Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
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Los autores también quieren agradecer al Dr. Christopher Nelson por su asistencia editorial. El programa de autopsia es apoyado en parte por la concesión R35 NS097303 a BDT. El trabajo en el laboratorio de RD está respaldado por subvenciones de NINDS (NS096148) y la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, EE.UU. (RG 5298).

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1-/T2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis.">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li><li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Describimos un protocolo que se ha utilizado para adquirir y procesar rápidamente tejido de más de 150 individuos con EM. Una característica importante de este protocolo es que los científicos que utilizan el tejido también están a cargo de establecer el protocolo y realizar la recolección de tejido. Esto proporciona flexibilidad para satisfacer las necesidades científicas de los proyectos de investigación individuales. Varios aspectos de este protocolo mejoran su utilidad. Los pacientes suelen estar bien caracterizados antes de la muerte, ya que muchos de ellos han sido seguidos por neurólogos en nuestro centro. Un paso crítico es el procesamiento de donaciones de tejido poco después de la muerte, lo que aumenta la calidad del tejido congelado en comparación con algunos otros bancos cerebrales. Esto permite estudios moleculares que son de gran valor en la descripción de los cambios en los productos genéticos transcripcionales y traslacionales, que son esenciales para la fundamentación de observaciones histológicas e inmunocitoquímicas. El aprovechamiento de los datos morfológicos/inmunocitoquímicos y moleculares en múltiples casos mejora la fiabilidad de las conclusiones. Esto se ilustra mejor con nuestra descripción de los cambios del gen mitocondrial en la corteza cerebral y los cambios del gen neuronal en el hipocampo desmielinizado. Se están desarrollando nuevos protocolos de generación de perfiles genéticos a un ritmo rápido y el tejido congelado de nuestro banco debería proporcionar ARN de alta calidad para el análisis de tejidos y células monocelulares.
Otro aspecto valioso de nuestro protocolo son las rebanadas de cerebro cortas fijas. Estos tejidos se cortan en secciones de 30 m de espesor y flotación libre. Estas secciones son ideales para el uso de microscopía confocal para analizar dos o más antígenos en tres dimensiones. Algunos buenos ejemplos incluyen la interacción de procesos de oligodendrocitos premielinantes con axones distróficos en lesiones crónicas de EM, así como la identificación de conexiones axonales individuales a bombillas de retracción axonal transectadas. Esto contrasta con el uso rutinario de secciones de parafina de 7 m de espesor, donde las imágenes 3D no son factibles. Los tejidos incrustados en parafina tienen un gran valor para algunas preguntas, especialmente la cuantificación de las densidades neuronales en secciones hemisféricas de 7 m de espesor. Nuestros protocolos de procesamiento de tejidos, por lo tanto, son diversos y proporcionan flexibilidad para asegurar tejidos fijos y rápidamente congelados.
Otra característica única de nuestro protocolo es la resonancia magnética cerebral in situ postmortem. Las resonancias magnéticas cerebrales son un biomarcador insustituible de la enfermedad de la MI. Por lo tanto, es esencial establecer los correlatos patológicos de las señales de RMN anormales. Nuestros estudios establecieron que los ROI T2 y T2T1MTR a menudo son mielinados. Este hallazgo apoya la necesidad de modalidades de diagnóstico por imágenes más específicas que distingan de forma fiable entre la materia blanca cerebral mielinizada y desmielinizada. La RMN parece ser sensible para la detección de mielina, pero nuestros estudios demuestran que incluso una combinación de T1/T2/MTR no es específica para identificar la mielinización. Nuestro protocolo postmortem proporciona una plataforma ideal para probar la capacidad de nuevas modalidades de imagen para distinguir entre materia blanca cerebral mielinizada y desmielinizada. La RMN también proporciona el vehículo ideal para la traducción de los resultados científicos básicos a la práctica clínica, dado el uso de la RMN en nuestra investigación traslacional y su uso clínico generalizado en pacientes vivos.
Mientras que el corte corto y largo fijo, así como las rodajas congeladas ofrece una ventaja para el procesamiento de tejido en múltiples modos para diferentes estudios, hay algunas limitaciones con este método. La evaluación de la totalidad de una estructura puede limitarse, ya que las partes de ella pueden procesarse de manera diferente en sectores adyacentes. El gran volumen del banco de tejidos, sin embargo, ofrece la capacidad de investigar una estructura de interés en múltiples sujetos para mejorar el muestreo. Otra limitación general a los estudios que utilizan tejidos postmortem es que son transversales. Las conclusiones relativas al calendario y la progresión de los cambios deben interpretarse en este contexto. Puede haber un sesgo de selección para los pacientes que donan sus tejidos, lo que puede limitar la generalización de los datos a todos los pacientes con EM. Dado que la mayoría de los donantes mueren por complicaciones de la EM avanzada, puede que no sea apropiado extrapolar los hallazgos de estos pacientes a los que se encuentran en etapas tempranas de la EM. No obstante, hemos recibido tejidos de pacientes más jóvenes que murieron de afecciones no relacionadas con la EMM (es decir, infarto agudo de miocardio, sobredosis de drogas, suicidio). El alcance de nuestro protocolo no incluye el muestreo de otros órganos (por ejemplo, gastrointestinales y médula ósea) que han estado implicados en la EM. Creemos que las fortalezas del programa superan en gran medida sus limitaciones.

Una de las mejores maneras de estudiar una enfermedad es examinar el propio tejido enfermo. Esto presenta desafíos para aquellos que estudian enfermedades del sistema nervioso central (SNC). Las biopsias del cerebro y la médula espinal enfermos son extremadamente raras y generalmente implican casos atípicos. Las tasas de autopsia para individuos con enfermedades del SNC han disminuido drásticamente en los últimos años, y cuando se realizan, a menudo no proporcionan una rápida adquisición de tejidos. Estos desafíos han dado lugar al establecimiento de bancos cerebrales centrados en la enfermedad, incluyendo varios centrados en la recolección de tejidos de individuos con esclerosis múltiple (EP). La EM es una enfermedad mediada por inflamación del SNC que destruye la mielina, los oligodendrocitos (células formadoras de mielina), las neuronas y los axones. La mayoría de los pacientes con EM tienen un curso de enfermedad bifásica que comienza con brotes de discapacidad neurológica con recuperación variable que eventualmente evoluciona hacia una enfermedad gradualmente progresiva que es probablemente neurodegenerativa en la naturaleza1. Para la mayoría de los cerebros donados de EM, los intervalos de postmortem (PMI) entre la muerte y el procesamiento de tejidos superan las 24 h. Si bien estos tejidos han proporcionado información valiosa sobre los cambios patológicos en los cerebros de la EM, no son adecuados para estudios moleculares más avanzados que pueden proporcionar información poderosa sobre la fisiopatología de la enfermedad. Este es particularmente el caso de los estudios de perfilado de genes, que requieren ARN intacto.
Para superar las limitaciones discutidas anteriormente, hemos desarrollado un programa de donación rápida de tejidos que permite la RMN/correlaciones patológicas. Este protocolo proporciona tejidos bien conservados adecuados para estudios moleculares modernos y permite la comparación directa de la patología cerebral y las anomalías de la RMN en los cerebros de la EM. El Programa de Donación de Tejido de Esclerosis Múltiple de Cleveland Clinic ha existido por más de 20 años. Este programa de donación rápida de tejidos adquiere cerebros y médula espinal de individuos con EM y otras afecciones neurológicas autoinmunes asociadas. El programa tiene como objetivo obtener resonancias magnéticas in situ dentro de las 6 horas de la muerte, seguido de la eliminación del cerebro y la médula espinal para el procesamiento de tejido.
Reclutamiento Las donaciones se obtienen a través del consentimiento ante mortem obtenido directamente de pacientes (pre-consentidos) o de parientes cercanos después de la muerte. Los pacientes pre-consentidos son típicamente identificados de la población clínica en el Centro Mellen para el Tratamiento e Investigación de la Esclerosis Múltiple en Cleveland, Ohio. Aunque la preferencia en el reclutamiento en el programa de donación rápida de tejidos se da a los pacientes que han sido seguidos en estudios de investigación longitudinal, está abierto a todos los pacientes vistos en el centro. Los participantes que se inscriban antes de la muerte reciben instrucciones para que los miembros de la familia o los proveedores de atención médica se comuniquen con el equipo de investigación, ya sea en el momento de la muerte o cuando se cree que la muerte es inminente. El segundo método para que las personas ingresen al programa de donación de tejidoes es en el momento de la muerte a través del consentimiento de sus parientes. El estado de Ohio requiere que las muertes sean referidas a una organización de adquisición de órganos de mandato federal llamada LifeBanc, que opera en 20 condados del noreste de Ohio. LifeBanc analiza todas las muertes para un diagnóstico de EM, que es una exclusión para la donación de órganos. Se hicieron arreglos para que LifeBanc notificara a los investigadores del programa de donación de tejido de la MS para todas las muertes con un diagnóstico asociado de LA EM que ocurren dentro de un radio de 75 millas de la Clínica Cleveland. El siguiente personal de los parientes y del hospital es contactado por el personal del Programa de Donación de Tejidos y se obtiene el consentimiento para la donación de cerebro y tejidos de la médula espinal. Estos dos métodos de reclutamiento ante-mortem y post-mortem a través de LifeBanc resultan en aproximadamente 10-12 donaciones de cerebro sin año. Los ajustes se realizan al límite de edad superior de la muerte para gestionar el número de referencias derivadas de LifeBanc.
Adquisición de donaciones El programa requiere cobertura de 24 horas, 365 días al año por los miembros del programa de donación de tejidos para la adquisición de tejidos. El equipo clínico que cubre las donaciones de tejidos utiliza un sistema centralizado de notificación de donación de tejidos por correo electrónico/localizador/dispositivo móvil. LifeBanc recibe números para contactar al personal de guardia para el programa de donación de tejidos. Los miembros son notificados de la muerte por parte de los proveedores de hospitales/próximos de parientes (pre-consentidos) o por LifeBanc y otras fuentes de referencia. En primer lugar, se hace una determinación del tiempo de muerte y la viabilidad de la donación de tejidos. Las muertes se examinan en busca de condiciones que potencialmente resulten en tejido de mala calidad, incluyendo hipoxia premortem prolongada, tejido cerebral destructivo masivo (por ejemplo, hemorragia intracraneal grande, accidentes cerebrovasculares bihemisféricos extensos, tumor extenso apoyo prolongado del respirador (>3 días) y uso prolongado de agentes vasoactivos (>3 días) antes de la muerte. Cuando un médico forense está involucrado en una muerte, el neurólogo del estudio puede hablar con el médico forense para explorar una manera de recibir tejidos oportunos sin comprometer la responsabilidad del médico forense. Si se considera que el tejido viable está presente, se obtiene el consentimiento por escrito (si no se obtiene antes de la autopsia) y se hacen preparaciones para el transporte corporal. A continuación, se contacta con un servicio de transporte de difuntos previamente contratado para su transporte a las instalaciones de resonancia magnética de Cleveland Clinic. Se tiene cuidado de asegurarse de que el cuerpo permanece a temperatura ambiente y no se coloca en la refrigeración, ya que las temperaturas corporales más bajas se asocian con alteraciones en las características de la señal de RMN.
Historia clínica La historia clínica incluye detalles sobre el diagnóstico de EM, la aparición de síntomas, tratamientos utilizados, resultados de pruebas clínicas y paraclínicas (potenciales evocados, resultados del líquido cefalorraquídeo, tomografía de coherencia óptica), esclerosis múltiple compuesto funcional , y la escala ampliada del estado de discapacidad (EDSS; real o estimada), que se recogen del expediente médico (cuando esté disponible), y la entrevista directa de parientes cercanos. También se recogen resonancias magnéticas premortem.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

Describimos un programa de donación rápida de tejidos para personas con esclerosis múltiple (ESCLEROSIs múltiple) que requiere que los científicos y técnicos estén de guardia las 24 horas del día, los 7 días de la semana, los 365 días del año. Los participantes consienten en donar su cerebro y la médula espinal. La mayoría de los pacientes fueron seguidos por neurólogos en el Cleveland Clinic Mellen Center for MS Treatment and Research. Sus cursos clínicos y discapacidades neurológicas están bien caracterizados. Poco después de la muerte, el cuerpo es transportado al Centro de Imágenes de MS, donde el cerebro es escaneado in situ por imágenes de resonancia magnética de 3 T (RM). El cuerpo se transfiere a la sala de autopsias, donde se extraen el cerebro y la médula espinal. El cerebro se divide en dos hemisferios. Un hemisferio se coloca inmediatamente en una caja de corte y las rodajas alternas de 1 cm de espesor se fijan en 4% de paraformaldehído durante dos días o se congelan rápidamente en hielo seco y 2-metilbutano. Las rodajas de cerebro de corte corto fijo se almacenan en una solución criopreservación y se utilizan para análisis histológicos y detección inmunocitoquímica de antígenos sensibles. Las rodajas congeladas se almacenan a -80 oC y se utilizan para estudios moleculares, inmunocitoquímicos e in situ de hibridación/ámbito de ARN. El otro hemisferio se coloca en 4% de paraformaldehído durante varios meses, se coloca en la caja de corte, se vuelve a escanear en el escáner de resonancia magnética de 3 T (MR) y se corta en rodajas de centímetro de espesor. Las imágenes de RM in situ (RM) postmortem se registran en conjunto con rodajas cerebrales de 1 cm de espesor para facilitar las correlaciones RMN-patología. Todas las rebanadas cerebrales son fotografiadas y se identifican lesiones cerebrales de materia blanca. La médula espinal se corta en segmentos de 2 cm. Los segmentos alternativos se fijan en un 4% de paraformaldehyde o se congelan rápidamente. La rápida adquisición de los tejidos de EM postmortem permite análisis patológicos y moleculares de los cerebros y las médulas espinales de la EM y correlaciones patológicas de las anomalías de la RMN cerebral. La calidad de estos tejidos postmortem procesados rápidamente (generalmente dentro de 6 h de la muerte) es de gran valor para la investigación de la EM y ha dado lugar a muchos descubrimientos de alto impacto.

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Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinante inflamatoria sin cura. El análisis del tejido cerebral proporciona pistas importantes para entender la patogénesis de la enfermedad. Aquí discutimos la metodología y el análisis posterior del tejido cerebral de la ESCLEROSIs recogido a través de un programa único de autopsia rápida en funcionamiento en la Clínica Cleveland.

Programa integral de autopsias para individuos con esclerosis múltiple

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

El objetivo de nuestra investigación es estudiar la patogénesis de la esclerosis múltiple. Para lograr este objetivo hemos establecido un programa rápido de autopsia para obtener y estudiar el cerebro de individuos con MS. Hay dos aspectos especiales de nuestro programa de autopsias, el primero es que es rápido. Recogemos el cerebro por debajo de seis a ocho horas de muerte.Esto permite estudios moleculares de última generación. El segundo aspecto es que hacemos una resonancia magnética in situ antes de mover el cerebro. Esto nos permite correlacionar los cambios patológicos con los cambios en las imágenes cerebrales.La demostración visual permite a los espectadores comprender cómo organizamos nuestro espacio y tiempo para lograr resultados óptimos. El procesamiento de tejido que se produce rápidamente y cuidadosamente permite el análisis de ARN, inmunosu manchado, inmunoblotting y correlaciones de RMN. Los nuevos investigadores pueden tener problemas con el procesamiento de tejidos con mala integridad tisular.Evitar largos tiempos de fijación post mortem es importante y las estrías de corde tisular por RMN pueden ser difíciles, por lo que consultar con expertos en análisis de RMN puede ser muy útil. Demostrando el procedimiento serán Emilie Christie y Christina Volsko. Técnicos de nuestro laboratorio.Después de la resonancia magnética in situ, pese y fotografíe el cerebro y coloque cualquier dura adjunta en un recipiente de 4%Paraformaldehído o PFA. Separe el cerebelo y el tronco encefálica del cerebro y fotografíe el cerebro. Utilice una sonda para separar los nervios ópticos, el quiasmo y las vías y resecar la estructura con un bisturí.Separe los hemisferios cerebrales longitudinalmente y fotografíe cada hemisferio individualmente. Tinta la corteza motora primaria o PMC para el hemisferio izquierdo, refotografo el tejido y colocar el tejido en un recipiente de 3,3 litros para una fijación larga. Para extirpar el PMC para el hemisferio derecho retire las meninges de recubrimiento y vuelva afotografía del tejido.A continuación, resecar el PMC usando un bisturí. A continuación, fotografíe el PMC resecado junto al hemisferio. Corte el PMC en seis secciones de igual tamaño y tinta el aspecto rostral de cada sección.A continuación, coloque cada otra sección en recipientes llenos de PFA para una fijación corta. Y enganche las secciones restantes para almacenar en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número uno. Corte el hemisferio derecho anterior a posterior en secciones coronales de un centímetro de espesor.Fije cada otra sección en PFA y congele las secciones restantes para almacenar en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número uno. Separe el tronco encefálica del cerebelo y coloque el tronco encefálica en un recipiente lleno de PFA para una fijación corta. Corte cada hemisferio cerebeloso en cuatro secciones sagitales igualmente fijas y fotografíe las vistas medial y lateral.A continuación, coloque las rodajas hemisféricas cerebelosas izquierdas en un recipiente de PFA para una fijación corta. Y congelar las rebanadas hemisféricas cerebelosas correctas para almacenarlas en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número uno. Después de obtener la médula espinal con las raíces nerviosas eliminar la médula espinal dura mater y almacenar la dura en PFA.Separe las raíces nerviosas anteriores y posteriores izquierda y derecha y corte las raíces nerviosas anterior y posterior izquierda de la médula espinal para una fijación corta en PFA. Cortar las raíces nerviosas anteriores y posteriores correctas de la cuerda vertebral y congelar estos tejidos para almacenarlos en bolsas de congelador selladas, en el refrigerador número dos. A continuación, fotografie los 20 centímetros de la médula espinal y corte dos secciones de transferencia de centímetros desde el caudal hasta la dirección rostral del cordón para la fijación corta PFA y congelación a presión.Luego fotografíe la porción rostral restante de la médula espinal. Y corte las secciones de transferencia de dos centímetros de la dirección caudal a rostral del cordón para la fijación corta PFA y congelación de presión. Corte las secciones de interés de los tejidos fijos cortos o largos.Coloque las secciones en pozos individuales de una placa de seis pozos y lave los tejidos con tres lavados de cinco minutos en dos mililitros de PBS fresco por lavado, con agitación. Para la recuperación de antígenos, microonda las secciones durante dos a tres minutos en un vaso de precipitados de vidrio que contiene aproximadamente 30 mililitros de 10 tampón de citrato milimolar. Cuando las secciones se hayan enfriado a temperatura ambiente, transfiera las muestras a una nueva placa de seis pozos para tres lavados de cinco minutos y dos mililitros de PBS, más 0.3%Triton X-100 por pozo, por lavado.Seguido por el bloqueo endógeno de peroxidasa en dos mililitros de 3%peróxido de hidrógeno más 0.3%Tritón X-100 en PBS durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las secciones tres veces en dos mililitros de PBS más Tritón X-100 por lavado, como se ha demostrado. Seguido por el bloqueo en dos mililitros de 3% de suero de cabra normal y PBS más Triton X-100 durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, incubar las secciones de la noche a cinco días en los anticuerpos primarios de interés a cuatro grados centígrados seguidos de tres lavados de cinco minutos en dos mililitros de PBS por lavado. Incubar las secciones en solución compleja de avidina-biotina o complejo ABC durante una hora, a temperatura ambiente. Siga esto con tres lavados de cinco minutos en PBS.Etiquetar las secciones con dos mililitros de Diaminobenzidina filtrada suplementada con peróxido de hidrógeno per pozo por pozo durante tres a ocho minutos. Cuando el color se haya desarrollado adecuadamente, lave las secciones tres veces en PBS y transfiera individualmente cada sección a un recipiente lleno de PBS. Coloque cada sección planamente, debajo de diapositivas de tejido individuales.Y levante suavemente cada diapositiva fuera del PBS, manteniendo las secciones lo más planas posible. Use dos pinceles para aplanar y estirar suavemente cada tejido. Y usa una toalla de papel para eliminar el exceso de agua.A continuación, monte las secciones con un medio de montaje adecuado y selle cada resbalón de cubierta con esmalte de uñas transparente. Las secciones de tejido se examinan en busca de la presencia de lesiones de materia blanca y las regiones seleccionadas se tiñen de actividad inmune y desmielinización. En lesiones agudas múltiples de Sceloris muchos de estos axones desmielinados actúan como bulbos de retracción axonal que reflejan los extremos proximales de los axones transectados.La densidad de los axones transectados en lesiones agudas supera los 11000 por milímetro cúbico en lesiones activas en comparación con sólo 15 en regiones adyacentes de materia blanca no lesional. Los oligodendrocitos recién generados también están presentes en muchas lesiones crónicas de la E.S. Estos procesos se asocian con los axones desmielinados pero no mielinados.Una búsqueda representativa e imparcial de cambios en los genes neuronales en el cortexto motorizado rápidamente congelado obtenidos de pacientes con EME crónica, identificó reducciones significativas en 23 estudios de credencialización del ARN del mensajero mitocondrial nuclear y codificado mediante inmunocitoquímica e hibridación in situ indicaron que estos genes estaban altamente enriquecidos en las neuronas de proyección cortical y que las mitocondrias aisladas de los proyecciones de axinos muestran una glucólisis reducida. La comparación de la expresión génica del neuronodo en hipocampos mielinados y desmielinados revela reducciones en el ARN mensajero neuronal, incluidas las proteínas implicadas en la memoria y el aprendizaje. Además, en comparación con los cortices de control, la pérdida neuronal cortical es significativamente mayor en una subcuestorula de pacientes con EME que tienen desmielinización de la médula espinal y cortexto cerebral, pero no de la materia blanca cerebral.Durante el procesamiento del tejido, asegúrese de que cuando se cortan las secciones coronales se cortan de manera consistente con respecto al grosor y la orientación. Y que se encuentran planas cuando flotan en un fijador o cuando se congelan. Además del análisis inmunohistoquímico, la colección de tejidos congelados nos brinda la oportunidad de realizar análisis genéticos y proteómicos.Estas técnicas han ayudado en la identificación de una nueva cohorte de pacientes con AMA con lesiones de materia blanca cerebral en la RMN, pero sin ninguna desmielinización significativa de la materia blanca. Denominado MS mielocortical.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Uso del protocolo Theta-Burst para explorar Mechasnism de plasticidad en los individuos con el síndrome de X frágil y el autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Investigación

Neurociencias

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

Un protocolo integral para la segmentación manual de las estructuras mediales Temporal Lobe

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

La medición de la discapacidad neurológica progresiva en un modelo de ratón de la esclerosis múltiple

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Análisis de la interacción psicofisiológica generalizada (PPI) de la memoria relacionados con la conectividad en individuos con riesgo genético de la enfermedad de Alzheimer

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Resonancia magnética funcional en conjunto con un nuevo dispositivo robótico inducido por RMN para evaluar la rehabilitación de las personas que se recuperan de los déficits de agarre de manos

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Implantación Crónica de Múltiples Matrices de Electrodos Flexibles de Polímeros

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Programa de Espectrograma Multitaper basado en Computadora para Datos Electroencefalográficos

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...