Omfattande Obduktions program för individer med multipel skleros

Målet med vår forskning är att studera patogenesen vid Multipel skleros. För att uppnå detta mål har vi etablerat ett snabbt obduktionsprogram för att erhålla och för att studera hjärnorna från individer med MS. Det finns två speciella aspekter av vårt obduktionsprogram, det första är att det är snabbt. Vi samlar hjärnans under sex till åtta timmars död.

Detta möjliggör toppmoderna molekylära studier. Den andra aspekten är att vi gör en in situ MRI innan vi flyttar hjärnan. Detta gör det möjligt för oss att korrelera patologiska förändringar med hjärnans avbildning förändringar.

Visuell demonstration gör att tittarna kan förstå hur vi organiserar vårt utrymme och tid för att uppnå optimala resultat. Vävnadsbearbetning som sker snabbt och noggrant möjliggör RNA-analys, immunfärgning, immunoblotting och MR-korrelationer. Nya forskare kan kämpa med bearbetning av vävnader med dålig vävnad integritet.

Undvika långa post mortem fixeringstider är viktigt och MRI vävnad sladdtrissationer kan vara utmanande så samråd med MRI analys experter kan vara mycket användbart. Visar förfarandet kommer att Emilie Christie och Christina Volsko. Tekniker från vårt labb.

Efter In situ magnetisk resonanstomografi, väg och fotografera hjärnan och placera någon bifogad dura i en behållare med 4%Paraformaldehyde eller PFA. Separera lillhjärnan och hjärnstammen från storhjärnan och fotografera storhjärnan. Använd en sond för att separera synnerverna, chiasm och skrifter och resect strukturen med en skalpell.

Separera de cerebrala halvkloten longitudinellt och fotografera varje halvklot individuellt. Bläck den primära motor cortex eller PMC för den vänstra hjärnhalvan, rephotograph vävnaden och placera vävnaden i en 3,3 liters behållare för lång fixering. Till punktskatt PMC för den högra hjärnhalvan ta bort den täckande hjärnhinnorna och rephotograph vävnaden.

Nästa resect PMC med hjälp av en skalpell. Fotografera sedan den resected PMC bredvid halvklotet. Skär PMC i sex lika stora sektioner och bläck rostral aspekten av varje avsnitt.

Placera sedan varannan sektion i PFA fyllda behållare för kort fixering. Och snap frysa de återstående sektionerna för förvaring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer ett. Skär den högra hjärnhalvan främre till posterior i en centimeter tjocka koronasektioner.

Fix varannan sektion i PFA och snap frysa de återstående sektionerna för förvaring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer ett. Separera hjärnstammen från lillhjärnan och placera hjärnstammen i en PFA fylld behållare för kort fixering. Skär varje cerebellar halvklotet i fyra lika fasta sagittal sektioner och fotografera mediala och laterala vyer.

Placera sedan vänster cerebellar halvklotformade skivor i en behållare med PFA för kort fixering. Och snap frysa rätt cerebellar halvklotformade skivor för lagring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer ett. Efter att ha erhållit ryggmärgen med nervrötterna ta bort ryggmärgen dura mater och lagra dura i PFA.

Separera vänster och höger främre och bakre nervrötter och skär vänster främre och bakre nervrötter från ryggmärgen för kort fixering i PFA. Skär rätt främre och bakre nervrötter från ryggmärgen och snap frysa dessa vävnader för förvaring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer två. Fotografera sedan den caudal-mest 20 centimeter av ryggmärgen och skär två centimeter överföring sektioner från caudal till rostral riktning av sladden för PFA kort fixering och snäpp frysning.

Fotografera sedan den återstående rostrala delen av ryggmärgen. Och skär två centimeter överföring sektioner från caudal till rostral riktning av sladden för PFA kort fixering och snäpp frysning. Skär avsnitt av intresse från den korta eller långa fasta vävnader.

Placera sektionerna i enskilda brunnar av en sex brunnsplatta och tvätta vävnaderna med tre fem minuters tvättar i två milliliter färsk PBS per tvätt, med skakningar. För antigen hämtning, mikrovågsugn sektionerna för två till tre minuter i en glasbägare som innehåller ungefär 30 milliliter av 10 millimollar citrat buffert. När sektionerna har svalnat till rumstemperatur överföra proverna till en ny sex brunnsplatta för tre fem minuters tvättar och två milliliter PBS, plus 0,3%Triton X-100 per brunn, per tvätt.

Följt av endogen peroxidas blockering i två milliliter av 3%väteperoxid plus 0,3%Triton X-100 i PBS i 30 minuter, vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen tvättar du sektionerna tre gånger i två milliliter PBS plus Triton X-100 per tvätt, som visats. Följt av blockering i två milliliter av 3%normal get serum och PBS plus Triton X-100 i en timme vid rumstemperatur.

Därefter inkubera sektionerna från natten till fem dagar i de primära antikropparna av intresse vid fyra grader celsius följt av tre fem minuters tvättar i två milliliter PBS per tvätt. Inkubera sektionerna i avidin-biotin komplex lösning eller ABC-komplex i en timme, vid rumstemperatur. Följ upp detta med tre fem minuters tvättar i PBS.

Märk sektionerna med två milliliter av filtrerat Diaminobenzidin kompletterat med väteperoxid per brunn i tre till åtta minuter. När färgen har utvecklats på ett tillfredsställande sätt, tvätta sektionerna tre gånger i PBS och individuellt överföra varje sektion till en PBS fylld behållare. Placera varje sektion plant, under enskilda vävnadsglas.

Och lyft försiktigt varje bild ur PBS, hålla sektionerna så platt som möjligt. Använd två penslar för att försiktigt platta ut och sträcka ut varje vävnad. Och använd en pappershandduk för att badda bort överflödigt vatten.

Montera sedan sektionerna med ett lämpligt monteringsmedium och täta varje täcksli med klart nagellack. Vävnadssektioner undersöks för förekomsten av white matter-lesioner och de valda regionerna färgas för immunaktivitet och demyelination. I akut Flera Sceloris skador många av dessa demyelinated axons fungera som axonal upprullning lökar som återspeglar de proximala ändarna av transected axons.

Tätheten av transected axoner i akut organskador överstiger 11000 per kubikmillimeter i aktiva skador jämfört med bara 15 i angränsande icke-lesional white matter regioner. Nyligen genererade oligodendrocytes är också närvarande i många kroniska MS skador. Dessa processer associerar med men inte myelinate demyelinated axoner.

En representativ, opartisk sökning efter neuronala genförändringar i snabbt frysta motor cortext erhållits från kroniska MS patienter, identifierat betydande minskningar i 23 nukleära och kodade mitokondriellt budbärare RNA: s Credentialing studier med hjälp av immuncytokemi och i situ hybridisering anges att dessa gener var högt berikade i kortikala projektion nervceller och att mitokondrier isolerade från projektion axons minskad display nedsatt display display nedsatt display. Jämförelse av neuronode genen uttryck i myelinated och demyelinated hippocampi avslöjar minskningar i neuronal budbärare RNA: s inklusive proteiner som deltar i minne och lärande. Vidare, jämfört med kontroll cortices, när neuronal förlust är betydligt större i en sub population av MS patienter som har demyelination av ryggmärgen och hjärnbarken men inte av cerebral white frågan.

Under vävnadsbearbetning, se till att när koronasektionerna skärs de skärs konsekvent med avseende på tjocklek och orientering. Och att de ligger platt när de flyter i ett fixativt eller när de är frusna. Förutom den immunhistokemiska analysen ger den frusna vävnadssamlingen oss möjlighet att genomföra genetisk och proteomisk analys.

Dessa tekniker har hjälpt i identifiering av en ny kohort av MS patienter med cerebral white fråga skador på MRI men utan någon betydande vit fråga demyelination. Benämnd Myelokortisk MS.