Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
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Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Christopher Nelson pela assistência editorial. O programa de autópsia é apoiado em parte por R35 conceder NS097303 a BDT. O trabalho no laboratório de RD é apoiado por subvenções da NINDS (NS096148) e da sociedade nacional de esclerose múltipla, EUA (RG 5298).

Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Cleveland Clinic e segue as diretrizes do Comitê de ética em pesquisa humana da Cleveland Clinic.
1. MRI in situ
<ol><li>Leve o corpo do doador para a suíte de ressonância magnética e realize um protocolo de ressonância magnética de 2 h no MS Imaging Facility. Conduza MRI em um Imager de 3 T ou de 7 T. Nota: Prioridade é dada a 3T como a maioria dos dados legados foi realizada em 3 T, mas quando não disponível, a imagem é conduzida com 7T. As sequências centrais designadas são executadas para todos os casos (tabela 1) e sequências adicionais que dependem dos interesses atuais da pesquisa são executadas se o tempo permitir (restringido conseguindo a fixação do tecido menos de 12 h após a morte). A tabela 1 descreve as sequências principais.</li>
</ol>2. autópsia
Nota: Após a RM in situ, o corpo é transportado para o necrotério para extração do cérebro e da medula espinhal por um Diener e processamento de tecido por membros do laboratório.
<ol><li>Realize as seguintes etapas antes da chegada do corpo no necrotério. Duas horas antes, prepare 3 L de paraformaldeído a 4% (PFA) e recipientes de etiquetas e sacos para armazenamento de tecidos. Preparar 3 L de 8% de PFA e diluir 1,5 L de 8% de PFA a 4% de PFA. Coloque o restante 8% PFA em 4 ° c para o dia 2.</li>
	<li>Antes de viajar para o necrotério, encha 2 refrigeradores de viagem para 50% de capacidade com gelo seco (grandes blocos quebrados para caber e pequenas Pelotas).</li>
	<li>No necrotério, encha um recipiente de aço inoxidável a meio caminho com 2-metilbutano e gelo seco e cubra com uma tampa em preparação para encaixar o congelamento do tecido.</li>
	<li>Pesar e fotografar o cérebro, uma vez removido pelo Diener.</li>
	<li>Coloc toda a dura unida em um recipiente enchido com o PFA.</li>
	<li>Separe o cerebelo e o tronco cerebral do cérebro e fotografe o encéfalo.</li>
	<li>Identifique os nervos óticos, o quiasma, e os intervalos e separe-os usando uma ponta de prova e uma pinça. Resect a estrutura com um bisturi. Nota: O segmento distal de um lado do nervo óptico é marcado usando a tinta de Higgins para identificação.</li>
	<li>Separe os hemisférios cerebrais longitudinalmente e fotografe cada hemisfério individualmente.</li>
	<li>Tinta do córtex motor primário (PMC) para o hemisfério esquerdo, re-fotografá-lo, e colocá-lo em um recipiente de 3,3 L para Long-fixação. Documente a hora de início para a fixação cerebral.</li>
	<li>O PMC para o hemisfério direito pode ser Inked ou extirpado.
	<ol>
<li>Se estiver sendo extirpado, Remova primeiramente as meninges da coberta.</li>
		<li>Re-fotografe ou extirpada PMC.</li>
		<li>Se PMC é extirpado, corte em 6 seções ingualmente-feitas medida.</li>
		<li>Tinta o aspecto rostral de cada seção.</li>
		<li>Coloque seções ímpares em contêineres cheios de PFA para fixação curta.</li>
		<li>Encaixe-congele seções mesmo-numeradas e coloc em sacos fechados do congelador no refrigerador #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Corte o hemisfério direito anterior ao posterior em seções coronais de 1 cm de espessura.
	<ol>
<li>Documentar anormalidades brutas (por exemplo, artefato de corte, hemorragia e lesões).</li>
		<li>Coloque seções ímpares em contêineres preenchidos com PFA para fixação curta.</li>
		<li>Encaixe-congele seções mesmo-numeradas e coloc em sacos fechados do congelador.</li>
		<li>Fim do documento do tempo de fixação cerebral.</li>
	</ol></li>
	<li>Separe o tronco cerebral do cerebelo e coloque-o em um recipiente cheio de PFA para a curto-fixação.
	<ol>
<li>Separe os hemisférios Cerebelares longitudinalmente.</li>
		<li>Corte cada hemisfério em 4 seções sagital ingualmente grossas.</li>
		<li>Fotografia de vistas medial e lateral.</li>
		<li>Coloque as fatias hemisféricas Cerebelares esquerdas em um recipiente enchido com o PFA para a curto-fixação.</li>
		<li>Encaixe-congele fatias hemisféricas Cerebelares direitas e coloc em sacos selados do congelador no refrigerador #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Obter a medula espinhal com raízes nervosas do Diener.
	<ol>
<li>Remover dura-máter da medula espinhal e armazenar dura em um recipiente com PFA.</li>
		<li>Separe as raízes do nervo anterior e posterior esquerda e direita. Corte as raizes de nervo anteriores e posteriores esquerdas cortadas da medula espinal e coloc em um recipiente enchido PFA para a curto-fixação.</li>
		<li>Corte as raízes do nervo anterior e posterior direita da medula espinhal, snap-Freeze, coloque em sacos de freezer selado, e depois coloque no refrigerador #2.</li>
		<li>Fotografe o caudal-mais de 20 cm da medula espinhal. Documentar a localização do alargamento lombar.</li>
		<li>Corte secções transversais de 2 cm do cabo procedendo de caudal a rostral.</li>
		<li>Tinta o aspecto rostral de cada seção de corte.</li>
		<li>Coloque seções ímpares em contêineres preenchidos com PFA para fixação curta.</li>
		<li>Encaixe-congele seções mesmo-numeradas, lugar em sacos fechados do congelador, e coloc então no refrigerador #2.</li>
		<li>Documentar a hora de início para a fixação da medula espinhal e quaisquer anomalias brutas.</li>
		<li>Fotografe a porção rostral remanescente da medula espinhal.</li>
		<li>Documentar a posição do alargamento cervical. Siga os passos 2.13.5 – 2.13.8 para a medula espinhal remanescente.</li>
	</ol></li>
	<li>Depois do lugar necrotério tecido congelado em caixas rotuladas em-80 freezers ° c. Armazene o tecido fixo a 4 ° c.</li>
	<li>Em 24 h após a autópsia (dia 2) diluir o restante 8% PFA para 4%.</li>
	<li>Substitua 4% de PFA em recipientes de fixação com 4% de PFA recém-diluídos.</li>
	<li>Em 60 h pós-autópsia preparar soluções de 2,5% de glutaraldeído em 4% PFA de glutaraldeído, PFA, dH2o e Sorenson tampão (preparado pela mistura em seqüência: 0,2 M tampão fosfato pH 7,4, polyvinylpyrolidone 1% w/v, sacarose 30% w/v, e etileno glicol 30% v/v).</li>
	<li>Remover usado 4% PFA de recipientes de fixação curta.</li>
	<li>Enxague o tecido no tampão de Sorenson e coloque-o na solução de crioproteção (glicerol 20%, 0,4 M de Sorenson tampão 20%, e 0, 2% azida sódica em dH2O).</li>
	<li>Fotografar fatias cerebrais de curto-fixo, cerebelo, tronco encefálico e córtex motor (se aplicável).</li>
	<li>Com uma lâmina de bisturi cortada cortes transversais grossos de 2 milímetros de cada seção Short-fixada da medula espinal de 2 cm.</li>
	<li>Coloque secções em frascos de 2 mL de cintilação e encha com solução de 2,5% de glutaraldeído em 4% de PFA.</li>
	<li>Retorne a seção restante para o frasco de cintilação original de 20 mL. Enxague a seção com o tampão de Sorenson e substitua com a solução crioproteção.</li>
</ol>3. patologia
Nota: As fatias Short-fixas do hemisfério direito assim como o hemisfério esquerdo longo-fixado (coloc em 4% PFA por diversos meses) são cortadas em seções de 30 μm (referidas como livre-flutuando) ou encaixadas na parafina e cortadas como seções de 12 – 14 μm (referidas como embebido em parafina). Estas seções são processadas geralmente com proteína proteolipid (PLP) para detectar lesões Demyelinating e o complexo principal II do histocompatibilidade (MHC-II) para a atividade imune usando o método do diaminobenzidina (DAB). Esses protocolos foram padronizados e utilizados em diversas publicações2,3,4,5,6,7, 8,9 , 10 de , 11 anos de , doze anos.
<ol><li>
Livre-flutuante (30 μm) DAB-avidina-biotina complexo (ABC) mancha de tecido
	<ol>
<li>Remova seções da solução câmera, transfira seções a uma placa de seis poços, e lave-os 3x por 5 minutos cada um em 2 ml do pH fisiológico tamponado do fosfato 1x 7,0 (PBS). Ao transferir para o próximo poço na placa de seis poços, use o cuidado para não rasgar o tecido. Durante cada etapa da lavagem e da incubação, coloc a placa de seis poços em um abanador e permita que o tecido agite delicadamente. Nota: As seções do tecido incubadas em volumes menores e em placas maiores (isto é, placas de 12 e 24 poços) tendem a expor a superfície e a borda que rasgam.</li>
		<li>Realize a recuperação do antígeno por seções de microondulação em uma taça de vidro contendo aproximadamente 30 mL de tampão do citrato de 10 mM (pH 6,0). Assegure-se de que os tecidos não sejam dobrados manipulando com um pincel e seções de microondas por 2 – 3 min ou até que o tampão citrato comece a ferver. Permitir que as secções esfriem até à temperatura ambiente (~ 20 min).</li>
		<li>Transfira as secções de volta para uma placa de seis poços e lave as secções 3x durante 5 min cada em 2 mL de PBS/0,3% Triton X-100. Bloqueie peroxidases endógenas por secções incubantes em 2 mL de 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS durante 30 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada em 2 mL de PBS/0,3% Triton X-100. Secções de blocos em 2 mL de 3% de soro de cabra normal/0,3% de Triton X-100/1X PBS por 1 h em RT.</li>
		<li>Incubar seções durante a noite a 5 dias (dependendo do anticorpo) em anticorpos preliminares dirigidos de encontro aos resumos do microglia e do mielina para detectar a inflamação (mhcii) e o demyelination (PLP) (veja a tabela dos materiais) em 4 ° c. Nota: Assegure-se de que as seções não sejam dobradas ao incuar nesta etapa ou em etapas subseqüentes porque esta conduzirá às áreas dentro das seções que estão sendo nulas da mancha.</li>
		<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada uma em 2 mL de 1X PBS. Em seguida, incubar seções em anticorpos biotinilados secundários (ver a tabela de materiais) para 1 h em RT. Prepare a solução do complexo de avidin-biotina (ABC) durante a incubação aproximadamente 45 minutos antes da etapa seguinte da lavagem para permitir que os complexos do ABC formem.</li>
		<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada uma em 2 mL de 1X PBS. Em seguida, incubar seções no ABC por 1 h em RT.</li>
		<li>Lave as secções em 2 mL de 1X PBS três vezes durante 5 min cada. Incubar secções em DAB filtrado (2 mL/poço/Secção) contendo H2o2 (1:500 diluição de 30% h2o2 em DAB) até que a cor se desenvolva adequadamente (~ 3 – 8 min).</li>
		<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada uma em 2 mL de 1X PBS. Para aumentar o sinal (opcional), osmicate usando 0, 4% OsO4 (~ 30 s).</li>
		<li>Lave as secções três vezes durante 5 min cada em 1X PBS. Individualmente, transfira cada seção da placa de seis poços a um recipiente pequeno completamente de 1X PBS e posicione a seção do tecido em uma corrediça de vidro tão horizontalmente como possível.</li>
		<li>Levante delicadamente a corrediça fora do PBS ao assegurar-se de que a seção do tecido seja tão lisa como possível. Usando duas escovas de pintura, aplainam delicadamente e esticam o tecido para fora na corrediça e DAB afastado o excesso de água com toalha de papel. Monte as seções do tecido com glicerol (ou um meio de montagem equivalente) e sele o lamela com lustrador de prego desobstruído.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. seções hemisféricas parafina-encaixadas: mancha do DAB
<ol><li>Derreter a parafina nas lâminas num forno a 60 ° c durante 5 – 10 min.</li>
	<li>Seções de-paraffinize incubando em xileno 3x por 5 min cada.</li>
	<li>Rehidrate o tecido em etanol graduado em 100% (2x por 5 min cada), 95% (2x por 5 min), 70% (2x por 5 min cada), e 50% (1x por 5 min cada). Lâminas de cobertura em PBS.</li>
	<li>O antígeno recupera por corrediças de microondulação em uma taça do tampão do citrato de 10 milímetros (pH 6,0).</li>
	<li>Lave as lâminas em 1X PBS (3x por 5 min cada) uma vez arrefecido à temperatura ambiente. Bloquear peroxidases endógenas pelo tecido incubador em 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS por 30 min.</li>
	<li>Lave o tecido em 1X PBS três vezes por 5 min cada. Tecido de bloco com 6% de soro de cabra normal em PBS por 1 h.</li>
	<li>Incubar seções no anticorpo preliminar (veja a tabela dos materiais) em PBS na temperatura ambiente (RT) durante a noite (máximo 20 h).</li>
	<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada em 1X PBS. Em seguida, incubar seções no anticorpo secundário correspondente (ver a tabela de materiais) em PBS para 1 h em RT.</li>
	<li>Prepare a solução ABC aproximadamente 45 min antes da próxima etapa de lavagem durante a incubação.</li>
	<li>Lave as secções 3x durante 5 min cada em 1X PBS e, em seguida, incubar no ABC durante 1 h em RT.</li>
	<li>Lave a secção 3x durante 5 min cada em 1X PBS.</li>
	<li>Incubar secções filtradas (tamanho de poros do filtro de 0,45 μm) DAB contendo H2o2 (1:500 diluição de 30% h2o2 em DAB) até que a cor se desenvolva adequadamente (~ 3-8 min).</li>
	<li>Secções de lavagem (3x 5 min) em 1X PBS. Para aumentar o sinal, osmicate usando 0, 4% de tetróxido de ósmio (OsO4; aproximadamente 30 s).</li>
	<li>Secções de lavagem (3x 5min) em 1X PBS.</li>
	<li>Deshidratar o tecido em uma série graduada de etanol 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min), e 100% xileno (1x 5min). Permitir que os xilenos evaporem.</li>
	<li>Monte seções com mídia de montagem seca rápida à base de tolueno. Formulações que contenham anti-oxidantes são recomendadas para evitar o branqueamento de manchas. Remova o excesso de suportes de montagem das bordas do slide com uma navalha para armazenamento subsequente.</li>
</ol>5. correlações de RM/patologia
Nota: Para correlacionar MRI com patologia, nós executamos primeiramente o ex vivo MRI do hemisfério intacto longo-fixado do cérebro (etapa 2,9 acima) em uma caixa ajustável com os marcadores MRI-visíveis que indicam entalhes de fatiamento. Nós, então, cortar o cérebro e fotografar as fatias de 1 cm para permitir o coregisto de MRIs in situ para as fatias cerebrais individuais. Nós podemos então executar análises MRI-guiadas, onde as regiões do interesse (ROIs) são identificadas em MRI para dirigir a análise do tecido. Também podemos realizar análises guiadas por histopatologia, onde os ROIs são identificados no tecido (por exemplo, lesões de matéria branca, matéria branca sem desmielinização, etc.) e, em seguida, caracterizados pelas medidas colocalizadas de RM (tabela 1).
<ol><li>
Identificação de ROIs baseados em RM Nota: em estudos prévios, identificamos Rois na matéria branca11,12,13,14,15 e matéria cinzenta16,17, 18. o exemplo abaixo é para análise de matéria branca.<ol>
<li>Segmento T2 lesões hiperintensas em MRIs in situ (a partir do passo 1,1), inicialmente processado por um algoritmo automático, e, em seguida, corrigido manualmente por usuários experientes.</li>
		<li>Segmento T1 lesões hipointensas dentro de lesões T2 como voxels com uma intensidade de sinal menor ou igual a 80% da intensidade do sinal do tecido cerebral de aparência normal circundante.</li>
		<li>Segmentar áreas hipointensas em mapas de taxa de transferência de magnetização (MTR) com um limiar de 80%.</li>
		<li>Crie três classificações usando as segmentações acima: (a) as lesões T2-only que são anormais em varreduras de T2-weighted/FLAIR mas normais em T1-weighted ou em varreduras de MTR, (b) lesões T2T1MTR, que são anormais em todas as varreduras de T2-weighted/FLAIR, de T1, e de MTR; e (c) normal-aparecendo a matéria branca (NAWM), que são normais em todas as varreduras de T2-weighted/FLAIR, de T1-weighted, e de MTR. Nota: Nossa seleção de fatias é baseada na existência de todos os três tipos de regiões de interesse (T2-only, T2T1MTR e NAWM) nas mesmas fatias.</li>
		<li>Calcule intensidades normalizadas para cada ROI para minimizar a variabilidade decorrente de diferentes cérebros e localizações cerebrais diferentes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Co-registro de RM in situ em fatias cerebrais
	<ol>
<li>Escaneie o hemisfério cerebral fixo em uma caixa de corte personalizada com quatro linhas de marcadores sensíveis à ressonância magnética localizando os slots onde uma faca pode ser inserida para cortar o cérebro. Realize uma aquisição de MPRAGE 3D ponderada em T1 com resolução isotrópica de 1 mm cobrindo o cérebro fixo e todos os marcadores. Nota: Isto é chamado MRI da borne-fixação e é usado somente como uma etapa intermediária para o coregisto dos MRIs in situ às fatias do cérebro.</li>
		<li>Imediatamente após a digitalização, corte o hemisfério cerebral em slots localizados a 1 cm de distância, resultando em aproximadamente 15 fatias.</li>
		<li>Fotografe as fatias cerebrais em ambos os lados anterior e posterior.</li>
		<li>Registre a RM in situ e as fotografias de fatias cerebrais com as etapas a seguir.<ol>
<li>Para a segmentação de pós-fixação e MPRAGE in situ, pré-processo tanto pós-fixação quanto MPRAGE in situ para não uniformidade de intensidade19.<ol>
<li>Segmentar o cérebro e quatro fileiras de marcadores do pré-processado pós-fixação MPRAGE.</li>
				<li>Segmentar o hemisfério correspondente à RM20,21 pós-fixação do mprage in situ pré-processado.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Coregistre os MRIs in situ e pós-fixação extraídos do cérebro por meio de uma série de processos de registro linear até 12 graus de liberdade (registro afim) usando o FSL FLIRT22. Os componentes de dimensionamento e corte respondem pelo efeito do encolhimento da fixação.</li>
			<li>Encontre a direção normal do plano de corte minimizando a soma das intensidades máximas projetadas usando os marcadores segmentados. Esses ângulos de reorientação são incorporados na matriz de transformação obtida a partir da etapa anterior.</li>
			<li>Combine visualmente imagens de RM com fotografias de fatias de cérebro posteriores fixas usando um visualizador de imagens em casa que permite alterar a profundidade e a orientação dos vetores normais. Pequenas modificações são necessárias porque o corte cerebral é imperfeito.</li>
			<li>Aplique a transformação de imagem AFFINE13 para cada fatia para transformar os MRIs in situ nos mesmos locais de fatiamento que as fotografias das fatias cerebrais.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Nós descrevemos um protocolo que seja usado para rapidamente adquirir e processar o tecido de sobre 150 indivíduos com MS. Uma característica importante deste protocolo é que os cientistas que utilizam o tecido também estão encarregados de estabelecer o protocolo e realizar a coleta de tecido. Isso proporciona flexibilidade para atender às necessidades científicas de projetos de pesquisa individuais. Vários aspectos deste protocolo aumentam sua utilidade. Os pacientes geralmente são bem caracterizados antes da morte, pois muitos deles foram seguidos por neurologistas em nosso centro. Um passo crítico é o processamento de doações de tecidos logo após a morte, o que aumenta a qualidade do tecido congelado em comparação com alguns outros bancos cerebrais. Isto permite que os estudos moleculars que são do grande valor em descrever mudanças em produtos transcricional e translacional do gene, que são essenciais para o fundamentação de observações histológicas e Immunocytochemical. O aproveitamento de dados morfológicos/imunociquímicos e moleculares em vários casos aumenta a confiabilidade das conclusões. Isto é ilustrado melhor por nossa descrição de mudanças mitochondrial do gene no córtice cerebral e em mudanças neuronal do gene em hippocampi demyelinated. Os protocolos novos do perfilamento do gene estão sendo desenvolvidos em uma taxa rápida e o tecido congelado em nosso banco deve fornecer o RNA de alta qualidade para a análise do tecido e da único-pilha.
Outro aspecto valorizado do nosso protocolo é o curto-corrigido fatias cerebrais. Estes tecidos são cortados em 30 μm-grossos, seções Free-Floating. Estas seções são ideais para usar a microscopia confocal para analisar dois ou mais antígenos em três dimensões. Os bons exemplos incluem a interação de processos pre-myelinating do oligodendrocyte com axônios distróficos em lesões crônicas do MS, assim como a identificação de únicas conexões axonal aos bulbos de retração axonal transected. Isso está em contraste com o uso rotineiro de seções de parafina de 7 μm de espessura, onde as imagens 3D não são viáveis. Os tecidos embebidos em parafina têm grande valor para algumas questões, especialmente a quantificação de densidades neuronais em seções hemisféricas de 7 μm de espessura. Nossos protocolos de processamento de tecidos, portanto, são diversificados e proporcionam flexibilidade para assegurar tecidos fixos e rapidamente congelados.
Uma outra característica original de nosso protocolo é o cérebro in situ pós-morte MRI. Os MRIs cerebrais são um biomarcador insubstituível da doença de MS. É essencial, conseqüentemente, estabelecer os correlacionados patológicos de sinais anormais de MRI. Nossos estudos estabeleceram que ambos os T2 somente e T2T1MTR ROIs são frequentemente myelinated. Este achado suporta a necessidade de modalidades de imagem mais específicas que diferenciam confiantemente entre a matéria branca cerebral mielinated e demyelinated. MRI parece ser sensível para a deteção do myelin, mas nossos estudos demonstram que mesmo uma combinação de T1/T2/MTR não é específica para identificar o myelination. Nosso protocolo pós-morte fornece uma plataforma ideal para testar a habilidade de novas modalidades de imagem para distinguir entre a matéria branca cerebral mielinated e demyelinated. MRI igualmente fornece o veículo ideal para a tradução de resultados básicos da ciência na prática clínica, dado o uso de MRI em nossa pesquisa translacional e em seu uso clínico generalizado em pacientes vivos.
Enquanto o corte de curto e longo-fixo, bem como fatias congeladas oferece uma vantagem para o processamento de tecido em vários modos para diferentes estudos, existem algumas limitações com este método. Avaliar a totalidade de uma estrutura pode ser limitada, pois partes dele podem ser processadas de forma diferente em fatias adjacentes. O grande volume do banco de tecidos, no entanto, oferece a capacidade de investigar uma estrutura de interesse em vários assuntos para melhorar a amostragem. Outra limitação geral aos estudos que utilizam tecidos pós-morte é que são transversais. As conclusões relativas ao calendário e à progressão das alterações devem ser interpretadas dentro deste contexto. Pode haver um viés de seleção para pacientes que doam seus tecidos, o que pode limitar a generalização dos dados a todos os pacientes com SM. Desde que a maioria de doadores morrem das complicações de MS avançado, não pode ser apropriado extrapolar resultados destes pacientes àqueles em estágios mais adiantados de MS. No entanto, recebemos tecidos de pacientes mais jovens que morreram de condições não relacionadas ao MS (ou seja, infarto agudo do miocárdio, overdose de drogas, suicídio). O escopo do nosso protocolo não inclui amostragem de outros órgãos (por exemplo, gastrointestinais e medula óssea) que foram implicados na SM. Acreditamos que os pontos fortes do programa superam muito suas limitações.

Uma das melhores maneiras de estudar uma doença é examinar o próprio tecido doente. Isso apresenta desafios àqueles que estudam doenças do sistema nervoso central (SNC). As biópsias do cérebro doente e da medula espinal são extremamente raras e envolvem geralmente casos atípicos. As taxas da autópsia para indivíduos com doenças do CNS diminuíram dramàtica nos últimos anos, e quando executadas, frequentemente não fornecem a aquisição rápida dos tecidos. Esses desafios resultaram no estabelecimento de bancos cerebrais centrados na doença, incluindo vários focados na coleta de tecidos de indivíduos com esclerose múltipla (SM). MS é uma doença mediada por inflamação do SNC que destrói mielina, oligodendrócitos (células de formação de mielina), neurônios e axônios. A maioria dos pacientes com SM tem um curso de doença bi-fásica que começa com crises de incapacidade neurológica com recuperação variável que eventualmente evolui para uma doença gradualmente progressiva que é provavelmente neurodegenerativa na natureza1. Para a maioria dos cérebros doados do MS, os intervalos pós-morte (PMI) entre o processamento do óbito e do tecido excedem 24 h. Quando estes tecidos forneceram a informação valiosa a respeito das mudanças patológicas nos cérebros do MS, não são seridos para uns estudos moleculars mais avançados que possam fornecer introspecções poderosas na patofisiologia da doença. Isto é particularmente o caso para estudos de perfilamento do gene, que exigem o RNA intacto.
Para superar as limitações discutidas acima, nós desenvolvemos um programa rápido da doação do tecido que permita MRI/correlações patológicas. Este protocolo fornece os tecidos bem preservados apropriados para estudos moleculars modernos e permite a comparação direta da patologia do cérebro e das anomalias de MRI em cérebros do MS. O programa de doação de tecido de esclerose múltipla de Cleveland Clinic existe há mais de 20 anos. Este programa rápido da doação do tecido adquire cérebros e os cabos espinais dos indivíduos com MS e outras circunstâncias neurológicas auto-imunes associadas. O programa tem como objetivo obter MRIs in situ dentro de 6 h de óbito, seguidos pela remoção do cérebro e da medula espinhal para processamento tecidual.
Recrutamento As doações são obtidas por meio de um consentimento ante mortem obtido diretamente de pacientes (pré-consentiu) ou de parentes próximos após a morte. Os pacientes pré-consentiram são identificados tipicamente da população clínica no centro de Mellen para o tratamento e a pesquisa da esclerose múltipla em Cleveland, Ohio. Embora a preferência no recrutamento no programa rápido da doação do tecido seja dada aos pacientes que foram seguidos em estudos longitudinais da pesquisa, está aberto a todos os pacientes vistos no centro. Os participantes que se inscreverem antes da morte recebem instruções para que os membros da família ou prestadores de cuidados contactem a equipa de investigação, seja no momento da morte ou quando se pensa que a morte é iminente. O segundo método para que os indivíduos entrem no programa de doação de tecidos é no momento da morte através do consentimento de parentes próximos. O estado de Ohio exige que as mortes sejam encaminhada a uma organização de contratação de órgãos federalmente mandatada denominada LifeBanc, que opera em 20 municípios do nordeste de Ohio. LifeBanc telas todas as mortes para um diagnóstico do MS, que seja uma exclusão para a doação do órgão. Os arranjos foram feitos para que o LifeBanc notifique investigadores do programa da doação do tecido do MS para todas as mortes com um diagnóstico associado do MS que ocorre dentro de um raio 75-Mile da clínica de Cleveland. Próximo de parentes e funcionários do hospital são então contatados pela equipe do programa de doação de tecidos e consentimento é obtido para doação de tecidos cerebrais e da medula espinhal. Estes dois métodos de recrutamento ante-mortem e post-mortem através de LifeBanc resultam em aproximadamente 10-12 doações cerebrais por ano. Os ajustes são feitos para o limite de idade superior da morte para gerenciar o número de encaminhamentos derivados do LifeBanc.
Aquisição de doações O programa requer cobertura de 24 h, 365 dias por ano por membros do programa de doação de tecidos para suprimento de tecidos. Um e-mail de notificação de doação de tecido centralizado/pager/dispositivo móvel sistema de notificação de texto é usado pela equipe clínica cobrindo doações de tecidos. LifeBanc é fornecido números para contactar pessoal de plantão para o programa de doação de tecidos. Os membros são notificados de morte por prestadores de serviços hospitalares/parentes próximos (pré-consentiu) ou por LifeBanc e outras fontes de referência. Em primeiro lugar, é feita uma determinação do tempo de morte e a viabilidade da doação de tecidos. As mortes são então rastreadas para condições que potencialmente resultam em tecido de má qualidade, incluindo hipóxia pré-morte prolongada, tecido cerebral destrutivo maciço (por exemplo, hemorragia intracraniana grande, traços bi-hemisféricos extensos, tumor extenso (> 3 dias) e uso prolongado de agentes vasoativos (> 3 dias) antes da morte. Quando um examinador médico está envolvido em uma morte, o neurologista do estudo pode falar com o examinador médico para explorar uma maneira de receber tecidos oportunos sem comprometer a responsabilidade do examinador médico. Se o tecido viável é sentida para estar presente, então o consentimento escrito é obtido (se não for obtido pré-morte) e preparações são feitas para o transporte do corpo. Um serviço de transporte falecida previamente contratado é então contactado para o transporte para as instalações de ressonância magnética na Cleveland Clinic. O cuidado é tomado para assegurar-se de que o corpo permaneça na temperatura ambiente e não seja coloc no refrigeration, porque umas mais baixas temperaturas de corpo são associadas com as alterações em características do sinal de MRI.
História clínica A história clínica inclui detalhes sobre o diagnóstico de SM, início dos sintomas, tratamentos utilizados, resultados de testes clínicos e paraclínicos (potenciais evocados, resultados do fluido cefalorraquidiano, tomografia de coerência óptica), composto funcional de esclerose múltipla , e a escala expandida do status da inabilidade (EDSS; real ou estimada), que são coletadas do registro médico (onde disponível), e entrevista direta do parente seguinte. A RM pré-morte também é coletada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

Nós descrevemos um programa rápido da doação do tecido para indivíduos com esclerose múltipla (MS) que exige cientistas e técnicos ser em-chamada 24/7, 365 dias um o ano. Os participantes consentem em doar seu cérebro e medula espinhal. A maioria dos pacientes foi seguida por neurologistas no centro de Cleveland Clinic Mellen para tratamento e pesquisa em MS. Seus cursos clínicos e deficiências neurológicas são bem caracterizados. Logo após a morte, o corpo é transportado para o MS Imaging Center, onde o cérebro é escaneado in situ por 3 T ressonância magnética (RM). O corpo é então transferido para a sala de autópsia, onde o cérebro ea medula espinhal são removidos. O cérebro é dividido em dois hemisférios. Um hemisfério é imediatamente colocado em uma caixa de fatiamento e as fatias alternadas de 1 cm de espessura são fixadas em paraformaldeído a 4% por dois dias ou rapidamente congeladas em gelo seco e 2-metilbutano. As fatias curtas-fixas do cérebro são armazenadas em uma solução da criopreservação e usadas para análises histológicas e deteção Immunocytochemical de antígenos sensíveis. As fatias congeladas são armazenadas em-80 ° c e usadas para estudos moleculares, Immunocytochemical, e in situ do espaço da hibridação/RNA. O outro hemisfério é coloc no paraformaldeído de 4% por diversos meses, coloc na caixa de fatiamento, re-digitalizados no varredor da ressonância magnética de 3 T (Sr.) e cortado em fatias do centímetro-grosso. As imagens de RM in situ pós-morte (MRIs) são coregistradas com fatias cerebrais de 1 cm de espessura para facilitar as correlações da ressonância magnética. Todas as fatias do cérebro são fotografadas e as lesões da branco-matéria do cérebro são identificadas. A medula espinhal é cortada em segmentos de 2 cm. Segmentos alternativos são fixados em 4% paraformaldeído ou rapidamente congelados. A aquisição rápida de tecidos do MS pós-morte permite análises patológicas e moleculars de cérebros de MS e de cordas espinais e de correlações patológicas de anomalias do cérebro MRI. A qualidade destes tecidos pós-morte ràpida-processados (geralmente dentro de 6 h da morte) é de grande valor à pesquisa de MS e conduziu a muitas descobertas High-Impact.

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Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

A esclerose múltipla é uma doença desmielinante inflamatória sem cura. A análise do tecido cerebral fornece indícios importantes para a compreensão da patogênese da doença. Aqui nós discutimos a metodologia e a análise a jusante do tecido do cérebro do MS coletado através de um programa rápido original da autópsia na operação na clínica de Cleveland.

Programa de autópsia abrangente para indivíduos com esclerose múltipla

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

O objetivo de nossa pesquisa é estudar a patogênese da esclerose múltipla. Para alcançar esse objetivo, estabelecemos um programa rápido de autópsia para obter e estudar os cérebros de indivíduos com ESM. Há dois aspectos especiais do nosso programa de autópsia, o primeiro é que é rápido. Coletamos o cérebro com menos de seis a oito horas de morte.Isso permite estudos moleculares de última geração. O segundo aspecto é que fazemos uma ressonância magnética antes de movermos o cérebro. Isso nos permite correlacionar alterações patológicas com alterações de imagem cerebral.A demonstração visual permite que os espectadores entendam como organizamos nosso espaço e tempo para alcançar resultados ideais. O processamento tecidual que acontece de forma rápida e cuidadosa permite a análise do RNA, imunosstaining, imunoblotting e ressonância magnética. Novos pesquisadores podem ter dificuldades com o processamento de tecidos com baixa integridade tecidual.Evitar longos tempos de fixação pós-morte é importante e as estrias de cabos de ressonância magnética podem ser desafiadoras, por isso a consulta com especialistas em análise de ressonância magnética pode ser muito útil. Demonstrando o procedimento serão Emilie Christie e Christina Volsko. Técnicos do nosso laboratório.Depois de in situ ressonância magnética, pese e fotografe o cérebro e coloque qualquer dura presa em um recipiente de 4%Paraformaldeído ou PFA. Separe o cerebelo e o tronco cerebral do cerebrum e fotografe o cerebrum. Use uma sonda para separar os nervos ópticos, quiasmo e tratos e ressectar a estrutura com um bisturi.Separe os hemisférios cerebrais longitudinalmente e fotografe cada hemisfério individualmente. Tinta do córtex motor primário ou PMC para o hemisfério esquerdo, refotografar o tecido e colocar o tecido em um recipiente de 3,3 litros para fixação longa. Para extirir o PMC para o hemisfério direito remova os meninges de cobertura e refotografia do tecido.Em seguida, ressecção do PMC usando um bisturi. Em seguida, fotografe o PMC ressecado ao lado do hemisfério. Corte o PMC em seis seções de tamanho igual e inseje o aspecto rostral de cada seção.Em seguida, coloque todas as outras seções em recipientes preenchidos com PFA para fixação curta. E congele as seções restantes para armazenamento em sacos de congelador lacrados, no refrigerador número um. Corte o hemisfério direito anterior para posterior em seções coronais de um centímetro de espessura.Corrija todas as outras seções em PFA e congele as seções restantes para armazenamento em sacos congeladores lacrados, no refrigerador número um. Separe o tronco cerebral do cerebelo e coloque o tronco cerebral em um recipiente preenchido com PFA para fixação curta. Corte cada hemisfério cerebelar em quatro seções sagiais igualmente fixas e fotografe as visões medial e lateral.Em seguida, coloque as fatias hemisféricas cerebelares esquerdas em um recipiente de PFA para fixação curta. E congele as fatias hemisféricas cerebelares certas para armazenamento em sacos de congelador selados, no refrigerador número um. Depois de obter a medula espinhal com as raízes nervosas remova a medula espinhal dura mater e armazene a dura dura em PFA.Separe as raízes nervosas anteriores e posteriores esquerdas e posteriores e corte as raízes nervosas anteriores e posteriores esquerdas da medula espinhal para fixação curta em PFA. Corte as raízes nervosas anteriores e posteriores direitas da corda espinhal e escorra congelar esses tecidos para armazenamento em sacos congeladores selados, no refrigerador número dois. Em seguida, fotografe o caudal-most 20 centímetro da medula espinhal e corte duas seções de transferência de centímetros da direção caudal para rostral do cordão para fixação curta pfa e congelamento de snap.Em seguida, fotografe a porção rostral restante da medula espinhal. E corte duas seções de transferência de centímetros da direção caudal para rostral do cabo para fixação curta pfa e congelamento de snap. Corte seções de juros dos tecidos fixos curtos ou longos.Coloque as seções em poços individuais de uma placa de seis poços e lave os tecidos com três lavagens de cinco minutos em dois mililitros de PBS fresco por lavagem, com agitação. Para recuperação de antígeno, micro-ondas as seções por dois a três minutos em um copo de vidro contendo cerca de 30 mililitros de 10 milimollars citrate buffer. Quando as seções tiverem esfriado para a temperatura ambiente transfira as amostras para uma nova placa de seis poços para três lavagens de cinco minutos e dois mililitros de PBS, mais 0,3% Triton X-100 por poço, por lavagem.Seguido pelo bloqueio de peroxidase endógeno em dois mililitros de peróxido de hidrogênio de 3% mais 0,3% Triton X-100 em PBS por 30 minutos, à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as seções três vezes em dois mililitros de PBS mais Triton X-100 por lavagem, como demonstrado. Seguido pelo bloqueio em dois mililitros de soro de cabra 3% normal e PBS mais Triton X-100 por uma hora em temperatura ambiente.Em seguida, incubar as seções da noite para cinco dias nos anticorpos primários de interesse a quatro graus celsius seguidos por três lavagens de cinco minutos em dois mililitros de PBS por lavagem. Incubar as seções em solução complexa avidin-biotina ou complexo ABC por uma hora, em temperatura ambiente. Acompanhe isso com três lavagens de cinco minutos na PBS.Rotule as seções com dois mililitros de Diaminobenzidina filtrada complementadas com per-per-per well de per per well de per-per for de três a oito minutos. Quando a cor tiver se desenvolvido adequadamente, lave as seções três vezes em PBS e transfira individualmente cada seção para um recipiente preenchido pbs. Posicione cada seção fixamente, sob lâminas de tecido individuais.E levante suavemente cada slide para fora do PBS, mantendo as seções o mais planas possível. Use duas pincéis para achatar suavemente e esticar cada tecido. E use uma toalha de papel para afastar o excesso de água.Em seguida, monte as seções com um meio de montagem adequado e sele cada deslizamento de tampa com esmalte claro. As seções teciduais são examinadas para a presença de lesões de matéria branca e as regiões selecionadas são manchadas para atividade imunológica e desmielinização. Em lesões múltiplas agudas, muitos desses axônios desmielinados atuam como lâmpadas de retração axonal que refletem as extremidades proximais dos axônios transeccionados.A densidade de axônios transectados em lesões agudas excede 11000 por milímetro cúbico em lesões ativas, em comparação com apenas 15 em regiões adjacentes de matéria branca não lesiva. Oligodendrócitos recém-gerados também estão presentes em muitas lesões crônicas de ESM. Esses processos associam-se, mas não meliam axônios desmielinados.Uma busca representativa e imparcial por alterações genéticas neuronais no córtex motor rapidamente congelado obtido de pacientes crônicos de ESM, identificou reduções significativas em 23 estudos de credenciamento do mensageiro mitocondrial nuclear e codificado por RNA usando imunocytoquímica e na hibridização in situ indicou que esses genes foram altamente enriquecidos em neurônios de projeção cortica e que mitocôndrias isoladas de axônios de projeção mostram glicolyse reduzida. A comparação da expressão genética do neuronodo no hipocampi mieliado e desmielinado revela reduções no mensageiro neuronal RNA's, incluindo proteínas envolvidas na memória e aprendizagem. Além disso, em comparação com os cortices de controle, a perda neuronal cortical é significativamente maior em uma subsuso populacional de pacientes com ES que têm desmielinização da medula espinhal e córtex cerebral, mas não da matéria branca cerebral.Durante o processamento tecidual, certifique-se de que quando as seções coronais são cortadas elas são cortadas consistentemente em relação à espessura e orientação. E que eles ficam deitados quando flutuam em um fixador ou quando congelados. Além da análise imunohistoquímica, a coleta de tecidos congelados nos dá a oportunidade de realizar análises genéticas e proteômicas.Estas técnicas têm auxiliado na identificação de uma nova coorte de pacientes com ES com lesões de matéria branca cerebral na ressonância magnética, mas sem qualquer demyelinação de matéria branca significativa. Denominado Mielócortical MS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Neurociência

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

Um protocolo abrangente para segmentação manual das estruturas do lobo temporal medial

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Análise de interação psicofisiológicos generalizada (PPI) de memória relacionados com a conectividade em indivíduos em risco genético para a doença de Alzheimer

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Ressonância magnética funcional em conjunto com um novo dispositivo robótico induzido à mão compatível com ressonância magnética para avaliar a reabilitação de indivíduos que se recuperam de déficits de aperto de mão

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Implante crônico de matrizes flexíveis múltiplas do elétrodo do polímero

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Programa multitaper spectrograma baseado em computador para dados eletroencefalográficos

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...