우리의 연구의 목표는 다발성 경화증의 병인을 공부하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해 우리는 MS를 가진 개별에게서 두뇌를 얻고 공부하기 위하여 급속한 부검 프로그램을 설치했습니다. 우리의 부검 프로그램의 두 가지 특별한 측면이 있다, 첫 번째는 신속 하다. 우리는 죽음의 6 8 시간 미만의 뇌를 수집합니다.
이것은 예술 분자 연구의 상태를 허용합니다. 두 번째 측면은 우리가 두뇌를 움직이기 전에 시투 MRI에서 할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 병리학적 변화와 뇌 이미징 변화의 상관 관계를 맺을 수 있습니다.
시각적 데모를 통해 시청자는 최적의 결과를 얻기 위해 시간과 공간을 구성하는 방법을 이해할 수 있습니다. 신속하고 신중하게 발생하는 조직 처리는 RNA 분석, 면역 염색, 면역 블로팅 및 MRI 상관 관계를 허용합니다. 새로운 연구원은 가난한 조직 무결성으로 조직을 처리투쟁 할 수 있습니다.
긴 사후 고정 시간을 피하는 것이 중요하며 MRI 조직 코드 줄무늬는 도전적일 수 있으므로 MRI 분석 전문가와의 상담이 매우 유용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 에밀리 크리스티와 크리스티나 볼스코입니다. 우리의 실험실에서 기술자.
시투 자기 공명 이미징 후, 계량 및 촬영 뇌와 4 %의 파라 포름알데히드 또는 PFA의 용기에 부착 된 듀라를 배치합니다. 소뇌와 뇌간을 뇌관과 분리하고 뇌막을 촬영합니다. 프로브를 사용하여 시신경, 치아즘 및 요관을 분리하고 메스로 구조를 절제하십시오.
대뇌 반구를 세로로 분리하고 각 반구를 개별적으로 촬영합니다. 왼쪽 반구에 대한 기본 모터 피질 또는 PMC를 잉크, 조직을 다시 촬영하고 긴 고정을위한 3.3 리터 용기에 조직을 배치. 오른쪽 반구에 대한 PMC를 절제하려면 덮개 수막을 제거하고 조직을 다시 촬영합니다.
다음으로 메스를 사용하여 PMC를 다정합니다. 그런 다음 반구 옆에 있는 절제된 PMC를 촬영합니다. PMC를 6개의 크기 섹션으로 자르고 각 섹션의 로스트랄 측면을 잉크로 변환합니다.
그런 다음 다른 모든 섹션을 PFA 채워진 컨테이너에 배치하여 짧은 고정을 합니다. 그리고 스냅 은 쿨러 번호 1에 밀봉 된 냉동고 가방에 보관하기 위해 나머지 섹션을 동결. 오른쪽 반구 전방을 후방으로 절단하여 1센티미터 두께의 관상 부단으로 잘라냅니다.
PFA의 다른 모든 섹션을 수정하고 스냅은 밀봉 된 냉동고 가방에 보관하기 위해 나머지 섹션을 쿨러 번호 1로 동결합니다. 뇌간을 소뇌로부터 분리하고 뇌간을 PFA 채워진 용기에 넣고 짧은 고정을 하십시오. 각 소뇌 반구를 동등하게 고정된 4개의 처질 섹션으로 자르고 내측 및 측면 보기를 촬영합니다.
그런 다음 왼쪽 소뇌 반구 조각을 PFA 용기에 넣고 짧은 고정을 하십시오. 그리고 스냅은 밀봉 된 냉동고 가방에 보관할 수있는 오른쪽 소뇌 반구 슬라이스를 쿨러 번호 1로 동결합니다. 신경 뿌리로 척수를 얻은 후 척수 dura mater를 제거하고 PFA에 듀라를 저장합니다.
좌우 전방 및 후방 신경 뿌리를 분리하고 PFA에서 짧은 고정을 위해 척수에서 왼쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 잘라냅니다. 척추 코드에서 오른쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 잘라 스냅 은 쿨러 번호 2에 밀봉 냉동고 가방에 저장하기 위해이러한 조직을 동결. 그런 다음 척수의 가장 20 센티미터를 촬영하고 PFA 짧은 고정 및 스냅 동결을위한 코드의 장밋 방향으로 코달에서 두 센티미터 전송 섹션을 잘라.
그런 다음 척수의 나머지 장밋빛 부분을 촬영합니다. 그리고 PFA 짧은 고정 및 스냅 동결을 위한 코드의 장밋 방향으로 코달에서 2센티미터 전송 섹션을 잘라. 짧거나 긴 고정 조직에서 관심 섹션을 잘라.
6 개의 우물 접시의 개별 우물에 섹션을 놓고 3 5 분 세척 당 신선한 PBS2 밀리리터에 티슈를 씻어 흔들어 놓습니다. 항원 회수의 경우, 10 밀리몰라 구연산 완충제의 약 30 밀리리터를 포함하는 유리 비커에서 2 ~ 3 분 동안 섹션을 전자 레인지. 섹션이 실온으로 냉각되면 샘플을 새로운 6 개의 우물 플레이트로 옮겨 3 5 분 세척및 PBS 2 밀리리터, 플러스 0.3 % Triton X-100 의 세차세척당.
내인성 과산화수소 3%의 2밀리리터와 실온에서 30분 동안 PBS에서 0.3%트리톤 X-100을 차단합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS2밀리리터와 트리톤 X-100의 2밀리리터로 섹션을 세 번 세척하여 세척할 수 있습니다. 그 다음으로 3%의 일반 염소 세럼과 PBS 플러스 트리톤 X-100의 2밀리리터를 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
다음으로, 4°C에서 관심있는 1 차 항체에서 하룻밤에서 5 일까지 섹션을 배양한 다음 세척 당 PBS2 밀리리터에서 3 5 분 세척합니다. 실온에서 아비딘-비오틴 복합 솔루션 또는 ABC 복합 단지에서 1시간 동안 구역을 배양합니다. PBS에서 3 5 분 세차처리와 함께이 후속.
3~8분 동안 과산화수소로 보충된 여과된 Diaminobenzidine의 2밀리리터로 섹션에 라벨을 부착하십시오. 색상이 적절하게 개발되면 PBS에서 섹션을 세 번 세척하고 각 섹션을 PBS 채워진 용기로 개별적으로 옮겨냅니다. 개별 조직 슬라이드 아래에 각 섹션을 평평하게 배치합니다.
그리고 PBS에서 각 슬라이드를 부드럽게 들어 올려 섹션을 가능한 한 평평하게 유지합니다. 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 각 조직을 부드럽게 평평하게 하고 스트레칭합니다. 그리고 여분의 물을 멀리 두드리기 위해 종이 타월을 사용합니다.
그런 다음 적절한 장착 매체로 섹션을 장착하고 명확한 매니큐어로 각 커버 슬립을 밀봉합니다. 조직 섹션은 백색 물질 병변의 존재를 위해 검토되고 선택된 지역은 면역 활동 및 탈민화를 위해 염색됩니다. 급성 다중 Sceloris 병변에서 이러한 탈량제 축축의 많은 횡포 축축의 근접 끝을 반영하는 축 축 회수 전구 역할을.
급성 병변에 있는 치석 형축의 밀도는 인접한 비 레지오탈 백색 물질 지구에 있는 단지 15에 비교된 활성 병변에 있는 입방 밀리미터 당 11000를 초과합니다. 새로 생성된 올리고드엔드로키테는 또한 많은 만성 MS 병변에 존재한다. 이러한 프로세스는 데미엘리네이트 축축과 관련이 있지만 myelinate하지는 않습니다.
만성 MS 환자로부터 얻은 급속냉동 모터 코르텍스트의 신경 유전자 변화에 대한 대표적인 편견없는 검색은 면역 세포화학및 시상 혼성화를 이용한 23개의 핵 및 코딩된 미토콘드리아 메신저 RNA의 자격 증명 연구에서 상당한 감소를 확인했으며, 이러한 유전자는 피질 프로젝션 뉴런에서 매우 풍부하고 미토콘드리아가 돌전으로부터 분리된 것으로 나타났습니다. 골수화 및 탈모증 해마에서 신경 노드 유전자 발현의 비교는 기억과 학습에 관련된 단백질을 포함하여 신경 메신저 RNA의 감소를 알 수 있습니다. 또한, 관제에 비해, 피질 뉴런 손실은 척수와 대뇌 코르텍스트의 탈모가 있지만 대뇌 백색 물질의 경우는 없는 MS 환자의 하위 집단에서 현저히 더 크다.
조직 처리 중에 관상 동맥 단면도가 절단될 때 두께및 방향에 대해 일관되게 절단되는지 확인하십시오. 그리고 그들은 고정에 떠있을 때 또는 얼어 붙을 때 평평하게 놓여 있습니다. 면역조직화학적 분석 외에도 동결조직 수집은 유전적 및 프로테오믹 분석을 수행할 수 있는 기회를 제공한다.
이 기술은 MRI에 대뇌 백색 물질 병변을 가진 MS 환자의 새로운 집단의 확인에 도움이 되었지만 어떤 중요한 백색 물질 탈근 없이. Myelocortical MS라고 불림.
