Omfattende obduksjon program for personer med multippel sklerose

Målet med vår forskning er å studere patogenesen av multippel sklerose. For å oppnå dette målet har vi etablert et raskt obduksjonsprogram for å oppnå og studere hjernen fra personer med MS. Det er to spesielle aspekter ved obduksjonsprogrammet vårt, det første er at det er raskt. Vi samler hjernen er under seks til åtte timers død.

Dette gjør det mulig for toppmoderne molekylære studier. Det andre aspektet er at vi gjør en in situ MR før vi beveger hjernen. Dette gjør at vi kan korrelere patologiske endringer med hjerneavbildningsendringer.

Visuell demonstrasjon gjør det mulig for seerne å forstå hvordan vi organiserer vår plass og tid for å oppnå optimale resultater. Vevsbehandling som skjer raskt og forsiktig tillater RNA-analyse, immunstaining, immunoblotting og MR-korrelasjoner. Nye forskere kan slite med behandling av vev med dårlig vevsintegritet.

Unngå lange post mortem fiksering ganger er viktig og MR vev corde striations kan være utfordrende så konsultasjon med MR analyse eksperter kan være svært nyttig. Viser prosedyren vil være Emilie Christie og Christina Volsko. Teknikere fra laboratoriet vårt.

Etter In situ magnetisk resonansavbildning, veie og fotografere hjernen og plassere en vedlagt dura i en beholder med 4% Paraformaldehyd eller PFA. Skill lillehjernen og hjernestammen fra cerebrum og fotografer cerebrumen. Bruk en sonde til å skille optiske nerver, chiasm og traktater og resect strukturen med en skalpell.

Skill de cerebrale halvkulene langsgående og fotografer hver halvkule individuelt. Blekk den primære motorcortex eller PMC for venstre halvkule, rephotograph vevet og plassere vevet i en 3,3 liters beholder for lang fiksering. For å avgiftsdirektoratet PMC for høyre halvkule fjerne dekker meninges og rephotograph vevet.

Neste resect PMC ved hjelp av en skalpell. Deretter fotografere den nye PMC ved siden av halvkule. Skjær PMC i seks like store seksjoner og blekk rostral aspektet av hver seksjon.

Plasser deretter alle andre seksjoner i PFA-fylte beholdere for kort fiksering. Og klikk fryse de resterende seksjonene for lagring i forseglede fryseposer, i kjøligere nummer én. Skjær høyre halvkule fremre til bakre i en centimeter tykke koronale seksjoner.

Fest alle andre seksjoner i PFA og klikk fryse de resterende seksjonene for lagring i forseglede fryserposer, i kjøligere nummer én. Skill hjernestammen fra lillehjernen og legg hjernestammen i en PFA fylt beholder for kort fiksering. Klipp hver lillehjernen halvkule i fire like faste sagittal seksjoner og fotografer medial og lateral utsikt.

Plasser deretter de venstre lillehjernen hemisfæriske skiver i en beholder med PFA for kort fiksering. Og snap fryse høyre lillehjernen hemispheric skiver for lagring i forseglede fryser poser, i kjøligere nummer én. Etter å ha fått ryggmargen med nerverøttene, fjern ryggmargsdumaen og lagre duraen i PFA.

Skill venstre og høyre fremre og bakre nerverøtter og kutt venstre fremre og bakre nerverøtter fra ryggmargen for kort fiksering i PFA. Klipp høyre fremre og bakre nerverøtter fra spinalakkordet og klikk fryse disse vevene for lagring i forseglede fryseposer, i kjøligere nummer to. Deretter fotografere caudal-de fleste 20 centimeter av ryggmargen og kutte to centimeter overføringsseksjoner fra caudal til rostral retning av ledningen for PFA kort fiksering og snap frysing.

Deretter fotograferer du den gjenværende rostraldelen av ryggmargen. Og kutt to centimeter overføringsseksjoner fra caudal til rostral retning av ledningen for PFA kort fiksering og snap frysing. Klipp deler av interesse fra det korte eller lange faste vevet.

Legg seksjonene i individuelle brønner av en seks brønnplate og vask vevet med tre fem minutters vasker i to milliliter frisk PBS per vask, med risting. For antigenhenting, mikrobølgeovn seksjonene i to til tre minutter i et glassbeger som inneholder omtrent 30 milliliter på 10 millimollar citrate buffer. Når seksjonene er avkjølt til romtemperatur, overfører prøvene til en ny seksbrønnplate i tre fem minutters vasker og to milliliter PBS, pluss 0,3% Triton X-100 per brønn, per vask.

Etterfulgt av endogene peroksidaseblokkering i to milliliter med 3% hydrogenperoksid pluss 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter, ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask seksjonene tre ganger i to milliliter PBS pluss Triton X-100 per vask, som demonstrert. Etterfulgt av blokkering i to milliliter med 3% normal geit serum og PBS pluss Triton X-100 i en time ved romtemperatur.

Deretter inkubere seksjonene fra over natten til fem dager i de primære antistoffene av interesse ved fire grader celsius etterfulgt av tre fem minutters vasker i to milliliter PBS per vask. Inkuber seksjonene i ivrig-biotin kompleks løsning eller ABC kompleks i en time, ved romtemperatur. Følg dette opp med tre fem minutters vasker i PBS.

Merk seksjonene med to milliliter filtrert Diaminobenzidin supplert med hydrogenperoksid per brønn i tre til åtte minutter. Når fargen er tilstrekkelig utviklet, vask seksjonene tre ganger i PBS og overfør hver seksjon individuelt til en PBS-fylt beholder. Plasser hver seksjon flatt, under individuelle vevslyser.

Og løft forsiktig hver skyve ut av PBS, holde seksjonene så flate som mulig. Bruk to pensler for å forsiktig flate ut og strekke ut hvert vev. Og bruk et papirhåndkle til å dab bort overflødig vann.

Monter deretter seksjonene med et passende monteringsmedium og forsegle hvert dekselslipp med klar neglelakk. Vevsseksjoner undersøkes for tilstedeværelse av hvite materielesjoner, og de valgte regionene er farget for immunaktivitet og demyelinasjon. Ved akutte multippelsceloris lesjoner mange av disse demyelinerte aksoner fungerer som aksonale tilbaketrekking pærer som gjenspeiler de proksimale endene av transected aksoner.

Tettheten av transponerte aksoner i akutte lesjoner overstiger 11000 per kubikkmillimeter i aktive lesjoner sammenlignet med bare 15 i tilstøtende ikke-leional hvite materieregioner. Nygenererte oligodendrocytter er også til stede i mange kroniske MS-lesjoner. Disse prosessene forbinder med, men ikke myelinate demyelinated aksoner.

En representativ, objektiv søk etter nevronale genendringer i raskt frosne motorkorttekst hentet fra kroniske MS-pasienter, identifiserte signifikante reduksjoner i 23 kjernefysiske og kodede mitokondriebudRNA's Credentialing-studier ved hjelp av immunocytokjemi og in situ hybridisering indikerte at disse genene var svært beriket i kortikale projeksjonsnevroner og at mitokondrier isolert fra projeksjonaksoner viste redusert glykose. Sammenligning av neuronode genuttrykk i myelinated og demyelinated hippocampi avslører reduksjoner i neuronal messenger RNA inkludert proteiner involvert i hukommelse og læring. Videre, sammenlignet med kontroll kortikammer, kortikale neuronal tap er betydelig større i en sub populasjon av MS-pasienter som har demyelination av ryggmargen og cerebral cortext, men ikke av cerebral hvit materie.

Under vevsbehandling, sørg for at når koronale seksjoner kuttes, kuttes de konsekvent med hensyn til tykkelse og orientering. Og at de ligger flatt når de flyter i et fikseringsmiddel eller når de er frosset. I tillegg til immunohistokjemisk analyse gir den frosne vevsamlingen oss muligheten til å gjennomføre genetisk og proteomisk analyse.

Disse teknikkene har hjulpet til med identifisering av en ny kohort av MS-pasienter med cerebrale hvite materielesjoner på MR, men uten noen signifikant demyelinasjon av hvit materie. Betisk myelocortisk MS.