmerking: Het distale segment van één kant van de oogzenuw is gemarkeerd met behulp van Higgins Ink voor identificatie.</li>
	<li>Scheid de hersenhelften longitudinaal en foto elke halfrond afzonderlijk.</li>
	<li>Inkt de primaire motor cortex (PMC) voor de linker halfrond, re-fotograferen, en plaats het in een 3,3 L container voor langdurige fixatie. Documenteer de starttijd voor hersen fixatie.</li>
	<li>De PMC voor de rechter hemisfeer kan worden geïnkt of uitgesneden.
	<ol>
<li>Als het wordt uitgesneden, Verwijder eerst de bekledings hersenvliezen.</li>
		<li>Opnieuw fotograferen geïnkt of uitgesneden PMC.</li>
		<li>Als PMC wordt uitgesneden, snijd dan in 6 secties van gelijke grootte.</li>
		<li>Inkt het rostrale migratoire-aspect van elke sectie.</li>
		<li>Plaats oneven genummerde secties in met PFA gevulde containers voor korte fixatie.</li>
		<li>Maak even genummerde secties in de vriezer en plaats ze in verzegelde diepvrieszakken in koelere #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Snijd de rechter hemisfeer voorste naar posterieure in 1 cm dikke coronale secties.
	<ol>
<li>Document Grove afwijkingen (bijv. Snij artefact, bloeding en laesies).</li>
		<li>Plaats oneven genummerde secties in containers gevuld met PFA voor korte fixatie.</li>
		<li>Even genummerde delen en plaatsen in verzegelde diepvrieszakken.</li>
		<li>Document einde van de hersen fixatietijd.</li>
	</ol></li>
	<li>Scheid de hersenstam van het cerebellum en plaats in een met PFA gevulde container voor korte fixatie.
	<ol>
<li>Afzonderlijke cerebellaire hemisferen longitudinaal.</li>
		<li>Snijd elke halve bol in 4 even dikke sagittale secties.</li>
		<li>Foto mediale en laterale views.</li>
		<li>Plaats linker cerebellaire hemisferische schijfjes in een container gevuld met PFA voor korte fixatie.</li>
		<li>Klik op de juiste cerebellaire-hemisferische schijfjes en plaats ze in verzegelde diepvrieszakken in koelere #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Verkrijg het ruggenmerg met zenuwwortels van de Diener.
	<ol>
<li>Verwijder het ruggenmerg dura mater en sla Dura op in een container met PFA.</li>
		<li>Scheid de linker-en rechter anterieure en posterieure zenuwwortels. Snijd de linker anterieure en achterste zenuwwortels gesneden uit het ruggenmerg en plaats in een gevulde PFA container voor korte fixatie.</li>
		<li>Snijd de rechter voorste en achterste zenuwwortels van het ruggenmerg, snap-Freeze, plaats in verzegelde diepvrieszakken, en plaats vervolgens in koelere #2.</li>
		<li>Foto van de caudal-meest 20 cm van het ruggenmerg. Documenteer de locatie van de lumbale uitbreiding.</li>
		<li>Snijd 2 cm dwarsdoorsneden van het snoer van caudal naar rostral.</li>
		<li>Inkt het rostrale migratoire-aspect van elk snijgedeelte af.</li>
		<li>Plaats oneven genummerde secties in containers gevuld met PFA voor korte fixatie.</li>
		<li>Maak de even genummerde secties in de vriezer, plaats ze in verzegelde diepvrieszakken en plaats ze in koelere #2.</li>
		<li>Documenteer de begintijd voor fixatie van het ruggenmerg en eventuele grove afwijkingen.</li>
		<li>Fotografeer het overgebleven rostrale migratoire gedeelte van het ruggenmerg.</li>
		<li>Documenteer de positie van de cervicale uitbreiding. Volg de stappen 2.13.5 – 2.13.8 voor het overgebleven ruggenmerg.</li>
	</ol></li>
	<li>Na de mortuarium plaats bevroren weefsel in gelabelde dozen in-80 °c vriezers. Bewaar vast weefsel bij 4 °C.</li>
	<li>Bij 24 uur post-autopsie (dag 2) verdunt u de resterende 8% PFA tot 4%.</li>
	<li>Vervang 4% PFA in fixatie containers met vers verdunde 4% PFA.</li>
	<li>Bij 60 h post-autopsie bereid oplossingen van 2,5% Glutaaraldehyde in 4% PFA van Glutaaraldehyde, PFA, dH2O en sorenslo's buffer (bereid door het mengen in volgorde: 0,2 M fosfaatbuffer pH 7,4, polyvinylpyrolidon 1% w/v, sucrose 30% w/v, en ethyleenglycol 30% v/v).</li>
	<li>Verwijder gebruikte 4% PFA van Short-fixatie containers.</li>
	<li>Spoel het weefsel af in de buffer van Sorenson en plaats het in cryoprotectie oplossing (glycerol 20%, 0,4 M Sorenser's buffer 20% en 0,02% natrium natriumazide in dH2O).</li>
	<li>Fotograferen van korte-vaste hersen sneden, cerebellum, hersenstam en motorische cortex (indien van toepassing).</li>
	<li>Met een scalpel blad gesneden 2 mm dikke dwarsdoorsneden van elk 2 cm korte-vaste ruggenmerg sectie.</li>
	<li>Plaats secties in 2 ml Scintillatie flesjes en vul met oplossing van 2,5% Glutaaraldehyde in 4% PFA.</li>
	<li>Retourneer het resterende gedeelte naar de originele 20 ml Scintillatie injectieflacon. Spoel de sectie af met de buffer van Sorenson en vervang de cryoprotection-oplossing.</li>
</ol>3. pathologie
Opmerking: Korte-vaste segmenten van de rechter hemisfeer evenals de lang vaste linker hemisfeer (geplaatst in 4% PFA gedurende enkele maanden) worden ofwel gesneden in 30 μm secties (aangeduid als vrij drijvend) of ingebed in paraffine en gesneden als 12 – 14 μm secties (aangeduid als paraffine-ingebed). Deze secties worden gewoonlijk verwerkt met proteolipide eiwitten (PLP) voor het opsporen van demyelinerende laesies en belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC-II) voor immuunactiviteit met behulp van de methode diaminobenzidine (DAB). Deze protocollen zijn gestandaardiseerd en gebruikt in verschillende publicaties2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12.
<ol><li>
Vrij zwevende (30 μm) DAB-Avidin-Biotine complex (ABC) weefsel kleuring
	<ol>
<li>Verwijder secties van cryozak oplossing, Transfer secties naar een zes-well plaat, en was ze 3x voor 5 min elk in 2 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing pH 7,0 (PBS). Bij het overbrengen naar de volgende put in de zes-goed plaat gebruik zorg niet om het weefsel te scheuren. Plaats tijdens elke was-en incubatie stap de zes-put plaat op een shaker en laat het weefsel zachtjes schudden. Opmerking: Weefsel secties geïnineerd in kleinere volumes en in grotere platen (dat wil zeggen, 12-en 24-goed platen) vertonen de neiging om oppervlakte-en rand scheuren.</li>
		<li>Voer geen antigeen-opvraging uit in een glazen bekerglas met ongeveer 30 mL 10 mM citraat buffer (pH 6,0). Zorg ervoor dat weefsels niet worden gevouwen door te manipuleren met een penseel en magnetron secties voor 2 – 3 min of totdat citraat buffer komt begint te koken. Laat secties afkoelen tot kamertemperatuur (~ 20 min).</li>
		<li>Transfer secties terug naar een 6-well plaat en wassen secties 3x voor 5 min elk in 2 mL PBS/0.3% Triton X-100. Blokkeer endogene peroxiasen door secties in 2 mL 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) te incuberen.</li>
		<li>Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL PBS/0.3% Triton X-100. Blok secties in 2 mL 3% normaal geiten serum/0,3% Triton X-100/1x PBS voor 1 uur bij RT.</li>
		<li>Inbroed de delen 's nachts tot 5 dagen (afhankelijk van het antilichaam) in primaire antilichamen tegen Microglia en myeline epitopen om ontstekingen (mhcii) en demyelinisatie (PLP) te detecteren (Zie de tabel met materialen) bij 4 °c. Opmerking: Zorg ervoor dat secties niet worden gevouwen bij het inbroed van deze stap of volgende stappen, omdat dit zal leiden tot gebieden binnen de secties die worden vernietigd van vlek.</li>
		<li>Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL 1x PBS. Vervolgens incuberen secties in secundaire biotinyleerd antilichamen (Zie de tabel van de materialen) voor 1 h bij RT. bereid avidin-biotin complex (ABC) oplossing tijdens incubatie ongeveer 45 min voor de volgende Wash stap om ABC complexen te vormen.</li>
		<li>Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL 1x PBS. Vervolgens incuberen secties in ABC voor 1 uur bij RT.</li>
		<li>Spoel secties in 2 mL 1x PBS driemaal gedurende 5 min per stuk. Inbroed delen in gefilterde DAB (2 mL/put/sectie) die H2o2 (1:500 verdunning van 30% H2O2 in DAB) bevatten totdat de kleur adequaat ontwikkelt (~ 3 – 8 min).</li>
		<li>Was secties 3x voor 5 min elk in 2 mL 1x PBS. Ter verbetering van het signaal (optioneel), osmicate met behulp van 0,04% OsO4 (~ 30 s).</li>
		<li>Wassecties driemaal gedurende 5 min elk in 1x PBS. Individueel, breng elke sectie van de zes-put plaat naar een kleine container vol 1x PBS en Positioneer de weefsel sectie op een glazen glijbaan zo plat mogelijk.</li>
		<li>Til de schuif voorzichtig uit de PBS en zorg ervoor dat de weefsel sectie zo plat mogelijk is. Gebruik twee verf borstels om het weefsel op de glijbaan zachtjes af te vlakken en het overtollige water met een papieren handdoek weg te deppen. Monteer de weefsel secties met glycerol (of een gelijkwaardige bevestigings media) en sluit de Afdeklijst af met blanke nagellak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. paraffine-ingesloten Hemiferische delen: DAB-kleuring
<ol><li>Smelt paraffine van de glijbanen in een 60 °C oven gedurende 5 – 10 minuten.</li>
	<li>De-paraffine delen door het inbroeren van xyleen 3x gedurende 5 min per stuk.</li>
	<li>Rehydrate weefsel in Graded ethanol bij 100% (2x voor 5 min elk), 95% (2x voor 5 min), 70% (2x voor 5 min elk), en 50% (1x voor 5 min elk). Dia's in PBS bedekken.</li>
	<li>Antigeen wordt door micro zwaaiende glijbanen in een bekerglas van 10 mM citraat buffer (pH 6,0) opgehaald.</li>
	<li>Was de glijbanen in 1x PBS (3x voor 5 min elk) eenmaal afgekoeld tot kamertemperatuur. Blokkeer endogene peroxiasen door weefsel in 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS gedurende 30 minuten te incuberen.</li>
	<li>Wassen weefsel in 1x PBS driemaal gedurende 5 min elk. Blok weefsel met 6% normaal geiten serum in PBS gedurende 1 uur.</li>
	<li>Inbroed delen in primair antilichaam (Zie de tabel met materialen) in PBS bij kamertemperatuur (RT) 's nachts (max. 20 uur).</li>
	<li>Was secties 3x voor 5 min elk in 1x PBS. Vervolgens inbroed delen in het overeenkomstige secundaire antilichaam (Zie de tabel met materialen) in PBS voor 1 uur bij RT.</li>
	<li>Bereid ABC-oplossing ongeveer 45 min voor de volgende wasstap tijdens de incubatie.</li>
	<li>Was secties 3x voor 5 min elk in 1x PBS en inbroed vervolgens in ABC voor 1 uur bij RT.</li>
	<li>Was sectie 3x voor 5 min elk in 1x PBS.</li>
	<li>Inbroed secties in gefilterde (0,45 μm filter poriegrootte) DAB met H2o2 (1:500 verdunning van 30% H2o2 in DAB) tot de kleur adequaat ontwikkelt (~ 3-8 min).</li>
	<li>Wassen secties (3x 5 min) in 1x PBS. Om het signaal te verbeteren, osmicate met behulp van 0,04% osmium tetroxide (OsO4; ongeveer 30 s).</li>
	<li>Wash secties (3x 5min) in 1x PBS.</li>
	<li>Dehydraat weefsel in een gesorteerde serie ethanol 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min) en 100% xyleen (1x 5min). Laat xylenen verdampen.</li>
	<li>Monteer secties met snelle droge bevestigings media op tolueen. Formuleringen die anti-oxidanten bevatten, worden aanbevolen om vlek bleaching te voorkomen. Verwijder overtollige bevestigings media van de schuif randen met een scheerapparaat voor daaropvolgende opslag.</li>
</ol>5. correlaties met MRI/pathologie
Opmerking: Voor het correleren van MRI met pathologie, voeren we eerst ex vivo MRI uit van het lang vaste, intacte hersen halfrond (stap 2,9 hierboven) in een instelbare doos met MRI-zichtbare markeringen die de snij sleuven aangeven. Vervolgens snijden we de hersenen en fotograferen we de segmenten van 1 cm om de co-registratie van in-situ Mri's aan de afzonderlijke hersen segmenten mogelijk te maken. Vervolgens kunnen we MRI-geleide analyses uitvoeren, waarbij regio's van belang (ROIs) worden geïdentificeerd op MRI tot directe weefsel analyse. We kunnen ook histopathologie-geleide analyses uitvoeren, waarbij ROIs worden geïdentificeerd op weefsel (bijvoorbeeld laesies van witte stof, witte stof zonder demyelinisatie, enz.) en vervolgens worden gekenmerkt door de co-gelokaliseerde MRI-maatregelen (tabel 1).
<ol><li>
Identificatie van ROIs op basis van MRI Opmerking: in eerdere studies hebben we Rois in witte materie vastgesteld11,12,13,14,15 en grijze materie16,17, 18. het onderstaande voorbeeld is voor witte-materie analyse.<ol>
<li>Segment T2 hyperintens laesies op in situ MRIS (vanaf stap 1,1), aanvankelijk verwerkt door een automatisch algoritme, en vervolgens handmatig gecorrigeerd door ervaren gebruikers.</li>
		<li>Segment T1 intense laesies binnen T2 laesies als voxels met een signaalintensiteit van minder dan of gelijk aan 80% van de signaalintensiteit van het omringende normaal-verschijnend hersenweefsel.</li>
		<li>Segment intense gebieden in magnetisatie Transfer ratio (MTR) kaarten met een drempel van 80%.</li>
		<li>Maak drie classificaties met de bovenstaande segmentaties: (a) alleen T2-laesies die abnormaal zijn op T2-gewogen/FLAIR-scans, maar normaal op T1-gewogen of MTR-scans, (b) T2T1MTR laesies, die abnormaal zijn op alle T2-gewogen/FLAIR-, T1-gewogen en MTR-scans; en (c) normaal-verschijnend wit materiaal (NAWM), die normaal zijn op alle T2-gewogen/FLAIR, T1-gewogen en MTR-scans. Opmerking: Onze selectie van segmenten is gebaseerd op het bestaan van alle drie de regio's van de rente (T2-only, T2T1MTR en NAWM) op dezelfde segmenten.</li>
		<li>Bereken genormaliseerde intensiteiten voor elke ROI om variabiliteit te minimaliseren die voortvloeien uit verschillende hersenen en verschillende hersen locaties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Co-registratie van in-situ MRI naar hersen schijfjes
	<ol>
<li>Scan de vaste hersenhelft in een aangepaste snijden box met vier rijen MRI-gevoelige markers die de sleuven lokaliseren waar een mes kan worden ingebracht om de hersenen te snijden. Voer een T1-gewogen 3D MPRAGE overname met 1 mm isotrope resolutie die betrekking hebben op de vaste hersenen en alle van de markers. Opmerking: Dit wordt post-fixatie MRI genoemd en wordt alleen gebruikt als een tussenstap voor co-registratie van de in situ Mri's naar de hersen segmenten.</li>
		<li>Onmiddellijk na het scannen, snijd de hersenhelft in "slots" gelegen op 1 cm van elkaar, resulterend in ongeveer 15 segmenten.</li>
		<li>Fotografeer de hersen schijfjes op zowel de voorste als de achterste zijkanten.</li>
		<li>Co-Registreer de in situ MRI en foto's van hersen segmenten met de volgende stappen.<ol>
<li>Voor segmentatie van post-fixatie en in situ MPRAGE, pre-process zowel post-fixatie en in situ MPRAGE Mri's voor intensiteit niet-uniformiteit19.<ol>
<li>Segmenteer de hersenen en vier rijen markeringen van voorbewerkte MPRAGE na fixatie.</li>
				<li>Segmenteer de halve bol die overeenkomt met de post-fixatie MRI20,21 van de voorverwerkte in situ-mprage.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Registreer de door de hersenen geëxtraheerde Mri's in situ en post-fixatie via een reeks lineaire registratieprocessen tot 12 graden van vrijheid (affiene registratie) met behulp van FSL FLIRT22. De schalen en schuintrekken onderdelen rekening voor het effect van fixatie krimp.</li>
			<li>Zoek de normale richting van het snijvlak door de som van de maximale geprojecteerde intensiteiten te minimaliseren met behulp van gesegmenteerde markeringen. Deze heroriënterings hoeken zijn opgenomen in de transformatie matrix die is verkregen uit de vorige stap.</li>
			<li>Visueel overeenkomen met MRI-beelden op foto's van vaste posterieure hersen segmenten met behulp van een in-House beeldviewer die het mogelijk maakt om de diepte en oriëntatie van de normale vectoren te veranderen. Kleine aanpassingen zijn nodig omdat de hersen snijden onvolmaakt is.</li>
			<li>Breng affiene beeld transformatie13 aan voor elk segment om de in-situ mri's te transformeren naar dezelfde snijden-locaties als de foto's van de hersen segmenten.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1-/T2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis.">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li><li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

We beschrijven een protocol dat is gebruikt voor het snel aanschaffen en verwerken van weefsel van meer dan 150 individuen met MS. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is dat de wetenschappers die het weefsel gebruiken ook belast zijn met het tot stand brengen van het protocol en het uitvoeren van de weefsel verzameling. Dit biedt flexibiliteit bij het voldoen aan de wetenschappelijke behoeften van individuele onderzoeksprojecten. Verschillende aspecten van dit protocol verbeteren het nut ervan. De patiënten zijn meestal goed gekarakteriseerd vóór de dood, omdat velen van hen zijn gevolgd door neurologen in ons centrum. Een kritieke stap is de verwerking van weefsel donaties kort na de dood, wat de kwaliteit van het bevroren weefsel verhoogt in vergelijking met sommige andere hersen banken. Dit maakt moleculaire studies mogelijk die van grote waarde zijn bij het beschrijven van veranderingen in transcriptionele en translationele genproducten, die essentieel zijn voor de onderbouwing van histologische en immunocytochemische waarnemingen. Het gebruik van morfologische/immunocytochemische en moleculaire gegevens in meerdere gevallen verhoogt de betrouwbaarheid van de conclusies. Dit is het beste geïllustreerd door onze beschrijving van mitochondriale gen veranderingen in cerebrale cortex en neuronale gen veranderingen in demyelgefluoreerde hippocampi. Nieuwe genprofilerings protocollen worden snel ontwikkeld en het bevroren weefsel in onze bank moet kwalitatief hoogwaardig RNA bieden voor weefsel-en eencellige analyse.
Een ander waardevol aspect van ons protocol zijn de korte-vaste hersen sneden. Deze weefsels worden in 30 μm dikke, vrij zwevende delen gesneden. Deze secties zijn ideaal voor het gebruik van confocale microscopie om twee of meer antigenen in drie dimensies te analyseren. Goede voorbeelden zijn de interactie van pre-myelinerende oligodendrocyten processen met dystrofische axonen in chronische MS laesies, evenals de identificatie van enkelvoudige axonale verbindingen naar sneden axonale terugtrek lampen. Dit is in tegenstelling tot het routinematige gebruik van paraffine profielen met een dikte van 7 μm, waarbij 3D-beelden niet haalbaar zijn. Paraffine-ingesloten weefsels hebben een grote waarde voor sommige vragen, met name de kwantificering van neuronale dichtheden in hemiferische 7 μm-dikke delen. Onze weefsel verwerkingsprotocollen zijn daarom divers en bieden flexibiliteit om vaste en snel bevroren weefsels te verzekeren.
Een ander uniek kenmerk van ons protocol is de postmortem in situ hersen MRI. Hersen Mri's zijn een onvervangbaar biomarker van MS-ziekte. Het is daarom essentieel om de pathologische correlaten van abnormale MRI-signalen vast te stellen. Uit onze studies is gebleken dat zowel T2 als T2T1MTR ROIs vaak myelfluorzijn. Deze bevinding ondersteunt de behoefte aan specifiekere beeldvormings modaliteiten die betrouwbaar onderscheid maken tussen myelinehoudende en gedemyelineerde cerebrale witte materie. MRI lijkt gevoelig te zijn voor de detectie van myeline, maar onze studies tonen aan dat zelfs een combinatie van T1/T2/MTR niet specifiek is voor het identificeren van myelinisatie. Ons postmortemprotocol biedt een ideaal platform om het vermogen van nieuwe beeldvormings modaliteiten te testen om onderscheid te maken tussen myelinehoudende en gedemyelineerde cerebrale witte materie. MRI biedt ook het ideale voertuig voor de vertaling van elementaire wetenschappelijke resultaten in de klinische praktijk, gezien het gebruik van MRI in ons translationeel onderzoek en het wijdverbreide klinische gebruik bij levende patiënten.
Terwijl het snijden van korte-en lang-vaste en bevroren segmenten een voordeel biedt voor het verwerken van weefsel in meerdere modi voor verschillende studies, zijn er enkele beperkingen met deze methode. De beoordeling van het geheel van een structuur kan worden beperkt, aangezien gedeelten ervan verschillend kunnen worden verwerkt op aangrenzende segmenten. Het grote volume van de weefselbank biedt echter de mogelijkheid om een structuur van belangstelling voor meerdere proefpersonen te onderzoeken om de bemonstering te verbeteren. Een andere algemene beperking van onderzoeken met behulp van postmortemweefsels is dat ze cross-sectional zijn. De conclusies met betrekking tot de timing en de voortgang van de veranderingen moeten in deze context worden geïnterpreteerd. Er kan een selectie bias zijn voor patiënten die hun weefsels doneren, wat de generalisatie van gegevens kan beperken tot alle patiënten met MS. Aangezien de meeste donoren sterven aan complicaties van gevorderde MS, is het wellicht niet gepast om de bevindingen van deze patiënten te extrapoleren naar die in eerdere stadia van MS. Desalniettemin hebben we weefsels ontvangen van jongere patiënten die zijn gestorven aan niet-MS-gerelateerde aandoeningen (d.w.z. acuut myocardinfarct, overdosis drugs, zelfmoord). Het toepassingsgebied van ons protocol omvat geen bemonstering van andere organen (bijv. gastro-intestinale en beenmerg) die bij MS betrokken zijn geweest. Wij geloven dat de sterke punten van het programma sterk opwegen tegen de beperkingen.

Een van de beste manieren om een ziekte te bestuderen is om het zieke weefsel zelf te onderzoeken. Dit presenteert uitdagingen voor diegenen die ziekten van het centrale zenuwstelsel (CNS) bestuderen. Biopsies van zieke hersenen en ruggenmerg zijn zeer zeldzaam en meestal betrekking hebben op atypische gevallen. Autopsie tarieven voor individuen met CNS ziekten zijn drastisch gedaald in de afgelopen jaren, en wanneer uitgevoerd, ze bieden vaak geen snelle aanschaf van weefsels. Deze uitdagingen hebben geresulteerd in de oprichting van ziekte gerichte hersen banken, waaronder verschillende gericht op het verzamelen van weefsels van individuen met multiple sclerose (MS). MS is een ontstekings-gemedieerde ziekte van het CZS die myeline, oligodendrocyten (myeline vormende cellen), neuronen en axonen vernietigt. De meerderheid van de MS-patiënten heeft een bi-fasische ziekte cursus die begint met aanvallen van neurologische handicaps met variabel herstel dat zich uiteindelijk ontwikkelt tot een geleidelijk progressieve ziekte die waarschijnlijk neurodegeneratief is in de natuur1. Voor de meerderheid van de gedoneerde MS-hersenen zijn de postmortemintervallen (PMI) tussen de dood en weefsel verwerking meer dan 24 uur. Hoewel deze weefsels waardevolle informatie hebben verschaft over pathologische veranderingen in MS-hersenen, zijn ze niet geschikt voor geavanceerdere moleculaire studies die krachtige inzichten kunnen geven in pathofysiologie van de ziekte. Dit is met name het geval voor genprofilerings studies, die intact RNA vereisen.
Om de hierboven besproken beperkingen te overwinnen, hebben we een Rapid tissue donatieprogramma ontwikkeld dat MRI/pathologische correlaties mogelijk maakt. Dit protocol biedt goed bewaarde weefsels die geschikt zijn voor moderne moleculaire studies en maakt directe vergelijking van hersen pathologie en MRI-afwijkingen in MS-hersenen mogelijk. Het Cleveland Clinic programma voor weefseldonatie met multiple sclerose bestaat al meer dan 20 jaar. Dit snelle weefseldonatie programma koopt hersenen en ruggengraat koorden van individuen met MS en andere geassocieerde auto-immune neurologische aandoeningen. Het programma is bedoeld om in situ MRIs binnen 6 h van de dood te verkrijgen, gevolgd door verwijdering van de hersenen en het ruggenmerg voor weefsel verwerking.
Werving Donaties worden verkregen door middel van een ante-mortemtoestemming die rechtstreeks is verkregen van patiënten (vooraf ingestemd) of van de naaste van de kin na de dood. Vooraf toegestemd patiënten worden meestal geïdentificeerd uit de klinische populatie in het Mellen Center voor multiple sclerose behandeling en onderzoek in Cleveland, Ohio. Hoewel de voorkeur in rekrutering in het Rapid tissue donatieprogramma wordt gegeven aan patiënten die in longitudinale onderzoeken zijn gevolgd, is het open voor alle patiënten die in het centrum worden gezien. Deelnemers die zich vóór de dood inschrijven, krijgen instructies voor familieleden of zorgverleners om contact op te nemen met het onderzoeksteam, hetzij op het moment van overlijden of wanneer de dood dreigt te worden verwacht. De tweede methode voor individuen om het weefseldonatie programma in te voeren is op het moment van overlijden door toestemming door de naaste van kin. De staat Ohio eist dat sterfgevallen worden doorverwezen naar een federaal-gemandateerde orgaan Procurement organisatie LifeBanc, die in 20 provincies in het noordoosten van Ohio opereert. LifeBanc screent alle sterfgevallen voor een diagnose van MS, wat een uitsluiting is voor orgaandonatie. LifeBanc heeft een regeling getroffen om onderzoekers van het MS tissue donatieprogramma op de hoogte te stellen van alle sterfgevallen met een geassocieerde diagnose van MS die zich voordoen binnen een straal van 75 mijl van de Cleveland Clinic. Naast kin en ziekenhuispersoneel worden vervolgens gecontacteerd door het weefseldonatie programma personeel en toestemming wordt verkregen voor donatie van hersenen en ruggenmerg weefsels. Deze twee methoden voor de aanwerving van een ante-en een post-mortem via LifeBanc resulteren in ongeveer 10-12 hersen donaties per jaar. Aanpassingen worden aangebracht in de leeftijdsgrens van de dood voor het beheren van het aantal verwijzingen die zijn afgeleid van LifeBanc.
Aanschaf van donaties Het programma vereist 24 h dekking, 365 dagen per jaar door leden van het weefseldonatie programma voor weefsel inkoop. Een gecentraliseerde kennisgeving van weefseldonatie e-mail/pager/mobiel apparaat tekst meldingssysteem wordt gebruikt door het klinische team dat weefsel donaties. LifeBanc is voorzien van nummers om contact op te nemen met personeel voor het weefseldonatie programma. Leden worden op de hoogte gesteld van overlijden door ziekenhuis aanbieders/Next of kin (vooraf ingestemd) of door LifeBanc en andere verwijzingsbronnen. Ten eerste wordt een bepaling van de tijd van overlijden en haalbaarheid van weefseldonatie gemaakt. Sterfgevallen worden vervolgens gescreend op aandoeningen die mogelijk resulteren in weefsel van slechte kwaliteit, met inbegrip van langdurige pre-mortem hypoxie, enorm destructief hersenweefsel (bijv. grote intracraniële bloeding, uitgebreide bi-hemiferische beroertes, extensieve tumor Last), verlengde ventilator ondersteuning (> 3 dagen) en langdurig gebruik van vasoactieve agentia (> 3 dagen) vóór de dood. Wanneer een medische examinator betrokken is bij een overlijden, kan de studie-neuroloog met de medische onderzoeker spreken om een manier te onderzoeken om tijdige weefsels te ontvangen zonder afbreuk te doen aan de verantwoordelijkheid van de medische examinator. Als er levensvatbare weefsels aanwezig zijn, wordt schriftelijke toestemming verkregen (indien niet voor het slachten verkregen) en worden preparaten gemaakt voor het vervoer van het lichaam. Een eerder gecontracteerde decedent-transportdienst wordt vervolgens gecontacteerd voor transport naar de MRI-faciliteiten in de Cleveland Clinic. Zorg wordt besteed om ervoor te zorgen dat het lichaam op kamertemperatuur blijft en niet in de koeling wordt geplaatst, omdat lagere lichaams temperaturen gepaard gaan met veranderingen in de kenmerken van het MRI-signaal.
Klinische geschiedenis Klinische geschiedenis bevat informatie over de diagnose van MS, aanvang van de symptomen, gebruikte behandelingen, resultaten van klinische en para-klinische testen (evoked potentials, cerebrospinale vloeistof resultaten, optische coherentie tomografie), multiple sclerose functionele composiet en uitgebreide invaliditeits status schaal (EDSS; feitelijk of geschat), die worden verzameld uit het medische dossier (indien beschikbaar) en direct interview van Next of kin. Ook wordt een pre-mortem MRI verzameld.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

We beschrijven een Rapid tissue donatieprogramma voor individuen met multiple sclerose (MS) dat vereist dat wetenschappers en technici op afroep 24/7, 365 dagen per jaar zijn. Deelnemers geven toestemming om hun hersenen en ruggenmerg te doneren. De meeste patiënten werden gevolgd door neurologen in het Cleveland Clinic Mellen Center voor MS behandeling en onderzoek. Hun klinische cursussen en neurologische handicaps zijn goed gekarakteriseerd. Kort na de dood wordt het lichaam getransporteerd naar het MS Imaging Center, waar de hersenen in situ worden gescand door 3 T magnetische resonantie beeldvorming (MRI). Het lichaam wordt vervolgens overgebracht naar de autopsie kamer, waar de hersenen en het ruggenmerg worden verwijderd. De hersenen zijn verdeeld in twee hersenhelften. Een halve bol wordt onmiddellijk in een snijden box geplaatst en alternatieve 1 cm dikke plakjes worden ofwel in 4% Paraformaldehyde vastgesteld voor twee dagen of snel bevroren in droogijs en 2-methylbutaan. De korte-vaste hersen segmenten worden opgeslagen in een cryopreservatie-oplossing en gebruikt voor histologische analyses en immunocytochemische detectie van gevoelige antigenen. Bevroren plakjes worden opgeslagen bij-80 °C en gebruikt voor moleculaire, immunocytochemische en in situ hybridisatie/RNA Scope studies. Het andere halfrond wordt gedurende enkele maanden in 4% Paraformaldehyde geplaatst, in de snijden box geplaatst, opnieuw gescand in de 3 T magnetische resonantie (Mr) scanner en gesneden in centimeter dikke plakjes. Postmortem in situ Dhr images (Mri's) zijn samen geregistreerd met 1 cm dikke hersen schijfjes om de correlaties van MRI-pathologie te vergemakkelijken. Alle hersen schijfjes worden gefotografeerd en hersenletsels worden geïdentificeerd. Het ruggenmerg wordt in 2 cm segmenten gesneden. Alternatieve segmenten worden vastgesteld in 4% Paraformaldehyde of snel bevroren. De snelle aanschaf van postmortem MS-weefsels maakt pathologische en moleculaire analyses mogelijk van MS-hersenen en ruggengraat koorden en pathologische correlaties van MRI-afwijkingen in de hersenen. De kwaliteit van deze snel verwerkte postmortemweefsels (meestal binnen 6 h van de dood) is van grote waarde voor MS-onderzoek en heeft geresulteerd in veel high-impact ontdekkingen.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Multiple sclerose is een inflammatoire demyelinerende ziekte zonder genezing. Analyse van hersenweefsel biedt belangrijke aanwijzingen om de pathogenese van de ziekte te begrijpen. Hier bespreken we de methodologie en downstreamanalyse van MS hersenweefsel verzameld via een uniek snel autopsie programma in werking in de Cleveland Clinic.

Uitgebreid autopsie programma voor individuen met multiple sclerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Het doel van ons onderzoek is het bestuderen van de pathogenese van multiple sclerose. Om dit doel te bereiken hebben we een snel autopsieprogramma opgezet om de hersenen van personen met MS te verkrijgen en te bestuderen. Er zijn twee speciale aspecten van ons autopsieprogramma, de eerste is dat het snel is. We verzamelen dat de hersenen minder dan zes tot acht uur dood zijn.Dit zorgt voor state of the art moleculaire studies. Het tweede aspect is dat we een MRI in situ doen voordat we de hersenen verplaatsen. Dit stelt ons in staat om pathologische veranderingen te correleren met veranderingen in de beeldvorming van de hersenen.Visuele demonstratie stelt kijkers in staat om te begrijpen hoe we onze ruimte en tijd organiseren om optimale resultaten te bereiken. Weefselverwerking dat snel en zorgvuldig gebeurt, zorgt voor RNA-analyse, immunostaining, immunoblotting en MRI-correlaties. Nieuwe onderzoekers kunnen worstelen met de verwerking van weefsels met een slechte weefselintegriteit.Het vermijden van lange post mortem fixatie tijden is belangrijk en MRI weefsel corde strepen kan uitdagend zijn, zodat overleg met MRI-analyse deskundigen kan zeer nuttig zijn. Het demonstreren van de procedure zal Worden Emilie Christie en Christina Volsko. Technici van ons lab.Na In situ magnetische resonantie beeldvorming, wegen en fotograferen van de hersenen en plaats een bijgevoegde dura in een container van 4%Paraformaldehyde of PFA. Scheid het cerebellum en de hersenstam van de cerebrum en fotografeer de cerebrum. Gebruik een sonde om de optische zenuwen, chiasm en traktaten te scheiden en de structuur te voorzien van een scalpel.Scheid de hersenhelften in de lengterichting en fotografeer elk halfrond individueel. Inkt de primaire motorische cortex of PMC voor de linker hersenhelft, herfotograferen het weefsel en plaats het weefsel in een 3,3 liter container voor lange fixatie. Om de PMC voor de rechter hemisfeer te verkleinen verwijder de bekledingsingen en herfotograferen het weefsel.Volgende resect de PMC met behulp van een scalpel. Fotografeer vervolgens de gereseceerde PMC naast het halfrond. Snijd de PMC in zes even grote secties en inkt het rostral aspect van elke sectie.Plaats vervolgens elke andere sectie in PFA gevulde containers voor korte fixatie. En snap bevriezen de resterende secties voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer een. Snijd de rechter hersenhelft voorste naar achterste in een centimeter dikke coronale secties.Fix elke andere sectie in PFA en snap bevriezen de resterende secties voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer een. Scheid de hersenstam van het cerebellum en plaats de hersenstam in een PFA gevulde container voor korte fixatie. Snijd elk cerebellar halfrond in vier even vaste sagittale secties en fotografeer de mediale en laterale uitzichten.Plaats vervolgens de linker hersenhemisferische plakjes in een container van PFA voor korte fixatie. En snap bevriezen de juiste cerebellar hemisferische plakjes voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer een. Na het verkrijgen van het ruggenmerg met de zenuwwortels verwijder het ruggenmerg dura mater en bewaar de dura in PFA.Scheid de linker en rechter voorste en achterste zenuwwortels en snijd de linker voorste en achterste zenuwwortels van het ruggenmerg voor korte fixatie in PFA. Snijd de rechter voorste en achterste zenuwwortels uit het ruggenmerg en snap bevriezen deze weefsels voor opslag in verzegelde diepvrieszakken, in koeler nummer twee. Fotografeer vervolgens de caudal-meest 20 centimeter van het ruggenmerg en snijd twee centimeter overdracht secties van de staart naar rostral richting van het koord voor PFA korte fixatie en snap bevriezing.Fotografeer vervolgens het resterende rostralgedeelte van het ruggenmerg. En snijd twee centimeter overdracht secties van de caudal naar rostral richting van het snoer voor PFA korte fixatie en snap bevriezing. Snijd delen van de rente uit de korte of lange vaste weefsels.Plaats de secties in individuele putten van een zes put plaat en was de weefsels met drie vijf minuten wast in twee milliliter verse PBS per was, met schudden. Voor antigeen ophalen, magnetron de secties gedurende twee tot drie minuten in een glazen beker met ongeveer 30 milliliter van 10 millimollar citraat buffer. Wanneer de secties zijn afgekoeld tot kamertemperatuur de overdracht van de monsters in een nieuwe zes put plaat voor drie vijf minuten wasbeurten en twee milliliter PBS, plus 0,3%Triton X-100 per put, per wasbeurt.Gevolgd door endogene peroxidase blokkeren in twee milliliter van 3% waterstofperoxide plus 0,3%Triton X-100 in PBS gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de secties drie keer in twee milliliter PBS plus Triton X-100 per wasbeurt, zoals aangetoond. Gevolgd door het blokkeren in twee milliliter van 3% normale geitenserum en PBS plus Triton X-100 gedurende een uur bij kamertemperatuur.Vervolgens, incubeer de secties van 's nachts tot vijf dagen in de primaire antilichamen van belang bij vier graden Celsius, gevolgd door drie vijf minuten wast in twee milliliter PBS per wasbeurt. Incubeer de secties in avidin-biotine complexe oplossing of ABC complex gedurende een uur, bij kamertemperatuur. Volg dit met drie vijf minuten wasbeurten in PBS.Label de secties met twee milliliter gefilterde Diaminobenzidine aangevuld met waterstofperoxide per goed gedurende drie tot acht minuten. Wanneer de kleur voldoende is ontwikkeld, was de secties drie keer in PBS en breng elke sectie individueel over naar een met PBS gevulde container. Plaats elke sectie plat, onder individuele weefselglijbanen.En til elke glijbaan voorzichtig uit de PBS, zodat de secties zo plat mogelijk blijven. Gebruik twee kwasten om elk weefsel voorzichtig af te vlakken en uit te rekken. En gebruik een papieren handdoek om het overtollige water weg te deppen.Monteer vervolgens de secties met een passend montagemedium en verzegel elke afslag met duidelijke nagellak. Weefselsecties worden onderzocht op de aanwezigheid van witte stoflaesies en de geselecteerde gebieden worden vastgehouden op immuunactiviteit en demyelinatie. In acute Multiple Sceloris laesies fungeren veel van deze gedemyelineerde axonen als axonale intrekkingsbollen die de proximale uiteinden van doorgesneden axonen weerspiegelen.De dichtheid van doorgesneden axonen in acute laesies overschrijdt 11000 per kubieke millimeter in actieve laesies in vergelijking met slechts 15 in aangrenzende niet-lesional witte stof regio's. Nieuw gegenereerde oligodendrocyten zijn ook aanwezig in veel chronische MS-laesies. Deze processen associëren met, maar niet myelinaat gedemyelineerde axonen.Een representatieve, onbevooroordeelde zoektocht naar neuronale genveranderingen in snel bevroren motorcorscoors verkregen van chronische MS-patiënten, identificeerde significante reducties in 23 nucleaire en gecodeerde mitochondriale boodschapper RNA's Credentialing studies met behulp van immunocytochemie en in situ hybridisatie aangegeven dat deze genen waren sterk verrijkt in corticale projectie neuronen en dat mitochondondriën geïsoleerd van projectie ax displayons verminderde glycolyse. Vergelijking van de neuronode genexpressie in geïhileerde en gedemyerineerde hippocampi onthult reducties in neuronale boodschapper RNA's met inbegrip van eiwitten die betrokken zijn bij het geheugen en leren. Verder, in vergelijking met controle cortices, corticale neuronale verlies is aanzienlijk groter in een sub populatie van MS-patiënten die demyelinatie van het ruggenmerg en de hersenschorst, maar niet van de cerebrale witte stof.Zorg er tijdens weefselverwerking voor dat ze bij het snijden van de coronale secties consequent worden gesneden met betrekking tot dikte en oriëntatie. En dat ze plat liggen als ze in een fixatief zweven of als ze bevroren zijn. Naast de immunohistochemische analyse biedt de diepvriesweefselcollectie ons de mogelijkheid om genetische en proteomische analyse uit te voeren.Deze technieken hebben geholpen bij de identificatie van een nieuw cohort van MS-patiënten met cerebrale witte stof laesies op MRI, maar zonder significante witte stof demyelinatie. Genoemd Myelocortical MS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Met behulp van de Theta-Burst protocol bij Mechasnism van plasticiteit Ontdek bij mensen met fragiele X syndroom en autisme

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Geautomatiseerde Sholl Analyse van Gedigitaliseerde Neuronale morfologie op meerdere schalen

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Multiple-muis neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

Een uitgebreide protocol voor handmatige segmentatie van de mediale temporale lob Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Het meten van progressieve neurologische Disability in een muismodel van Multiple Sclerose

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Gegeneraliseerde psychofysiologische interactie (PPI) analyse van geheugen gerelateerde connectiviteit in personen die erfelijk risico op de ziekte van Alzheimer

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Functionele MRI in combinatie met een nieuw, met MRI compatibel, hand-geïnduceerde robot apparaat om revalidatie te evalueren van individuen die herstellen van handgreep tekorten

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Chronische implantatie van meerdere flexibele polymeer elektrode arrays

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Computergebaseerd Multitaper Spectrogram programma voor Elektroencephalografische gegevens

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...