Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Forfatterne vil også gjerne takke Dr. Christopher Nelson for redaksjonell bistand. Obduksjon programmet støttes delvis av R35 gi NS097303 til BDT. Arbeid i laboratoriet av RD er støttet av tilskudd fra NINDS (NS096148) og National Multiple sklerose Society, USA (RG 5298).

Denne protokollen er godkjent av Cleveland Clinic institusjonelle gjennomgang Board og følger retningslinjer for Cleveland Clinic menneskelig forskning etikk komiteen.
1. i situ MRI
<ol><li>Ta donor kroppen til MRI-programserien og gjennomfør en 2 h MRI-protokoll ved MS Imaging Facility. Gjennomfør MRI på et 3 T-eller 7 T-Imager. Merk: Det gis prioritet til 3T ettersom de fleste eldre data er utført på 3 T, men når det ikke er tilgjengelig, er bildebehandling utført med 7T. Utpekte kjerne sekvenser er utført for alle tilfeller (tabell 1) og flere sekvenser som er avhengige av dagens forskningsinteresser utføres hvis tiden tillater det (begrenset ved å oppnå vev fiksering mindre enn 12 h etter døden). Tabell 1 beskriver kjerne sekvensene.</li>
</ol>2. obduksjon
Merk: Ved å følge MRI-en blir kroppen transportert til likhuset for hjerne-og rygg mARGs ekstraksjon med diener og vevs behandling av laboratorie medlemmer.
<ol><li>Utfør følgende trinn før kroppen ankomst på likhuset. To timer før, forberede 3 L av 4% paraformaldehyde (PFA) og etiketten beholdere og poser for vev lagring. Forbered 3 L av 8% PFA og fortynne 1,5 L av 8% PFA til 4% PFA. Plasser den resterende 8% PFA i 4 ° c for dag 2.</li>
	<li>Før du reiser til likhuset, fyll 2 reiser kjølere til 50% kapasitet med tørr is (store blokker brutt for å passe og små pellets).</li>
	<li>På likhuset, Fyll en rustfritt stål container halvveis med 2-methylbutane og tørr is og dekk med et lokk som forberedelse for snap frysing av vevet.</li>
	<li>Veie og fotografere hjernen en gang fjernet av diener.</li>
	<li>Plasser eventuelle vedlagte Dura i en container fylt med PFA.</li>
	<li>Skill lillehjernen og hjernestammen fra cerebrum og fotografer cerebrum.</li>
	<li>Identifiser optiske nerver, Chiasm, og traktater og separate ved hjelp av en sonde og pinsett. Resect strukturen med en skalpell. Merk: Det klare segmentet på den ene siden av den optiske nerven er merket med Higgins blekk for identifisering.</li>
	<li>Skill cerebral halvkule lengderetningen og fotografere hver halvkule individuelt.</li>
	<li>Blekk den primære motor cortex (PMC) for venstre halvkule, re-fotografere den, og legg den i en 3,3 L container for lang-fiksering. Dokumentere starttid for hjernen fiksering.</li>
	<li>PMC for høyre halvkule kan være foran eller excised.
	<ol>
<li>Hvis tilværelse excised, for det første fjerne det avdekker hjernehinnene.</li>
		<li>Re-fotografi innsatt eller excised PMC.</li>
		<li>Hvis PMC er excised, skåret i 6 like store seksjoner.</li>
		<li>Blekk rostral aspekt av hver del.</li>
		<li>Plasser Odd-nummererte seksjoner i PFA-fylte beholdere for kort fiksering.</li>
		<li>Snap-Frys selv nummererte seksjoner og plasser i forseglede fryser poser i kjøligere #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Skjær høyre halvkule fremre til bakre i 1 cm-tykke koronale seksjoner.
	<ol>
<li>Dokumentere brutto misdannelser (f.eks. skjæring av gjenstand, blødning og lesjoner).</li>
		<li>Plasser oddetalls seksjoner i beholdere fylt med PFA for kort fiksering.</li>
		<li>Fest fryse selv nummererte seksjoner og plasser i forseglede fryseposer.</li>
		<li>Dokument slutten av hjernen fiksering tid.</li>
	</ol></li>
	<li>Skill hjernestammen fra lillehjernen og plasser den i en PFA-fylt beholder for kort fiksering.
	<ol>
<li>Skill lillehjernen halvkuler lengderetningen.</li>
		<li>Skjær hver halvkule i 4 like tykke sagittal seksjoner.</li>
		<li>Fotografi midtre og lateral utsikt.</li>
		<li>Plasser venstre lillehjernen hemispheric skiver i en beholder fylt med PFA for kort fiksering.</li>
		<li>Snap-Frys høyre lillehjernen hemispheric skiver og plasser i forseglede fryser poser i kjøligere #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Få ryggmargen med nerverøtter fra diener.
	<ol>
<li>Fjern ryggmargen Dura mater og lagre Dura i en container med PFA.</li>
		<li>Skill venstre og høyre fremre og bakre nerverøtter. Skjær venstre fremre og bakre nerverøtter kuttet fra ryggmargen og plasser i en PFA fylt container for Short-fiksering.</li>
		<li>Skjær høyre fremre og bakre nerverøtter fra ryggmargen, snap-fryse, sted i forseglede fryser poser, og deretter plassere i kjøligere #2.</li>
		<li>Fotografere caudal-mest 20 cm i ryggmargen. Dokumentere plasseringen av korsryggen utvidelse.</li>
		<li>Skjær 2 cm tverrgående deler av ledningen går fra caudal til rostral.</li>
		<li>Blekk rostral aspekt av hver kuttet delen.</li>
		<li>Plasser oddetalls seksjoner i beholdere fylt med PFA for kort fiksering.</li>
		<li>Lås-fryse selv-nummererte seksjoner, plass i forseglede fryser poser, og deretter plassere i kjøligere #2.</li>
		<li>Dokumentere starttiden for rygg mARGs fiksering og eventuelle brutto misdannelser.</li>
		<li>Fotografer gjenværende rostral delen av ryggmargen.</li>
		<li>Dokumentere posisjonen til livmorhals utvidelsen. Følg trinn 2.13.5 – 2.13.8 for den gjenværende ryggmargen.</li>
	</ol></li>
	<li>Etter likhuset sted frosset vev i merkede bokser i-80 ° c frysere. Oppbevar fast vev ved 4 ° c.</li>
	<li>Ved 24 h post-obduksjon (dag 2) fortynne de resterende 8% PFA til 4%.</li>
	<li>Erstatt 4% PFA i fikserings beholdere med fersk fortynnet 4% PFA.</li>
	<li>På 60 h post-obduksjon forberede løsninger på 2,5% glutaraldehyde i 4% PFA fra glutaraldehyde, PFA, dH2O og Sorenson buffer (utarbeidet ved å blande i rekkefølge: 0,2 M fosfat buffer pH 7,4, polyvinylpyrolidone 1% w/v, sukrose 30% w/v, og etylen glykol 30% v/v).</li>
	<li>Fjern brukt 4% PFA fra kort fiksering beholdere.</li>
	<li>Skyll vevet i Sorenson buffer og legg det i cryoprotection oppløsning (glyserol 20%, 0,4 M Sorenson buffer 20%, og 0,02% natrium Natriumazid i dH2O).</li>
	<li>Fotografere korte faste hjerne skiver, lillehjernen, hjernestammen og motor cortex (hvis aktuelt).</li>
	<li>Med en skalpell blad kuttet 2 mm tykke tverrgående seksjoner fra hver 2 cm kort faste ryggmargen delen.</li>
	<li>Plasser seksjoner i 2 mL scintillation hetteglass og fyll med oppløsning på 2,5% glutaraldehyde i 4% PFA.</li>
	<li>Returner den resterende delen til det opprinnelige 20 mL scintillation hetteglasset. Skyll delen med Sorenson buffer og Erstatt med cryoprotection løsning.</li>
</ol>3. patologi
Merk: Short-faste skiver av høyre halvkule samt den lenge faste venstre halvkule (plassert i 4% PFA i flere måneder) er enten skåret i 30 μm seksjoner (referert til som fritt flytende) eller innebygd i parafin og kuttet som 12-14 μm seksjoner (referert til som parafin-embedded). Disse delene behandles vanligvis med proteolipid protein (PLP) for å oppdage demyeliniserende lesjoner og store histocompatibility kompleks II (MHC-II) for immun aktivitet ved hjelp av diaminobenzidine (DAB) metoden. Disse protokollene har blitt standardisert og brukt i flere publikasjoner2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 andre , 11 flere , Det er 12.
<ol><li>
Fritt flytende (30 μm) DAB-Avidin-biotin kompleks (ABC) tissue farging
	<ol>
<li>Fjern seksjoner fra cryostorage løsning, Overfør seksjoner til en seks-brønn plate, og vask dem 3x i 5 min hver i 2 mL 1x fosfat bufret saltoppløsning pH 7,0 (PBS). Ved overføring til neste brønn i seks-brønn plate bruk forsiktighet for ikke å rive vevet. Under hver vask og inkubasjons trinn, plassere seks-brønn plate på en shaker og la vevet å riste forsiktig. Merk: Tissue seksjoner inkubert i mindre volumer og i større plater (dvs. 12-og 24-brønn plater) har en tendens til å vise overflate og kant rive.</li>
		<li>Utfør antigen-gjenfinning av mikrobølgeovnen seksjoner i et glass beger som inneholder omtrent 30 mL 10 mM citrate buffer (pH 6,0). Sikre vev er ikke foldet ved å manipulere med en pensel og mikrobølgeovn seksjoner for 2-3 min eller til citrate buffer kommer begynner å koke. La delene avkjøles til romtemperatur (~ 20 min).</li>
		<li>Overfør seksjoner tilbake til en seks-brønn plate og vask seksjoner 3x for 5 min hver i 2 mL PBS/0.3% Triton X-100. Blokker endogene peroxidases ved incubating seksjoner i 2 mL 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS i 30 min ved romtemperatur (RT).</li>
		<li>Vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i 2 mL PBS/0.3% Triton X-100. Blokker seksjoner i 2 mL 3% normal geit serum/0,3% Triton X-100/1x PBS for 1 time ved RT.</li>
		<li>Ruge seksjoner over natten til 5 dager (avhengig av antistoff) i primære antistoffer rettet mot mikroglia og myelin epitopes å påvise betennelse (MHCII) og demyelinisering (PLP) (se tabell over materialer) ved 4 ° c. Merk: Sørg for at snittene ikke brettes når de incubating i dette trinnet eller etterfølgende trinn, da dette vil føre til at områder i seksjonene blir ugyldige.</li>
		<li>Vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i 2 mL 1x PBS. Deretter ruge seksjoner i sekundære biotinylated antistoffer (se tabell over materialer) for 1 h ved RT. Forbered Avidin-biotin Complex (ABC) løsning under inkubasjons omtrent 45 min før neste vask trinn for å tillate ABC komplekser å danne.</li>
		<li>Vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i 2 mL 1x PBS. Deretter ruge seksjoner i ABC for 1 time ved RT.</li>
		<li>Vask seksjoner i 2 mL 1x PBS tre ganger i 5 minutter hver. Ruge seksjoner i filtrert DAB (2 mL/brønn/seksjon) som inneholder H2O2 (1:500 fortynning av 30% h2o2 i DAB) til fargen utvikler seg tilstrekkelig (~ 3 – 8 min).</li>
		<li>Vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i 2 mL 1x PBS. For å forbedre signal (valgfritt), osmicate med 0,04% OsO4 (~ 30 s).</li>
		<li>Vask seksjoner tre ganger i 5 minutter hver i 1x PBS. Enkeltvis, overføre hver del fra seks-brønn plate til en liten container full av 1x PBS og plassere vevet delen på et glass Slide så flatt som mulig.</li>
		<li>Løft glidebryteren ut av PBS, samtidig som du sikrer at vevs delen er så flat som mulig. Bruk to pensler, forsiktig flat og strekke vevet ut på lysbildet og DAB bort overflødig vann med papir håndkle. Monter vev seksjoner med glyserol (eller en tilsvarende montering Media) og forsegle dekkglass med klar neglelakk.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. parafin-embedded hemispheric seksjoner: DAB farging
<ol><li>Smelt parafin av lysbildene i en 60 ° c ovn i 5 – 10 min.</li>
	<li>De-paraffinize seksjoner av incubating i xylen 3x for 5 min hver.</li>
	<li>Rehydrate vev i gradert etanol ved 100% (2x for 5 min hver), 95% (2x for 5 min), 70% (2x for 5 min hver), og 50% (1x for 5 min hver). Cover lysbilder i PBS.</li>
	<li>Antigen hente med mikrobølgeovnen lysbilder i et beger med 10 mM citrate buffer (pH 6,0).</li>
	<li>Vask lysbildene i 1x PBS (3x i 5 min hver) en gang avkjølt til romtemperatur. Block endogene peroxidases av incubating vev i 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS for 30 min.</li>
	<li>Vask vevet i 1x PBS tre ganger for 5 min hver. Block vev med 6% normal geit serum i PBS for 1 t.</li>
	<li>Ruge seksjoner i primære antistoff (se tabell over materialer) i PBS ved romtemperatur (RT) over natten (maks 20 h).</li>
	<li>Vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i 1x PBS. Deretter ruge seksjoner i tilsvarende sekundære antistoff (se tabell over materialer) i PBS for 1 time ved RT.</li>
	<li>Forbered ABC-løsning omtrent 45 min før neste vasketrinn under inkubasjons.</li>
	<li>Vask seksjonene 3x i 5 minutter hver i 1x PBS og deretter ruge i ABC for 1 time ved RT.</li>
	<li>Vask seksjon 3x i 5 minutter hver i 1x PBS.</li>
	<li>Ruge seksjoner i filtrert (0,45 μm filter pore size) DAB som inneholder H2O2 (1:500 fortynning av 30% h2o2 i DAB) til fargen utvikler seg tilstrekkelig (~ 3-8 min).</li>
	<li>Vask seksjoner (3x 5 min) i 1x PBS. For å forbedre signalet, osmicate med 0,04% Osmium tetroxide (OsO4; ca. 30 s).</li>
	<li>Vask seksjoner (3x min) i 1x PBS.</li>
	<li>Tørke vev i en gradert serie av etanol 50% (1x 5 minutter), 70% (1x 5 ' 5), 95% (2x min), 100% (2x fem min), og 100% xylen (1x femte). La xylenes fordampe.</li>
	<li>Monter seksjoner med toluen hurtig tørre monterings medier. Formuleringer som inneholder antioksidanter anbefales for å hindre flekker bleking. Fjern overflødig monterings medium fra lysbilde kantene med en barberhøvel for senere lagring.</li>
</ol>5. MRI/patologi sammenhenger
Merk: For samkjøre Mr med patologi, utfører vi først ex vivo Mr av den lenge faste intakt hjernen halvkule (trinn 2,9 ovenfor) i en justerbar boks med Mr-Visible markører som indikerer kutting slots. Vi deretter skjære hjernen og fotografere 1 cm skiver for å muliggjøre co-registrering av in situ MRIs til den enkelte hjerne skiver. Vi kan deretter utføre Mr-guidede analyser, der interesseområder (ROIs) identifiseres på MRI for direkte vevs analyse. Vi kan også utføre histopatologi analyser, der ROIs er identifisert på vev (for eksempel hvit materie lesjoner, hvit materie uten demyelinisering, etc.) og deretter preget av co-lokaliserte Mr tiltak (tabell 1).
<ol><li>
Identifisering av MRI-baserte ROIs Merk: i tidligere studier har vi identifisert ROIs i hvitt materiale11,12,13,14,15 og grå materie16,17, 18. eksempelet nedenfor er for hvit materie analyse.<ol>
<li>Segment T2 hyperintense lesjoner på in situ MRIs (fra trinn 1,1), først behandlet av en automatisk algoritme, og deretter korrigert manuelt av erfarne brukere.</li>
		<li>Segment T1 hypointense lesjoner i T2 lesjoner som voxels med et signal intensitet mindre enn eller lik 80% av signal intensiteten i omkringliggende normal-vises hjernevev.</li>
		<li>Segmenter hypointense områder i magnetization overførings forhold (MTR) med en terskel på 80%.</li>
		<li>Lag tre klassifikasjoner ved hjelp av ovennevnte Segmentations: (a) T2-bare lesjoner som er unormal på T2-vektet/FLAIR skanner men normalt på T1-vektet eller MTR skanninger, (b) T2T1MTR lesjoner, som er unormal på alle T2-vektet/FLAIR, T1-vektet, og MTR skanninger; og (c) normal vises hvit materie (NAWM), som er normalt på alle T2-vektet/FLAIR, T1-vektet, og MTR skanninger. Merk: Vårt utvalg av skiver er basert på eksistensen av alle tre regioner av interesse typer (T2-bare, T2T1MTR og NAWM) på de samme sektorene.</li>
		<li>Beregn normalisert intensitet for hver avkastning for å minimere variasjon som oppstår fra ulike hjerner og ulike hjernen steder.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Co-registrering av in situ Mr til hjerne skiver
	<ol>
<li>Skann den faste hjernen halvkule i en egendefinert kutting boks med fire rader av Mr-sensitive markører lokalisere sporene hvor en kniv kan settes inn for å skjære hjernen. Utfør en T1-vektet 3D MPRAGE oppkjøp med 1 mm isotropic oppløsning som dekker den faste hjernen og alle markører. Merk: Dette kalles etter fiksering MRI og brukes bare som et mellom trinn for co-registrering av in situ MRIs til hjerne skiver.</li>
		<li>Umiddelbart etter skanning, Slice hjernen halvkule i sporene ligger 1 cm fra hverandre, noe som resulterer i ca 15 skiver.</li>
		<li>Fotografere hjerne skiver på både fremre og bakre sider.</li>
		<li>Co-registrere in situ Mr og fotografier av hjerne skiver med følgende trinn.<ol>
<li>For segmentering av post-fiksering og in situ MPRAGE, pre-prosess både post-fiksering og in situ MPRAGE MRIs for intensitet ikke-ensartethet19.<ol>
<li>Segmentere hjernen og fire rader med markører fra preprocessed etter fiksering MPRAGE.</li>
				<li>Segmentere halvkule tilsvarende etter fiksering MRI20,21 fra pre-behandlet in situ MPRAGE.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Co-registrere hjernen-ekstrahert in situ og post-fiksering MRIs gjennom en rekke lineære registreringsprosesser opp til 12 grader-av-frihet (affine registrering) ved hjelp FSL FLØRTE22. Den skalering og klipping komponenter utgjør effekten av fiksering krymping.</li>
			<li>Finn skjære flyets normale retning ved å minimere summen av maksimalt projisert intensitet ved hjelp av segmentert markører. Disse re-orientering vinkler er innarbeidet i transformasjonen matrise Hentet fra forrige trinn.</li>
			<li>Visuelt matche MRI-bilder til fotografier av faste bakre hjerne skiver ved hjelp av en in-House Image Viewer som gjør det mulig for å endre dybden og orienteringen av normal vektorer. Små modifikasjoner er nødvendig fordi hjernen kutting er ufullkommen.</li>
			<li>Bruk AFFINE bilde transformasjon13 for hver skive for å transformere in situ MRIs til samme kutting steder som fotografier av hjerne skiver.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1-/T2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis.">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li><li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Vi beskriver en protokoll som har blitt brukt til å raskt anskaffe og behandle vev fra over 150 personer med MS. En viktig funksjon i denne protokollen er at forskerne som utnytter vevet er også ansvarlig for å etablere protokollen og utføre vev samlingen. Dette gir fleksibilitet til å møte de vitenskapelige behovene til individuelle forskningsprosjekter. Flere aspekter av denne protokollen forbedre sin nytte. Pasientene er vanligvis godt preget før døden, som mange av dem har blitt fulgt av nevrologer på vårt senter. Et kritisk skritt er behandlingen av vevet donasjoner snart etter døden, noe som øker kvaliteten på frosne vev i forhold til noen andre hjerne banker. Dette muliggjør molekylær studier som er av stor verdi i å beskrive endringer i transcriptional og translational gen produkter, som er avgjørende for sannsynliggjøring av histologiske og immunocytochemical observasjoner. Utnyttelse av morfologiske/immunocytochemical og molekylære data på tvers av flere tilfeller øker påliteligheten av konklusjoner. Dette illustreres best ved vår beskrivelse av mitokondrie gen forandringer i hjernebarken og neuronal gen forandringer i demyelinated hippocampi. Romanen genet profilering protokoller utvikles i en rask hastighet og frossen vev i vår bank bør gi høy kvalitet RNA for vev og enkelt celle analyse.
Et annet verdsatt aspekt av vår protokoll er kort-faste hjerne skiver. Disse vev er skåret i 30 μm-tykke, frittflytende seksjoner. Disse seksjonene er ideelle for bruk av konfokalmikroskopi mikroskopi for å analysere to eller flere antigener i tre dimensjoner. Gode eksempler inkluderer samspillet av pre-myelinating oligodendrocyte prosesser med dystrophic axons i kroniske MS lesjoner, samt identifisering av enkelt axonal tilkoblinger til transected axonal tilbaketrekking pærer. Dette er i motsetning til rutinemessig bruk av 7 μm-tykke parafinsnitt, der 3D-bilder ikke er gjennomførbart. Parafin-embedded vev har stor verdi for noen spørsmål, spesielt kvantifisering av neuronal tettheten i hemispheric 7 μm-tykke seksjoner. Våre vevs behandlingsprotokoller er derfor mangfoldige og gir fleksibilitet for å sikre fast og raskt frosset vev.
En annen unik funksjon i vår protokoll er den postmortem in situ hjernen MRI. Brain MRIs er en uerstattelig biomarkør av MS sykdom. Det er derfor viktig å etablere patologisk relaterer til unormale MRI-signaler. Våre studier etablerte at både T2 bare og T2T1MTR ROIs er ofte myelinated. Dette funnet støtter behovet for mer spesifikke Imaging modaliteter som pålitelig skille mellom myelinated og demyelinated cerebral hvit materie. Mr synes å være følsom for påvisning av myelin, men våre studier viser at selv en kombinasjon av T1/T2/MTR ikke er spesifikk for å identifisere myelination. Vår postmortem-protokoll gir en ideell plattform for testing av muligheten for nye bildebehandlings metoder for å skille mellom myelinated og demyelinated cerebral hvit materie. Mr gir også den ideelle bilen for oversettelse av grunnleggende vitenskap resultater i klinisk praksis, gitt bruk av MRI i vår translational forskning og utbredt klinisk bruk i levende pasienter.
Mens kutte kort-og lang-fast samt frosne skiver tilbyr en fordel for behandling av vev i flere moduser for ulike studier, er det noen begrensninger med denne metoden. Evaluering av helheten i en struktur kan begrenses fordi deler av den kan behandles annerledes på tilstøtende sektorer. Det store volumet av vevet banken, men tilbyr muligheten til å undersøke en struktur av interesse i flere for å bedre prøvetaking. En annen generell begrensning til studier utnytte postmortem vev er at de er cross-Seksjons. Konklusjoner om timing og progresjon av endringer må tolkes i denne sammenhengen. Det kan være et utvalg bias til pasienter som donerer sine vev, som kan begrense generalisering av data til alle pasienter med MS. Siden de fleste givere dør av komplikasjoner av avanserte MS, kan det ikke være hensiktsmessig å ekstrapolere funn fra disse pasientene til de i tidligere stadier av MS. Likevel har vi fått vev fra yngre pasienter som døde av ikke-MS-relaterte tilstander (dvs. akutt hjerteinfarkt, overdose, selvmord). Omfanget av vår protokoll omfatter ikke prøvetaking av andre organer (for eksempel Gastrointestinal og benmarg) som har vært innblandet i MS. Vi tror at styrkene til programmet i stor grad oppveier begrensningene.

En av de beste måtene å studere en sykdom er å undersøke den syke vevet selv. Dette presenterer utfordringer for de som studerer sykdommer i sentralnervesystemet (CNS). Biopsier av syke hjernen og ryggmargen er ekstremt sjeldne og vanligvis innebære atypiske tilfeller. Obduksjon priser for personer med CNS sykdommer har sunket dramatisk de siste årene, og når de er utført, de ofte ikke gir rask anskaffelse av vev. Disse utfordringene har resultert i etablering av sykdom-sentrert hjerne banker, inkludert flere fokusert på å samle vev fra personer med multippel sklerose (MS). MS er en inflammatorisk-mediert sykdom i CNS som ødelegger myelin, oligodendrocytes (myelin forming celler), neurons, og axons. Flertallet av MS pasienter har en bi-phasic sykdom kurs som starter med utbrudd av nevrologisk funksjonshemming med variabel utvinning som til slutt utvikler seg til en gradvis-progressiv sykdom som er sannsynlig nevrodegenerative i naturen1. For flertallet av donert MS hjerner, postmortem intervaller (PMI) mellom død og vev behandling overstige 24 h. Mens disse vev har gitt verdifull informasjon om patologiske forandringer i MS hjerner, de er ikke egnet for mer avanserte molekylære studier som kan gi kraftig innsikt i sykdoms patofysiologi. Dette er spesielt tilfellet for gen profilering studier, som krever intakt RNA.
For å overvinne begrensningene diskutert ovenfor, har vi utviklet en rask vev donasjon program som gjør det mulig for MRI/patologiske sammenhenger. Denne protokollen gir godt bevarte vev egnet for moderne molekylær studier og tillater direkte sammenligning av hjernen patologi og MRI unormalt i MS hjerner. The Cleveland Clinic multippel sklerose tissue donasjon program har eksistert i over 20 år. Denne raske vev donasjon programmet anskaffer hjerner og rygg snorer fra personer med MS og andre tilknyttede autoimmune nevrologiske tilstander. Programmet tar sikte på å oppnå in situ MRIs innen 6 h død, etterfulgt av fjerning av hjernen og ryggmargen for vevs behandling.
Rekruttering Donasjoner oppnås gjennom enten ante-obduksjon samtykke innhentet direkte fra pasienter (pre-samtykket) eller fra nærmeste pårørende etter døden. Pre-samtykket pasienter er vanligvis identifisert fra den kliniske befolkningen ved Mellen senter for multippel sklerose behandling og forskning i Cleveland, Ohio. Selv om preferanse for rekruttering i den raske vev donasjon programmet er gitt til pasienter som har blitt fulgt i langsgående Forskningsstudier, er det åpent for alle pasienter sett i sentrum. Deltakere som melder seg før døden er gitt instruksjoner for familiemedlemmer eller omsorg tilbydere å kontakte forskerteamet, enten på tidspunktet for dødsfallet eller når døden antas å være nært forestående. Den andre metoden for enkeltpersoner å gå inn i vev donasjon programmet er på tidspunktet for dødsfallet gjennom samtykke av nærmeste pårørende. Staten Ohio krever dødsfall å bli henvist til en føderalt-mandat organ anskaffelser organisasjon kalt LifeBanc, som opererer i 20 fylker i nordøstlige Ohio. LifeBanc skjermer alle dødsfall for en diagnose av MS, som er en utelukkelse for organ donasjon. Ordninger ble gjort for LifeBanc å varsle etterforskere fra MS tissue donasjon program for alle dødsfall med en tilknyttet diagnose av MS forekommer innenfor en 75 mil radius fra Cleveland Clinic. Neste av pårørende og sykehuspersonalet blir deretter kontaktet av tissue donasjon program staff og samtykke er innhentet for donasjon av hjernen og ryggmargen vev. Disse to metodene for rekruttering ante-obduksjon og etter obduksjon gjennom LifeBanc resultere i ca 10-12 hjernen donasjoner per år. Justeringer er gjort til øvre aldersgrense for død for å administrere antall henvisninger avledet fra LifeBanc.
Anskaffelse av donasjoner Programmet krever 24 h dekning, 365 dager i året av medlemmer av vevet donasjon program for vev anskaffelser. En sentralisert vev donasjon varsling e-post/personsøker/mobil enhet tekst varslingssystem brukes av det kliniske teamet dekker vev donasjoner. LifeBanc er gitt tall for å kontakte On-Call personell for vevs donasjon programmet. Medlemmer varsles om døden av sykehus leverandørene/nærmeste pårørende (forhåndssamtykke) eller av LifeBanc og andre henvisningskilder. Først en bestemmelse av tid for død og gjennomførbarhet til vev donasjon er gjort. Dødsfall blir deretter vist for forhold som potensielt føre til dårlig kvalitet vev, inkludert langvarig før obduksjon hypoksi, massive destruktive hjernevev (f. eks store intrakraniell blødning, omfattende bi-hemispheric slag, omfattende tumor langvarig Ventilator støtte (> 3 dager), og langvarig bruk av vasoactive midler (> 3 dager) før døden. Når en medisinsk sensor er involvert i en død, kan studien nevrolog snakke med medisinsk sensor for å utforske en måte å motta betimelig vev uten å svekke den medisinske sensor ansvar. Hvis levedyktig vev er følte å være til stede, så skriftlig samtykke er innhentet (hvis ikke innhentet pre-obduksjon) og preparater er laget for kroppen transport. En tidligere avtalt avdødes transportservice blir deretter kontaktet for transport til Mr-fasilitetene på Cleveland Clinic. Care er tatt for å sikre at kroppen forblir i romtemperatur og ikke er plassert i kulde, som lavere kropps temperaturer er forbundet med endringer i MRI-signal egenskaper.
Klinisk historikk Klinisk historie inneholder informasjon om diagnostisering av MS, utbruddet av symptomer, behandlinger som brukes, resultater av klinisk og para-klinisk testing (fremkalt potensialer, spinalvæske resultater, optisk sammenheng tomografi), multippel sklerose funksjonell kompositt , og utvidet funksjonshemming status skala (EDSS; faktiske eller estimerte), som er samlet inn fra den medisinske posten (der det er tilgjengelig), og direkte intervju med nærmeste pårørende. Pre-obduksjon Mr er også samlet inn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

Vi beskriver en rask vev donasjon program for personer med multippel sklerose (MS) som krever forskere og teknikere for å være på samtalen 24/7, 365 dager i året. Deltakere samtykke til å donere sine hjernen og ryggmargen. De fleste pasientene ble etterfulgt av nevrologer ved Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. Deres kliniske kurs og nevrologiske funksjonshemminger er godt preget. Kort tid etter døden, blir kroppen transportert til MS Imaging Center, der hjernen skannes in situ av 3 T magnetisk resonans imaging (MRI). Kroppen blir deretter overført til obduksjon rommet, der hjernen og ryggmargen er fjernet. Hjernen er delt inn i to halvkuler. En halvkule er umiddelbart plassert i en skjære boks og alternative 1 cm-tykke skiver er enten fast i 4% paraformaldehyde i to dager eller raskt frosset i tørr is og 2-methylbutane. De korte faste hjerne stykkene lagres i en kryonisk bevaring løsning og brukes til histologiske analyser og immunocytochemical deteksjon av følsomme antigener. Frosne skiver lagres ved-80 ° c og brukes for molekylær-, immunocytochemical-og in situ hybridisering/RNA omfangs studier. Den andre halvkule er plassert i 4% paraformaldehyde i flere måneder, plassert i kutting boksen, re-skannet i 3 T magnetisk resonans (MR) skanner og skiver i centimeter-tykke skiver. Postmortem in situ MR bilder (MRIs) er co-registrert med 1 cm tykke hjerne skiver for å lette Mr-patologi sammenhenger. Alle hjerne skiver er fotografert og hjernen hvit-saken lesjoner er identifisert. Ryggmargen er skåret i 2 cm segmenter. Alternative segmenter er festet i 4% paraformaldehyde eller raskt frosset. Den raske anskaffelser av postmortem MS vev tillater patologiske og molekylære analyser av MS hjerner og rygg snorer og patologiske sammenhenger av hjernen MRI unormalt. Kvaliteten på disse raskt bearbeidet postmortem vev (vanligvis innen 6 h død) er av stor verdi for MS forskning og har resultert i mange høy-effekt funn.

Som nevnt ovenfor, nesten halvparten av cerebral halvkule er frosset og tilgjengelig for molekylær studier ved hjelp av DNA, RNA, eller protein. Historisk har studier med postmortem hjernevev blitt vist å være påvirket av pre-obduksjon forhold, alder, kjønn, vev pH, mRNA integritet (RIN), postmortem intervall (PMI), diagnostisk sikkerhet, comorbidsubstance bruk, og tidligere medisinering behandling status23. Basert på studier som bruker hjernevev, synes DNA og protein å bli påvirket i mindre grad sammenlignet med RNA. Basert på vår erfaring, RNA isolasjon og nedstrøms analyse har imidlertid blitt funnet å være mest berørt av pre-obduksjon forhold og postmortem intervall av hjernevevet. Vi diskuterer derfor noen av betingelsene som skal følges for å gjennomføre RNA-basert analyse ved hjelp av postmortem MS vev.
For alle våre studier, etter at hjernen er samlet ved obduksjon, er det skiver (1 cm tykk) og deretter enten fast i 4% paraformaldehyde for morfologiske studier eller raskt frosset for biokjemiske analyse. Alle vev blokker er karakterisert for demyelinisering av immunostaining bruke PLP som beskrevet ovenfor. En representativ analyse ordning er vist i figur 1. Vevs deler undersøkes for tilstedeværelsen av hvite-materie lesjoner (figur 1a). Utvalgte regioner er beiset for immun aktivitet (figur 1B) og demyelinisering (figur 1C). Den frosne vevet er montert på kryostaten (figur 1d) og frosne 30 μm seksjoner er kuttet. Dette etterfølges av samling av 3-4 påfølgende seksjoner, separasjon fra tilstøtende vev, og lagring for DNA, RNA, eller protein isolasjon. Ved hjelp av denne protokollen, har vi lykkes isolert DNA24,25, RNA5,6,7,8,9 , så vel som proteiner26. Mens store funn fra noen av studiene analysere RNA fra MS hjernen er diskutert, her er noen av problemene knyttet til analyse av RNA postmortem MS hjerner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig1.jpg"> Figur 1: eksempel samling for mRNA-analyse. (A) obduksjon vev er valgt for analyse. Områder av vev er valgt og en del av vevet er excised. Alle seksjoner er farget med (B) MHC-II (Major histocompatibility Complex (MHC) klasse II HLA-Dr CR3/43) antistoff å oppdage inflammatorisk aktivitet og med (C) proteolipid protein (PLP) for å bestemme myelin status ved hjelp av publiserte protokoller. Basert på myelin status, er blokken scoret av en skalpell (D). Seksjoner (60 μm) er kuttet (E) og de områdene som tidligere har blitt scoret er fjernet, separert i rør, og merket (F). PLP og MHC-II flekker gjentas etter hver 5 seksjoner for å sikre riktig samling av vev. Normalt vises hvit materie (NAWM) er notert og hvit materie lesjoner (WML) er skissert i rødt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Axonal transection i lesjoner av MS10. En innledende vitenskapelig fokus for dette programmet var på karakterisering av cellulære komponenter av demyelinated av hvit materie lesjoner. Blant de antigener lokaliserte var ikke-fosforylert neurofilamenter (NFs). De fleste NFs er fosforylert i myelinated axons. Ved demyelinisering, axons er dephosphorylated. Vi oppdaget det forventede uttrykket av ikke-fosforylert NFs i demyelinated axons. I akutte MS lesjoner, mange av disse demyelinated axons endte som axonal tilbaketrekking pærer (figur 2a), som reflekterer proksimale endene av transected axons. Transected axons overskrider 11 000 mm3 i de akutte lesjoner sammenlignet med tilstøtende normale regioner10. Disse observasjonene hjalp katalysere et paradigmeskifte i MS forskning som flyttet feltet mot karakteriserer neurodegeneration som den viktigste årsaken til permanent nevrologisk uførhet hos personer med MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig2.jpg"> Figur 2: axonal transection under inflammatorisk demyelinisering. Axonal transection oppstår under inflammatorisk demyelinisering (a, pilspisser) og induserer dannelse av Terminal axonal Ovoids (a, piler). Når kvantifisert (B), transected axons er rikelig inne MULTIPLE SCLEROSIS leksjonen og komme å relatere med opphissende aktivitet av det leksjonen. Panel A gjengis fra trapp et al.10 med tillatelse. Rød: proteolipid protein, grønn: anti nonphosphorylated neurofilament. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Remyelination i kroniske MS hjerner3. Remyelination kan være robuste i tidlige stadier av MS. Mange kroniske MS lesjoner, men er ikke remyelinated. Vi undersøkte om tilstedeværelsen av oligodendrocyte stamceller (OPCs) eller generering av nye oligodendrocytes grenser remyelination av kronisk demyelinated hvit-materie lesjoner. Mens OPC-tettheten ofte ble redusert, var de til stede i alle kronisk-demyelinated lesjoner3. Nylig genererte oligodendrocytes var også til stede i mange kroniske MS lesjoner. Oligodendrocyte prosesser assosiert med, men ikke myelinate demyelinated axons (Figur 3). Disse studiene tyder på at OPCs og deres evne til å produsere nye oligodendrocytes ikke begrenser remyelination av kroniske hvite-materie lesjoner. Vi hypotetisk gjennomsnitt at de kronisk-demyelinated axons, som ofte dukket opp dystrophic, ikke var mottakelige for remyelination av nylig produserte oligodendrocytes.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig3.jpg"> Figur 3: prosesser for pre-myelinating oligodendrocytes forbundet med axons. Konfokalmikroskopi micrographs av MS lesjoner beiset med PLP antistoffer (rød i panel a, b) og neurofilament antistoffer (grønn i panel a, b) vises. En pre-myelinating oligodendrocyte (rød inne panel en) inne subventricular sone (SVZ) utbygget prosesser inn i område av demyelinated axons (grønn inne panel en) inne en kronisk MULTIPLE SCLEROSIS leksjonen. Mange av disse prosessene (pilene i panel A) spiraled rundt axons, som vist ved høyere forstørrelse (panel B). Vektstenger representerer 20 μm (A) og 5 μm (B). Gjengitt fra Chang et al.3 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Mitokondrie dysfunksjon i MS6. Vi utførte en objektiv søken etter neuronal gen endringer i hurtig frosne motor cortex innhentet fra kroniske MS-pasienter (figur 4a). Et objektiv søk på dette datasettet identifiserte betydelige reduksjoner i 23 kjernefysiske-kodede mitokondrie mRNAs i MS (figur 4b). Credentialing studier ved bruk av immuncytokjemi og in situ hybridisering indikerte at disse genene var svært beriket med kortikale projeksjons neurons (figur 4c) og at mitokondrier isolert fra projeksjon axons skjerm reduserte Glykolysen ( Figur 4d). Dette papiret katalysert fokus på mitokondrie dysfunksjon og redusert ATP produksjon som en stor bidragsyter til axonal degenerasjon i MS.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig4.jpg"> Figur 4: Microarray data og nedstrøms godkjenningen teknikker utført i MS motor cortex. (A) hierarkisk klynging av signifikant endrede transkripsjoner fra kontroll (C1-C6) og SPMS (MS1-MS6) motor cortex prøver, separat støtte sykdoms relaterte genuttrykk mønstre. Blant de reduserte transkripsjoner i MS motor cortex, tjue-seks tilhørte elektron transport kjeden (B). Mitokondrie kompleks i (NDUFA6) mRNA ble redusert i neurons (n = 55-130) i MS motor cortex (CII) sammenlignet med kontroll (CI), mens PLP mRNA tettheten var lik mellom kontroll (CIII) og MS (CIV) cerebral cortex. Aktivitet av elektron transport komplekser i og III ble redusert i mitokondrie-beriket fraksjoner fra motorisk cortex av MS pasienter (n = 3) (D). Gjengitt fra Dutta et al.6 med tillatelse. Feilfelt representerer SEM; Scale bar i CI-IV er 25 μm. * p < 0,05 studentenes t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Patogenesen av kognitiv dysfunksjon i MS8. 40 til 60% av MS pasienter har kognitiv nedgang og redusert utøvende funksjon. Vi identifiserte hippocampus, som er et funksjonelt sted for minne/læring, som et felles nettsted for demyelinisering i MS. Vi neste sammenlignet neuronal genuttrykk i myelinated og demyelinated hippocampi og fant betydelige reduksjoner i neuronal mRNAs koding proteiner involvert i hukommelse/læring. Vi utvidet disse dataene ved å demonstrere at Velg microRNAs er økt i demyelinated hippocampus og at disse microRNAs kan redusere uttrykk for glutamat reseptorer. Vi har gjengitt og utvidet disse observasjonene i gnager modeller. Vi neste sammenlignet neuronal genuttrykk i myelinated og demyelinated hippocampi og fant betydelige reduksjoner i neuronal mRNA koding proteiner involvert i hukommelse/læring.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig5.jpg"> Figur 5: tissue samling, histologiske analyse, og genuttrykk studier i MS hippocampus. Brain skiver som inneholder hippocampus er valgt under obduksjon (A) og hippocampus og tilstøtende regionen er fjernet (rød boks) for videre analyse. Immunostaining for PLP viste bevaring av myelin i alle kontroll (B) og 40% av MS hippocampi (C). Omfattende demyelinisering ble påvist i ~ 60% av MS hippocampi (D). Sammenlignet med kontroll hippocampi (E, G, I) ble SIGNIFIKANT neuronal tap ikke PÅVIST i CA1, CA3 eller CA4 regioner av demyelinated MS-hippocampi (F, H, J) som vist ved HuR immunhistokjemi. Dobbel merking immunofluorescence for myelin (myelin Basic protein (MBP), grønn) og axons (SMI32, rød) viste tap av myelin (L) med relativ bevaring av axons (N) i MS demyelinated hippocampus sammenlignet med kontroll hippocampus ( MBP, K; SMI32, M). Dual Clustering av mRNA uttrykk nivåer arrangert prøver i diskrete klynger basert på myelin status (myelinated og demyelinated) og plassering (hippocampus vs motor cortex) (O). Høye mRNA-nivåer indikeres av rødt og blått betyr lave uttrykks nivåer. Paneler C-O tilpasset fra Dutta et al.8 med tillatelse. B-D: 2 mm, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Patologiske relaterer av MRI-endringer12. Mens MRI er en verdsatt indikator på MS diagnose og respons på behandling, og er også en indikasjon på MS sykdomsprogresjon, den patologiske relaterer av Mr endringer er dårlig forstått. Våre postmortem MRI-studier har fokusert på to MRI-ROIs. Cerebral hvit materie ROIs som bare var T2 hyperintense (T2 bare) og ROIs som hadde en kombinasjon av T1 hypointensity, T2 hyperintensity, og redusert magnetization overføring forhold (MTR) (T2T1MTR). Omtrent 45% av cerebral hvit materie T2-bare ROIs var myelinated, bekrefter deres ikke-spesifikke natur. I kontrast 83% av T2T1MTR ROIs var kronisk demyelinated og dukket opp som sorte hull. T1 og MTR-verdier er semi-kvantitative og deres verdier varierte mye i T2T1MTR ROIs. Hvis tap av myelin er den eneste bidragsyteren til disse Mr endringene, så verdiene skal være konstant. Hovne demyelinated axons korrelert med både T1 og MTR verdier.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig6.jpg"> Figur 6: magnetization overførings forhold (MTR) og T1 kontrast prosenter lineært samsvarer med prosentandelen av na+/K+ ATPase-positive axons i kroniske MS-lesjoner. Kronisk-demyelinated lesjoner beiset for na+/K+ ATPase (grønn) varierte fra nesten 100% (A) til null (B) i neurofilament (rød). Mange axons uten na+/K+ ATPase hadde økt diameter (B). En sammenligning av prosenten av na+/K+ ATPase-positive axons i kronisk-demyelinated MS lesjoner KORRELERT med kvantitative postmortem MTR (p < 0,0001, C) og T1 kontrast prosenter (p < 0,0006, D). Hvert datapunkt er fra en enkelt lesjon og hver unike farge symbolkombinasjon betegner en av hjernen studert. Vektstenger = 5 μm. gjengitt fra Young et al.12 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Neurodegeneration uavhengig av demyelinisering11. Historisk, neurodegeneration inne MULTIPLE SCLEROSIS er blitt tanke å resultere fra demyelinisering. Brain Imaging studier har imidlertid reist muligheten for at neurodegeneration og demyelinisering kan være uavhengige hendelser. Vi har nylig identifisert en pasientpopulasjonen av MS pasienter som har demyelinisering av ryggmargen og hjernebarken, men ikke av cerebral hvit materie. Vi laget denne MS under type som myelocortical MS (MCMS). MCMS tilfeller gitt en plattform for å undersøke forholdet mellom cerebral hvit materie demyelinisering og kortikale neuronal tap. Sammenlignet med kontroll barken, kortikale neuronal tap var signifikant større i MCMS-barken enn i vanlige MS-barken. Kontroll hjernevevet ble innhentet fra patologi avdeling på Cleveland Clinic. Denne studien gir den første patologiske bevis for neurodegeneration i fravær av demyelinisering.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig7.jpg"> Figur 7: neuronal tap i fravær av cerebral hvit-materie demyelinisering. En cresyl Violet-beiset koronale hemispheric delen fra en individuell klassifisert som har typisk MS (A). Neuronal tetthet ble sammenliknet i kortikale lag III, V og VI i hvert av de fem merkede områdene. Neurons med et areal større enn 60 μm2 (gul) er vist i et representativt bilde fra overlegen Temporal cortex (B). Merking for PLP og fordelingen av demyelinated lesjoner (hvit materie demyelinisering er uthevet i blått; subpial demyelinisering er uthevet i rosa) i hemispheric seksjoner fra individer med typisk MS (C) og myelocortical MS (D ) vises. En betydelig sammenheng imellom nedsatte kortikale neuronal tettheten og forhøyet cerebral hvit-materie lesjon kvantum var grunnlegge inne typisk MULTIPLE SCLEROSIS, bortsett fra ikke inne myelocortical MULTIPLE SCLEROSIS (E); stiplede linjer indikerer 95% sikkerhetsintervall (CI). IFG = dårligere frontal gyrus. STG = overlegen Temporal gyrus. INi = dårligere Insula. INs = overlegen Insula. CG = cingulum gyrus. Gjengitt fra trapp et al.11 med tillatelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig7large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Varighet for sekvens</td>
			<td>Sekvens beskrivelse</td>
			<td>Bruk av sekvens</td>
		</tr>
<tr>
<td>0:09</td>
			<td>Localizer</td>
			<td>Lokalisering for etterfølgende sekvenser</td>
		</tr>
<tr>
<td>9:14</td>
			<td>3D magnetization forberedt rask gradient ekko (MPRAGE)</td>
			<td>Strukturelle Imaging volum estimering av hjernens strukturer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:14</td>
			<td>3D Fluid svekket inversjon utvinning (FLAIR)</td>
			<td>Identifikasjon av lesjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>2:35</td>
			<td>2D T2 vektet</td>
			<td>Identifikasjon av lesjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:12</td>
			<td>3D gradient-tilbakekalt ekko med magnetization overføring pre-puls, (MT-ON)</td>
			<td>Påstått mål av myelin innhold i normal vises og lesional vev</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:12</td>
			<td>3D gradient-tilbakekalt ekko uten magnetization overføring pre-puls, (MT-OFF)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0:27</td>
			<td>Diffusion tensor Imaging (DTI) felttilordning</td>
			<td rowspan="3">Mål på vann diffusjon i hjernevevet antas å reflektere hjernens vev integritet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10:27</td>
			<td>Diffusion tensor Imaging (DTI) multi-Shell</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:18</td>
			<td>Diffusion tensor Imaging (DTI) multi-Shell</td>
		</tr>
<tr>
<td>39:48:00</td>
			<td>DELSUM: KJERNE</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: postmortem bilde protokoll.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Multippel sklerose er en inflammatorisk demyeliniserende sykdom uten kur. Analyse av hjernevevet gir viktige ledetråder for å forstå patogenesen av sykdommen. Her diskuterer vi metodikk og nedstrøms analyse av MS hjernevev samlet gjennom en unik rask obduksjon program i drift på Cleveland Clinic.

Omfattende obduksjon program for personer med multippel sklerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Målet med vår forskning er å studere patogenesen av multippel sklerose. For å oppnå dette målet har vi etablert et raskt obduksjonsprogram for å oppnå og studere hjernen fra personer med MS. Det er to spesielle aspekter ved obduksjonsprogrammet vårt, det første er at det er raskt. Vi samler hjernen er under seks til åtte timers død.Dette gjør det mulig for toppmoderne molekylære studier. Det andre aspektet er at vi gjør en in situ MR før vi beveger hjernen. Dette gjør at vi kan korrelere patologiske endringer med hjerneavbildningsendringer.Visuell demonstrasjon gjør det mulig for seerne å forstå hvordan vi organiserer vår plass og tid for å oppnå optimale resultater. Vevsbehandling som skjer raskt og forsiktig tillater RNA-analyse, immunstaining, immunoblotting og MR-korrelasjoner. Nye forskere kan slite med behandling av vev med dårlig vevsintegritet.Unngå lange post mortem fiksering ganger er viktig og MR vev corde striations kan være utfordrende så konsultasjon med MR analyse eksperter kan være svært nyttig. Viser prosedyren vil være Emilie Christie og Christina Volsko. Teknikere fra laboratoriet vårt.Etter In situ magnetisk resonansavbildning, veie og fotografere hjernen og plassere en vedlagt dura i en beholder med 4% Paraformaldehyd eller PFA. Skill lillehjernen og hjernestammen fra cerebrum og fotografer cerebrumen. Bruk en sonde til å skille optiske nerver, chiasm og traktater og resect strukturen med en skalpell.Skill de cerebrale halvkulene langsgående og fotografer hver halvkule individuelt. Blekk den primære motorcortex eller PMC for venstre halvkule, rephotograph vevet og plassere vevet i en 3,3 liters beholder for lang fiksering. For å avgiftsdirektoratet PMC for høyre halvkule fjerne dekker meninges og rephotograph vevet.Neste resect PMC ved hjelp av en skalpell. Deretter fotografere den nye PMC ved siden av halvkule. Skjær PMC i seks like store seksjoner og blekk rostral aspektet av hver seksjon.Plasser deretter alle andre seksjoner i PFA-fylte beholdere for kort fiksering. Og klikk fryse de resterende seksjonene for lagring i forseglede fryseposer, i kjøligere nummer én. Skjær høyre halvkule fremre til bakre i en centimeter tykke koronale seksjoner.Fest alle andre seksjoner i PFA og klikk fryse de resterende seksjonene for lagring i forseglede fryserposer, i kjøligere nummer én. Skill hjernestammen fra lillehjernen og legg hjernestammen i en PFA fylt beholder for kort fiksering. Klipp hver lillehjernen halvkule i fire like faste sagittal seksjoner og fotografer medial og lateral utsikt.Plasser deretter de venstre lillehjernen hemisfæriske skiver i en beholder med PFA for kort fiksering. Og snap fryse høyre lillehjernen hemispheric skiver for lagring i forseglede fryser poser, i kjøligere nummer én. Etter å ha fått ryggmargen med nerverøttene, fjern ryggmargsdumaen og lagre duraen i PFA.Skill venstre og høyre fremre og bakre nerverøtter og kutt venstre fremre og bakre nerverøtter fra ryggmargen for kort fiksering i PFA. Klipp høyre fremre og bakre nerverøtter fra spinalakkordet og klikk fryse disse vevene for lagring i forseglede fryseposer, i kjøligere nummer to. Deretter fotografere caudal-de fleste 20 centimeter av ryggmargen og kutte to centimeter overføringsseksjoner fra caudal til rostral retning av ledningen for PFA kort fiksering og snap frysing.Deretter fotograferer du den gjenværende rostraldelen av ryggmargen. Og kutt to centimeter overføringsseksjoner fra caudal til rostral retning av ledningen for PFA kort fiksering og snap frysing. Klipp deler av interesse fra det korte eller lange faste vevet.Legg seksjonene i individuelle brønner av en seks brønnplate og vask vevet med tre fem minutters vasker i to milliliter frisk PBS per vask, med risting. For antigenhenting, mikrobølgeovn seksjonene i to til tre minutter i et glassbeger som inneholder omtrent 30 milliliter på 10 millimollar citrate buffer. Når seksjonene er avkjølt til romtemperatur, overfører prøvene til en ny seksbrønnplate i tre fem minutters vasker og to milliliter PBS, pluss 0,3% Triton X-100 per brønn, per vask.Etterfulgt av endogene peroksidaseblokkering i to milliliter med 3% hydrogenperoksid pluss 0,3% Triton X-100 i PBS i 30 minutter, ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask seksjonene tre ganger i to milliliter PBS pluss Triton X-100 per vask, som demonstrert. Etterfulgt av blokkering i to milliliter med 3% normal geit serum og PBS pluss Triton X-100 i en time ved romtemperatur.Deretter inkubere seksjonene fra over natten til fem dager i de primære antistoffene av interesse ved fire grader celsius etterfulgt av tre fem minutters vasker i to milliliter PBS per vask. Inkuber seksjonene i ivrig-biotin kompleks løsning eller ABC kompleks i en time, ved romtemperatur. Følg dette opp med tre fem minutters vasker i PBS.Merk seksjonene med to milliliter filtrert Diaminobenzidin supplert med hydrogenperoksid per brønn i tre til åtte minutter. Når fargen er tilstrekkelig utviklet, vask seksjonene tre ganger i PBS og overfør hver seksjon individuelt til en PBS-fylt beholder. Plasser hver seksjon flatt, under individuelle vevslyser.Og løft forsiktig hver skyve ut av PBS, holde seksjonene så flate som mulig. Bruk to pensler for å forsiktig flate ut og strekke ut hvert vev. Og bruk et papirhåndkle til å dab bort overflødig vann.Monter deretter seksjonene med et passende monteringsmedium og forsegle hvert dekselslipp med klar neglelakk. Vevsseksjoner undersøkes for tilstedeværelse av hvite materielesjoner, og de valgte regionene er farget for immunaktivitet og demyelinasjon. Ved akutte multippelsceloris lesjoner mange av disse demyelinerte aksoner fungerer som aksonale tilbaketrekking pærer som gjenspeiler de proksimale endene av transected aksoner.Tettheten av transponerte aksoner i akutte lesjoner overstiger 11000 per kubikkmillimeter i aktive lesjoner sammenlignet med bare 15 i tilstøtende ikke-leional hvite materieregioner. Nygenererte oligodendrocytter er også til stede i mange kroniske MS-lesjoner. Disse prosessene forbinder med, men ikke myelinate demyelinated aksoner.En representativ, objektiv søk etter nevronale genendringer i raskt frosne motorkorttekst hentet fra kroniske MS-pasienter, identifiserte signifikante reduksjoner i 23 kjernefysiske og kodede mitokondriebudRNA's Credentialing-studier ved hjelp av immunocytokjemi og in situ hybridisering indikerte at disse genene var svært beriket i kortikale projeksjonsnevroner og at mitokondrier isolert fra projeksjonaksoner viste redusert glykose. Sammenligning av neuronode genuttrykk i myelinated og demyelinated hippocampi avslører reduksjoner i neuronal messenger RNA inkludert proteiner involvert i hukommelse og læring. Videre, sammenlignet med kontroll kortikammer, kortikale neuronal tap er betydelig større i en sub populasjon av MS-pasienter som har demyelination av ryggmargen og cerebral cortext, men ikke av cerebral hvit materie.Under vevsbehandling, sørg for at når koronale seksjoner kuttes, kuttes de konsekvent med hensyn til tykkelse og orientering. Og at de ligger flatt når de flyter i et fikseringsmiddel eller når de er frosset. I tillegg til immunohistokjemisk analyse gir den frosne vevsamlingen oss muligheten til å gjennomføre genetisk og proteomisk analyse.Disse teknikkene har hjulpet til med identifisering av en ny kohort av MS-pasienter med cerebrale hvite materielesjoner på MR, men uten noen signifikant demyelinasjon av hvit materie. Betisk myelocortisk MS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

En omfattende protokoll for manuell segmentering av den mediale tinninglappen Structures

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunhistokjemi og Multiple merking med antistoffer fra samme vert Arter å studere Voksen hippocampus Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Måling Progressive Nevrologisk funksjonshemming i en musemodell for multippel sklerose

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalisert Psychophysiological interaksjon (PPT) analyse av minne knyttet tilkobling i individer genetisk utsatt for Alzheimers sykdom

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Funksjonell MRI i forbindelse med en Novel Mr-kompatibel hånd-indusert Robotic enhet for å evaluere rehabilitering av individer utvinne fra håndgrep underskudd

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation av flere fleksible polymer elektrode rekker

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Datamaskin-basert Multitaper Spektrogram program for Elektroencefalografiske data

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...