Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

המחברים גם רוצים להודות לד ר כריסטופר נלסון על מערכת הסיוע. תוכנית הנתיחה שלאחר המוות נתמכת בחלקו על ידי R35 גראנט NS097303 ל-BDT. העבודה במעבדה של RD נתמכת על ידי מענקים מ-NINDS (NS096148) והאגודה הלאומית לטרשת נפוצה, ארה ב (RG 5298).

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1-/T2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis.">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li><li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

אנו מתארים פרוטוקול ששימש להשיג ולעבד במהירות רקמות מ 150 אנשים עם MS. תכונה חשובה של פרוטוקול זה היא כי המדענים לנצל את הרקמה הם גם אחראי על הקמת הפרוטוקול וביצוע אוסף הרקמה. הדבר מספק גמישות בעמידה בצרכים המדעיים של פרוייקטי מחקר בודדים. כמה היבטים של פרוטוקול זה לשפר את השירות שלה. המטופלים בדרך כלל מאופיינים היטב לפני המוות, כפי שרבים מהם הופעלו על ידי נוירולוגים במרכז שלנו. צעד קריטי הוא עיבוד תרומות רקמות זמן קצר לאחר המוות, אשר מגביר את איכות הרקמה הקפואה לעומת כמה בנקים מוח אחרים. הדבר מאפשר מחקרים מולקולריים בעלי ערך רב בתיאור שינויים במוצרי הגנים הטרנסג והטרנסלקליים, החיוניים למתן תצפיות היסטולוגיות ואימונוטוקוכימיקלים. מינוף של נתונים מורפולוגיים/אימונולוציקליים ומולקולריים על פני מספר מקרים מגביר את האמינות של המסקנות. זה מומחש הטוב ביותר על ידי התיאור שלנו של שינויי גנים מיטוכונדריאלי בקליפת מוחין ושינויי גנים עצביים בהיפוקמפוס מיאלואידית. הרומן פרופילים גנים מפותחים בקצב מהיר את הרקמה הקפואה בבנק שלנו צריך לספק RNA באיכות גבוהה עבור רקמות וניתוח תא בודד.
היבט מוערך נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא פרוסות המוח הקצרות והקבועות. רקמות אלה חותכים לתוך 30 μm-עבה, מקטעים צף חינם. סעיפים אלה אידיאליים לשימוש במיקרוסקופיה מיקרוקלית כדי לנתח שני אנטיגנים או יותר בשלושה מימדים. דוגמאות טובות כוללות את האינטראקציה של תהליכים אוליגודנדרוציטים טרום מיאלואידית עם אקסונים הדיסטרודים בנגעים MS כרונית, כמו גם זיהוי של חיבורי אקסונים בודד כדי להיות נורות הנסיגה אקסונים. זה בניגוד לשימוש שגרתי של 7 μm-עבה מקטעים פרפין, שבו תמונות 3D אינם ריאלי. פרפין-רקמות מוטבעות יש ערך רב עבור כמה שאלות, במיוחד את הקוונפיקציה של צפיפות עצבית במיספרה 7 μm-מקטעים עבים. לפיכך, הפרוטוקולים שלנו לעיבוד רקמות מגוונים ומספקים גמישות כדי להבטיח רקמות קבועות וקפואות במהירות.
מאפיין ייחודי נוסף של הפרוטוקול שלנו הוא ה-MRI של המוח באתרו. המוח MRIs הם ביואריקר. חסר תחליף של מחלת הטרשת נפוצה לכן חיוני לבסס את האפקטים הפתולוגיים של אותות MRI חריגים. המחקרים שלנו הקימו כי הן T2 בלבד ו T2T1MTR ROIs הן לעתים קרובות מיאלואידית. ממצא זה תומך בצורך ביותר שיטות דימות ספציפיות יותר, אשר מבחינים באופן מהימן בין החומר הלבן של המוח המיאלואידית והמיאלואידית. MRI נראה רגיש לזיהוי של מיאלין, אבל המחקרים שלנו מדגימים כי אפילו שילוב של T1/T2/MTR אינו ספציפי לזיהוי מיאלונציה. הפרוטוקול שלנו לאחר המוות מספק פלטפורמה אידיאלית לבדיקת היכולת של שיטות דימות חדשות כדי להבחין בין החומר הלבן המוח המנטול והמיאלואידית. MRI מספק גם את הרכב האידיאלי לתרגום של תוצאות המדע הבסיסי לתוך הפרקטיקה הקלינית, בהינתן השימוש ב-MRI במחקר הטרנסלאליות שלנו והשימוש הקליני הנרחב שלה בחולים חיים.
בעוד חיתוך קצר, ארוך קבוע, כמו גם פרוסות קפואות מציע יתרון לעיבוד רקמות במצבים מרובים עבור מחקרים שונים, יש כמה מגבלות עם שיטה זו. ייתכן שהערכת כולו של מבנה עשויה להיות מוגבלת כאשר חלקים ממנו עשויים להיות מעובדים באופן שונה בפרוסות סמוכות. הנפח הגדול של קופת הרקמה, עם זאת, מציע את היכולת לחקור מבנה של עניין בנושאים מרובים כדי לשפר את הדגימה. מגבלה כללית נוספת למחקרים ניצול רקמות שלאחר המוות היא שהם חוצים את החתך. מסקנות בנוגע לתזמון והתקדמות של שינויים צריכים להתפרש בהקשר זה. ייתכנו הטיית בחירה לחולים שתורמים את הרקמות שלהם, אשר עשויים להגביל את הכללה של נתונים לכל המטופלים עם MS. מכיוון שרוב התורמים מתים מסיבוכים של MS מתקדמת, זה לא יכול להיות מתאים להסיק ממצאים מהחולים האלה לאלה בשלבים המוקדמים של MS. עם זאת, קיבלנו רקמות מחולים צעירים שמתו מתנאים שאינם הקשורים ל-MS (כלומר, אוטם שריר הלב חריפה, מנת יתר של התרופה, התאבדות). היקף הפרוטוקול שלנו אינו כולל דגימת איברים אחרים (למשל, מח עצם ומערכת העיכול) אשר היו מעורבים ב-MS. אנו מאמינים כי העוצמות של התוכנית עולה במידה רבה על מגבלותיו.

אחת הדרכים הטובות ביותר לחקר מחלה היא לבחון את הרקמה החולה עצמה. זה מציג אתגרים לאלה הלומדים מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CN). ביופסיות של המוח החולה וחוט השדרה הם נדירים מאוד ובדרך כלל כרוכים במקרים חריגים. שיעורי הנתיחה שלאחר המוות עבור אנשים עם מחלות האבל ירדו באופן דרמטי בשנים האחרונות, וכאשר מבוצע, הם לעתים קרובות לא מספקים רכש מהיר של רקמות. אתגרים אלה הביאו להקמת בנקים מבוססי מחלות במוח, כולל מספר התמקדו באיסוף רקמות מאנשים עם טרשת נפוצה (MS). MS היא מחלה דלקתית בתיווך של ה-CN שהורס המיאלין, oligodendrocytes הפוך (תאים ויוצרים המיאלין), נוירונים, ו axons. רוב המטופלים MS יש קורס bi-phasic מחלה המתחיל עם התקפי נכות נוירולוגית עם התאוששות משתנה, כי בסופו של דבר מתפתחת לתוך מחלה מתקדמת בהדרגה, כי הוא סביר נוירוניווניות בטבע1. עבור רוב מוחות MS שנתרמו, מרווחי לאחר המוות (PMI) בין מוות עיבוד רקמות עולה 24 h. בעוד רקמות אלה סיפקו מידע חשוב על שינויים פתולוגיים במוח MS, הם לא מתאימים למחקרים מולקולריים מתקדמים יותר שיכולים לספק תובנות חזקות לתוך פתופסולוגיה המחלה. זה במיוחד המקרה עבור מחקרים גנים הפרופילים, אשר דורשים RNA שלם.
כדי להתגבר על המגבלות שנדונו לעיל, פיתחנו תוכנית תרומת רקמות מהירה המאפשרת לקשרי MRI/פתולוגיים. פרוטוקול זה מספק רקמות שהשתמרו היטב מתאים למחקרים מולקולאריים מודרניים ומאפשר השוואה ישירה של מחלות מוח ומומים MRI ב-MS המוחות. המרפאה בקליבלנד טרשת נפוצה רקמת התרומה התוכנית כבר בקיום מעל 20 שנים. זו התוכנית תרומת רקמה מהירה רכש את המוח ואת חוטי השדרה מאנשים עם MS ואחרים הקשורים בתנאים נוירולוגיים אוטואימוניות. התוכנית שואפת להשיג באתרו MRIs בתוך 6 h של מוות, ואחריו הסרת המוח חוט השדרה לעיבוד רקמות.
גיוס תרומות מתקבלות באמצעות הסכמה לאחר המוות שהתקבל ישירות מחולים (מוכנות מראש) או מקרובי משפחה לאחר המוות. חולים טרום הסכימו מזוהים בדרך כלל מן האוכלוסייה הקלינית במרכז Mellen לטיפול טרשת נפוצה ומחקר בקליבלנד, אוהיו. למרות העדפה בגיוס בתוכנית תרומת רקמה מהירה ניתנת לחולים שבאו בעקבות לימודי האורך, הוא פתוח לכל המטופלים שנראו במרכז. משתתפים שנרשמים לפני המוות מקבלים הוראות לבני משפחה או לנותני טיפול ליצור קשר עם צוות המחקר, בזמן המוות או כאשר המוות נחשב לקרוב. השיטה השנייה להיכנס לתוכנית תרומת הרקמה היא בזמן המוות באמצעות הסכמה של קרובי משפחה. מדינת אוהיו דורש מקרי מוות להתייחס לארגון רכש הנהוגה על ידי האיברים המנדט הפדרלי בשם LifeBanc, אשר פועל 20 מחוזות של צפון מזרח אוהיו. LifeBanc מסכי כל מקרי המוות עבור אבחנה של MS, שהיא הדרה עבור תרומת איברים. סידורים נעשו עבור LifeBanc להודיע לחוקרים מתוכנית התרומה לרקמות MS עבור כל מקרי המוות עם אבחנה משויכת של MS המתרחשים ברדיוס של 75 ק מ מהמרפאה בקליבלנד. קרובי משפחה וצוות בית החולים הם יצרו קשר על ידי צוות התוכנית תרומת רקמה והסכמה מתקבלת לתרומה של רקמות המוח וחוט השדרה. אלה שתי שיטות של גיוס לאחר המוות לאחר לאחר המוות באמצעות LifeBanc התוצאה היא כ 10-12 תרומות המוח בשנה. התאמות מבוצעו למגבלת הגיל העליון של המוות כדי לנהל את מספר ההפניות הנגזרות LifeBanc.
רכישת תרומות התוכנית דורשת 24 שעות כיסוי, 365 ימים בשנה על ידי חברים בתוכנית תרומת רקמה לרכישת רקמות. מרכזי הודעה תרומת רקמה דוא ל/זימונית/טלפון נייד המכשיר מערכת משמש את הצוות הקליני כיסוי תרומות רקמות. LifeBanc מסופק מספרים כדי ליצור קשר עם צוות הקריאה עבור תוכנית תרומת רקמות. חברים מקבלים הודעה על מוות על ידי ספקי בית החולים/קרובי משפחה (טרום הסכימו) או על ידי LifeBanc ומקורות הפניה אחרים. ראשית, קביעת זמן מוות והיתכנות לתרומת רקמות נעשתה. מקרי המוות מוקרנים אז לתנאים שעלולים לגרום לרקמה באיכות ירודה, כולל היפוקסיה ממושכת שלפני המוות, רקמת מוח הרסנית מסיבית (למשל, דימום תוך-גולגולתי גדול, משיכות דו-מיזיות נרחבות, גידול נרחב נטל), תמיכה ממושכת במכונת ההנשמה (> 3 ימים) ושימוש ממושך בסוכני vasoactive (> 3 ימים) לפני המוות. כאשר בוחן רפואי מעורב במוות, נוירולוג המחקר יכול לדבר עם הבודק הרפואי לחקור דרך לקבל רקמות בזמן מבלי להתפשר על האחריות של הבוחן הרפואי. אם הרקמה בר קיימא הוא הרגיש להיות נוכח, אז הסכמה בכתב מתקבל (אם לא התקבל טרום לאחר המוות) וההכנות נעשים עבור תחבורה הגוף. לאחר מכן נוצר קשר עם שירות הסעות בשירות ההסעות הקודם למתקני MRI במרפאת קליבלנד. הטיפול נלקח כדי להבטיח כי הגוף נשאר בטמפרטורת החדר והוא לא ממוקם לתוך קירור, כמו טמפרטורות הגוף התחתון משויכים שינויים במאפייני האות MRI.
היסטוריה קלינית ההיסטוריה הקלינית כוללת פרטים על האבחנה של MS, התפרצות של סימפטומים, טיפולים בשימוש, תוצאות של בדיקות קליני פרה קליני (מעורר פוטנציאל, התוצאות נוזל שדרתי, טומוגרפיה אופטית קוהרנטית), טרשת נפוצה פונקציונלי מרוכבים , ולהרחיב את היקף מצב הנכות (EDSS; בפועל או מוערך), אשר נאספים מהרשומה הרפואית (היכן שזמין), וראיון ישיר של קרובי משפחה. MRI מלפני המוות נאספים גם כן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

אנו מתארים תוכנית תרומת רקמה מהירה עבור אנשים עם טרשת נפוצה (MS) כי דורש מדענים וטכנאים להיות על-שיחה 24/7, 365 ימים בשנה. המשתתפים מסכימים לתרום את המוח שלהם ואת חוט השדרה. רוב המטופלים עקבו אחר הנוירולוגים במרכז הרפואי של קליבלנד קליניק לטיפול ולמחקר של MS. הקורסים הקליניים שלהם והלקויות הנוירולוגיות מאופיינים היטב. זמן קצר לאחר המוות, הגוף מועבר אל מרכז הדמיה MS, שבו המוח נסרק באתרו על ידי 3 T תהודה מגנטית דימות (MRI). הגוף מועבר לחדר הנתיחה שלאחר המוות, שם מוסרים המוח וחוט השדרה. המוח מחולק לשתי אונות. האונה האחת מונחת מיד בתיבת חיתוך ופרוסות 1 ס מ בעובי של לסירוגין הם קבועים 4% פאראפורמלדהיד במשך יומיים או קפוא במהירות בקרח יבש ו 2-מתילבוטאן. פרוסות המוח קצר קבוע מאוחסנים בתמיסה הקפאה ומשמש ניתוח היסטולוגית וזיהוי האימונוציטוטוכימיה של אנטיגנים רגישים. פרוסות קפואות מאוחסנות ב-80 ° c ומשמשות עבור מולקולרית, אימונוציטוטוכימיה, ובחקר טווח היברידיזציה/רנ א באתרו. חצי הכדור השני ממוקם 4% פאראפורמלדהיד במשך מספר חודשים, ממוקם בתיבת הפרוסות, נסרק מחדש ב 3 T תהודה מגנטית (MR) סורק ופרוסות לתוך סנטימטר-חתיכות עבות. לאחר המוות באתרו תמונות MR (MRIs) הם שיתוף הרשום עם פרוסות המוח 1 ס מ כדי להקל על היחסים של MRI-פתולוגיה. כל פרוסות המוח מצולמות ונגעים במוח הלבן מזוהים. חוט השדרה נחתך למקטעים של 2 ס מ. מקטעים חלופיים הם קבועים 4% פאראפורמלדהיד או קפוא במהירות. הרכש המהיר של רקמות MS שלאחר המוות מאפשר ניתוחים פתולוגיים ומולקולריים של מוחות ומיתרי השדרה של MS ויחסי שדרה פתולוגית של מומים MRI המוח. האיכות של אלה מעובד במהירות רקמות שלאחר המוות (בדרך כלל בתוך 6 h של מוות) הוא בעל ערך רב למחקר MS והביא תגליות רבות השפעה גבוהה.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

טרשת נפוצה היא מחלה. בלתי מיאלואידית דלקתית ללא מרפא ניתוח רקמת המוח מספק רמזים חשובים כדי להבין את הפתוגנזה של המחלה. כאן אנו דנים מתודולוגיה וניתוח במורד הזרם של רקמת המוח של MS שנאספו באמצעות תוכנית מהירה ניתוח מהיר ייחודי במבצע במרפאת קליבלנד.

שלאחר המוות תוכנית מקיפה עבור אנשים עם טרשת נפוצה

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

מטרת המחקר שלנו היא לחקור את הפתוגנזה של טרשת נפוצה. כדי להשיג מטרה זו הקמנו תוכנית נתיחה מהירה כדי להשיג וללמוד את המוח מאנשים עם טרשת נפוצה. ישנם שני היבטים מיוחדים של תכנית הנתיחה שלאחר המוות שלנו, הראשון הוא שזה מהיר. אנחנו אוספים את המוח של פחות משש עד שמונה שעות של מוות.זה מאפשר מחקרים מולקולריים מתקדמים. ההיבט השני הוא שאנחנו עושים MRI במקום לפני שאנחנו מזיזים את המוח. זה מאפשר לנו לתאם שינויים פתולוגיים עם שינויי הדמיה מוחית.הדגמה חזותית מאפשרת לצופים להבין כיצד אנו מארגנים את המרחב והזמן שלנו כדי להשיג תוצאות מיטביות. עיבוד רקמות שקורה במהירות ובזהירות מאפשר ניתוח RNA, כשל חיסוני, אימונובלוט ומתאמי MRI. חוקרים חדשים עשויים להיאבק עם עיבוד רקמות עם שלמות רקמות ירודה.הימנעות זמני קיבוע ארוך שלאחר המוות חשוב ו סטריציות רקמת MRI יכול להיות מאתגר כך התייעצות עם מומחי ניתוח MRI יכול להיות מאוד שימושי. ההדגמה של ההליך תהיה אמילי כריסטי וכריסטינה וולסקו. טכנאים מהמעבדה שלנו.לאחר דימות תהודה מגנטית במקום, לשקול ולצלם את המוח ולמקם כל דורה המצורפת במיכל של 4% Paraformaldehyde או PFA. הפרד את המוח הקטן ואת גזע המוח מן המוח הקטן ולצלם את המוח הקטן. השתמש בדיקה כדי להפריד את עצבי הראייה, chiasm ודרכיים ולכרות את המבנה עם אזמל.הפרד את ההמיספרות המוחיות לאורך ותצלם כל חצי כדור בנפרד. דיו קליפת המוח המוטורית העיקרית או PMC עבור חצי הכדור השמאלי, rephotograph את הרקמה ולמקם את הרקמה במיכל 3.3 ליטר עבור קיבעון ארוך. כדי לסלק את PMC עבור חצי הכדור הימני להסיר את קרום המוח כיסוי rephotograph הרקמה.הבא תצות את PMC באמצעות אזמל. ואז לצלם את PMC חצוי ליד חצי הכדור. חותכים את PMC לשישה חלקים בגודל שווה דיו ההיבט rostral של כל מקטע.ואז למקם כל קטע אחר לתוך מכולות מלאות PFA עבור קיבעון קצר. ולהצמיד להקפיא את החלקים הנותרים לאחסון בשקיות מקפיא אטום, קריר מספר אחד. חותכים את חצי הכדור הימני הקדמי לחלקים האחוריים לחלקים עבים של קורונול בעובי סנטימטר אחד.לתקן כל סעיף אחר PFA הצמד להקפיא את החלקים הנותרים לאחסון בשקיות מקפיא אטום, קריר מספר אחד. הפרד את גזע המוח מהמוח הקטן והצב את גזע המוח במיכל מלא PFA עבור קיבעון קצר. חותכים כל חצי כדור מוחי לארבעה קטעים קשתיים קבועים באותה מידה ולצלם את הנוף המדיאלי והצלי.לאחר מכן מניחים את פרוסות hemispheric המוח הקטן השמאלי במיכל של PFA עבור קיבעון קצר. ולהצמיד להקפיא את פרוסות hemispheric המוח הקטן הנכון לאחסון בשקיות מקפיא אטום, במקרר מספר אחד. לאחר קבלת חוט השדרה עם שורשי העצב להסיר את חוט השדרה דורה מאטר ולאחסן את דורה PFA.הפרד את שורשי העצבים הימניים והשמאליים וחותכים את שורשי העצבים האחוריים והקציניים השמאליים בחוט השדרה לצורך קיבעון קצר ב- PFA. חותכים את שורשי העצבים האחוריים והעצבים האחוריים הנכונים מ אקורד עמוד השדרה ומקפיאים את הרקמות האלה לאחסון בשקיות מקפיא אטומות, במקרר מספר שתיים. לאחר מכן לצלם את caudal-ביותר 20 ס"מ של חוט השדרה לחתוך שני מקטעי העברה סנטימטר מן caudal לכיוון rostral של החוט עבור קיבעון קצר PFA והקפאה הצמד.ואז לצלם את החלק rostral הנותר של חוט השדרה. וחותכים שני מקטעי העברה סנטימטר מן caudal לכיוון rostral של הכבל עבור קיבעון קצר PFA והקפאה הצמד. חותכים חלקים של עניין מן הרקמות הקבועות קצר או ארוך.מניחים את החלקים לתוך בארות בודדות של צלחת שש היטב ולשטוף את הרקמות עם שלוש חמש דקות שוטף בשני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף, עם רועד. לאחזור אנטיגן, יש לחמם במיקרוגל את החלקים למשך 2-3 דקות ב זכוכית המכילה בערך 30 מיליליטר של חיץ ציטראט מילימילארי של 10 מילימולרים. כאשר החלקים התקררו לטמפרטורת החדר להעביר את הדגימות לתוך צלחת חדשה שש באר במשך שלוש חמש דקות שוטף ושני מיליליטר של PBS, בתוספת 0.3% טריטון X-100 ל הבאר, לכל לשטוף.ואחריו חסימת פרוקסידאז אנדוגני בשני מיליליטר של 3%מי חמצן בתוספת 0.3% טריטון X-100 ב PBS במשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים שלוש פעמים בשני מיליליטר של PBS בתוספת טריטון X-100 לכל לשטוף, כפי שהודגם. ואחריו חסימה בשני מיליליטר של 3% סרום עזים רגיל PBS בתוספת טריטון X-100 במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הדגירה את החלקים מ לילה עד חמישה ימים בנוגדנים העיקריים של עניין בארבע מעלות צלזיוס ואחריו שלוש חמש דקות שטיפה בשני מיליליטר של PBS לכל לשטוף. הדגירה את החלקים בתסומה מורכבת אבידין ביוטין או קומפלקס ABC במשך שעה אחת, בטמפרטורת החדר. עקוב אחר זה עם שלוש חמש דקות שטיפות ב- PBS.סמן את החלקים עם שני מיליליטר של Diaminobenzidine מסונן בתוספת מי חמצן לגם במשך שלוש עד שמונה דקות. כאשר הצבע התפתח כראוי, לשטוף את החלקים שלוש פעמים PBS בנפרד להעביר כל קטע למיכל מלא PBS. מקם כל מקטע באופן שטוח, תחת שקופיות רקמה בודדות.ובעדינות להרים כל שקופית מתוך PBS, שמירה על החלקים שטוחים ככל האפשר. השתמש בשתי מברשות צבע כדי לשטח בעדינות ולמתח כל רקמה. ולהשתמש במגבת נייר כדי לטבול את המים העודפים.לאחר מכן הר את החלקים עם מדיום הרכבה מתאים ולאטום כל להחליק כיסוי עם לק ציפורניים ברור. חלקי רקמות נבדקים לנוכחות נגעים של חומר לבן והאזורות שנבחרו מוכתמות בפעילות חיסונית ו demyelination. בנגעים חריפים של Sceloris מרובים רבים של אקסונים אלה demyelinated לפעול כמו נורות נסיגה אקסונאלי המשקפות את הקצוות הפרוקסימליים של אקסונים מקוצרים.הצפיפות של אקסונים מנופים בנגעים חריפים עולה על 11000 למילימטר מעוקב בנגעים פעילים לעומת רק 15 באזורים סמוכים שאינם נגעים חומר לבן. אוליגודנדרוציטים שזה עתה נוצרו נמצאים גם בנגעים רבים של טרשת נפוצה כרונית. תהליכים אלה מקשרים עם האקסונים המהוללים אך אינם מיאלינטים אותם.חיפוש מייצג ובלתי משוחד אחר שינויים בגנים עצביים בקורטקסט מוטורי קפוא במהירות המתקבל מחולי טרשת נפוצה כרוניים, זיהה הפחתות משמעותיות ב-23 מחקרי אישורים של שליח מיטוכונדריאלי גרעיני ומקודד באמצעות אימונוציטוכימיה ובהכלאה סיטו הצביע על כך שגנים אלה הועשרו מאוד בנוירונים של הקרנה קליפתית ושמקיטוכונדריה מבודדת מאקסונים של הקרנה מציגה גליקוליזה מופחתת. השוואה של ביטוי הגן נוירונודי בהיפוקמפוס מיאלין ו demyelinated מגלה הפחתות RNA שליח עצבי כולל חלבונים המעורבים בזיכרון ולמידה. יתר על כן, בהשוואה לשליטה בקליפת המוח, אובדן עצבי קליפת המוח גדול באופן משמעותי באוכלוסיית משנה של חולי טרשת נפוצה שיש להם demyelination של חוט השדרה cortext מוחי אבל לא של החומר הלבן המוחי.במהלך עיבוד רקמות, ודא כי כאשר החלקים coronal נחתכים הם נחתכים באופן עקבי לגבי עובי וכיוון. ושהם שוכבים שטוחים כאשר צפים בתיקון או כאשר קפוא. בנוסף לניתוח האימונוהיסטוכימי, איסוף הרקמות הקפואות מספק לנו את ההזדמנות לבצע ניתוח גנטי ופרוטומי.טכניקות אלה סייעו בזיהוי של קבוצה חדשה של חולי טרשת נפוצה עם נגעים חומר לבן מוחי על MRI אבל ללא כל demyelination חומר לבן משמעותי. תם שם הספר "מיילוקורטי טרשת נפוצה".

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: שימוש בפרוטוקול תטא-Burst לחקור Mechasnism של פלסטיות של אנשים עם תסמונת X שביר אוטיזם ו

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

מקיף פרוטוקול לפילוח ידני של מבנים המדיאלי Temporal האונה

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

מדידת נכות נוירולוגית מתקדמת עכבר דגם של טרשת נפוצה

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

ניתוח אינטראקציות בין פסיכופיזיולוגיות מוכללת (PPI) של זיכרון הקשורות קישוריות אצל אנשים בסיכון גנטית למחלת אלצהיימר

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

MRI פונקציונלי בשילוב עם ה-MRI הרומן תואם יד המכשיר הרובוטי כדי להעריך שיקום של אנשים התאוששות מאחוז אחיזת ידיים

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

השרשה כרונית של מערכים גמישים אלקטרודה מרובים

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

תוכנית ספקטרוגרמה מרובת להתחל במחשב לקבלת נתונים אלקטרונצלוגרפיים

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...