Name: comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis
Uploaded: 2019-07-19T12:30:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Författarna skulle också vilja tacka Dr Christopher Nelson för redaktionellt stöd. Obduktionen programmet stöds delvis av R35 Grant NS097303 till BDT. Arbetet i laboratoriet för RD stöds av bidrag från NINDS (NS096148) och det nationella multipel skleros Society, USA (RG 5298).

Detta protokoll har godkänts av Cleveland Clinic institutionella Review Board och följer riktlinjer från Cleveland Clinic Human Research etikkommittén.
1. in situ MRT
<ol><li>Ta givar kroppen till MRI-sviten och genomför ett 2 h MRI-avbildningsprotokoll vid MS Imaging-anläggningen. Utföra MRI på en 3 T eller 7 T Imager. Anmärkning: Prioritet ges till 3T eftersom majoriteten av äldre data har utförts på 3 T, men när den inte är tillgänglig utförs Imaging med 7T. Utsedda kärnsekvenser utförs för alla fall (tabell 1) och ytterligare sekvenser som beror på aktuella forskningsintressen utförs om tiden tillåter (begränsas av att uppnå vävnadsinfixering mindre än 12 h efter döden). I tabell 1 beskrivs kärnsekvenserna.</li>
</ol>2. obduktion
Anmärkning: Efter den in situ MRI, kroppen transporteras till bårhuset för hjärna och ryggmärg utvinning av en Diener och vävnad bearbetning av Lab medlemmar.
<ol><li>Utför följande steg innan kroppen anländer till bårhuset. Två timmar före, Förbered 3 L 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) och etikett behållare och påsar för vävnads lagring. Bered 3 L 8% PFA och späd 1,5 L av 8% PFA till 4% PFA. Placera resterande 8% PFA i 4 ° c för dag 2.</li>
	<li>Innan du reser till bårhuset, Fyll 2 resor kylare till 50% kapacitet med torris (stora block bryts för att passa och små pellets).</li>
	<li>Vid bårhuset fyller du en behållare i rostfrittstål halvvägs med 2-metylbutan och torris och täck med ett lock som förberedelse för Snap som fryser vävnaden.</li>
	<li>Väg och fotografera hjärnan en gång avlägsnas genom Diener.</li>
	<li>Placera någon bifogad Dura i en behållare fylld med PFA.</li>
	<li>Separera lillhjärnan och hjärnstammen från storhjärnan och fotografera storhjärnan.</li>
	<li>Identifiera synnerver, chiasm, och skrifter och separera med hjälp av en sond och pincett. Resect strukturen med en skalpell. Anmärkning: Den distala segmentet på ena sidan av synnerven är markerad med Higgins bläck för identifiering.</li>
	<li>Separera hjärnhalvorna longitudinellt och fotografera varje halvklot individuellt.</li>
	<li>Bläck den primära motor Cortex (PMC) för vänster hjärnhalva, re-fotografera den, och placera den i en 3,3 L behållare för lång fixering. Dokumentera starttiden för hjärnfixering.</li>
	<li>PMC för rätt hjärnhalva kan vara Inked eller excised.
	<ol>
<li>Om det är excised, först ta bort täckmeninges.</li>
		<li>Re-fotografera Inked eller censurerade PMC.</li>
		<li>Om PMC är excised, skuren i 6 lika stora sektioner.</li>
		<li>Bläck rostralt aspekten av varje sektion.</li>
		<li>Placera udda numrerade sektioner i PFA-fyllda behållare för kort fixering.</li>
		<li>Snap-Freeze jämnt numrerade sektioner och placera i förseglade fryspåsar i svalare #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Skär höger hjärnhalva Anterior till posteriort i 1 cm tjocka koronala sektioner.
	<ol>
<li>Dokumentera brutto avvikelser (t. ex. skära artefakt, blödning, och lesioner).</li>
		<li>Placera udda numrerade sektioner i behållare fyllda med PFA för kort fixering.</li>
		<li>Snap-Freeze jämnt numrerade sektioner och placera i förseglade fryspåsar.</li>
		<li>Dokumentera slutet av hjärnans fixeringstid.</li>
	</ol></li>
	<li>Separera hjärnstammen från lillhjärnan och placera i en PFA-fylld behållare för kort fixering.
	<ol>
<li>Separata cerebellär halvklot longitudinellt.</li>
		<li>Skär varje hjärnhalva i 4 lika tjocka sagittal sektioner.</li>
		<li>Fotografera mediala och laterala vyer.</li>
		<li>Placera vänster cerebellär halvfäriska skivor i en behållare fylld med PFA för kort fixering.</li>
		<li>Snap-Freeze rätt cerebellär halvfäriska skivor och placera i förseglade fryspåsar i svalare #1.</li>
	</ol></li>
	<li>Få ryggmärgen med nervrötter från Diener.
	<ol>
<li>Ta bort ryggmärgen dura mater och förvara Dura i en behållare med PFA.</li>
		<li>Separera vänster och höger främre och bakre nervrötter. Skär vänster främre och bakre nervrötter skära från ryggmärgen och placera i en PFA fylld behållare för kort fixering.</li>
		<li>Skär rätt främre och bakre nervrötter från ryggmärgen, snap-Freeze, plats i förseglade fryspåsar, och sedan placera i svalare #2.</li>
		<li>Fotografera den caudal-mest 20 cm av ryggmärgen. Dokumentera placeringen av ländryggen utvidgningen.</li>
		<li>Skär 2 cm tvärgående delar av sladden fortsätter från caudal till rostral.</li>
		<li>Bläck den rostralt aspekten av varje snitt sektion.</li>
		<li>Placera udda numrerade sektioner i behållare fyllda med PFA för kort fixering.</li>
		<li>Snap-Freeze jämnt numrerade sektioner, placera i förseglade fryspåsar, och sedan placera i svalare #2.</li>
		<li>Dokumentera starttiden för ryggmärgs fixering och eventuella grova avvikelser.</li>
		<li>Fotografera kvarvarande rostralt del av ryggmärgen.</li>
		<li>Dokumentera positionen för den cervikala utvidgningen. Följ steg 2.13.5 – 2.13.8 för den kvarvarande ryggmärgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Efter bårhuset plats fryst vävnad i märkta lådor i-80 ° c frysar. Förvara fast vävnad vid 4 ° c.</li>
	<li>Vid 24 h efter obduktion (dag 2) späd resterande 8% PFA till 4%.</li>
	<li>Ersätt 4% PFA i fixeringsbehållare med nyspädd 4% PFA.</li>
	<li>Vid 60 h post-obduktion förbereda lösningar av 2,5% glutaraldehyd i 4% PFA från glutaraldehyd, PFA, dH2O och Sorenson buffert (beredd genom blandning i sekvens: 0,2 M fosfatbuffert pH 7,4, polyvinylpyrolidone 1% w/v, sackaros 30% w/v, och etylenglykol 30% v/v).</li>
	<li>Ta bort begagnade 4% PFA från kort fixeringsbehållare.</li>
	<li>Skölj vävnaden i Sorensons buffert och placera den i kryoskyddslösning (glycerol 20%, 0,4 M Sorensons buffert 20% och 0,02% natriumazid i dH2O).</li>
	<li>Fotografera kort fasta hjärn skivor, cerebellum, hjärnstammen och motoriska cortex (om tillämpligt).</li>
	<li>Med en skalpell blad skära 2 mm tjocka tvärgående sektioner från varje 2 cm kort fast ryggmärgen avsnitt.</li>
	<li>Placera sektioner i 2 mL scintillationinjektionsflaskor och fyll med en lösning på 2,5% glutaraldehyd i 4% PFA.</li>
	<li>Returnera den återstående delen till den ursprungliga 20 mL scintillationinjektionsflaskan. Skölj sektion med Sorensons buffert och Ersätt med kryoskyddslösning.</li>
</ol>3. patologi
Anmärkning: Korta fasta skivor av höger hjärnhalva samt den sedan länge fastställda vänstra halvklotet (placerad i 4% PFA i flera månader) skärs antingen i 30 μm sektioner (kallas fritt flytande) eller inbäddade i paraffin och skär som 12 – 14 μm sektioner (kallas paraffin-inbäddade). Dessa avsnitt bearbetas vanligtvis med proteolipid protein (PLP) för att upptäcka demyelinierande lesioner och större histocompatibility complex II (MHC-II) för immun aktivitet med hjälp av Diaminobenzidin (DAB) metod. Dessa protokoll har standardiserats och använts i flera publikationer2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 , elva , 12.
<ol><li>
Fritt flytande (30 μm) DAB-Avidin-biotin Complex (ABC) vävnads färgning
	<ol>
<li>Ta bort sektioner från Cryostorage lösning, överföra sektioner till en sex-bra tallrik, och tvätta dem 3x för 5 min vardera i 2 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning pH 7,0 (PBS). Vid överföring till nästa brunn i sex-well plattan använda försiktighet inte riva vävnaden. Under varje tvätt och inkubering steg, placera sex-brunnen plattan på en shaker och låt vävnaden att försiktigt skaka. Anmärkning: Vävnad sektioner inkuberas i mindre volymer och i större plattor (dvs 12-och 24-bra tallrikar) tenderar att uppvisa yta och kant Riva.</li>
		<li>Utför antigen hämtning genom mikroviftande sektioner i en glasbägare som innehåller ungefär 30 mL 10 mM citratbuffert (pH 6,0). Se till att vävnaderna inte viks genom att manipulera med en pensel och mikrovågsugn sektioner för 2-3 min eller tills citrat buffert kommer börjar koka. Låt sektioner svalna till rumstemperatur (~ 20 min).</li>
		<li>Överför sektioner tillbaka till en sex-bra tallrik och tvätta sektioner 3x för 5 min vardera i 2 mL PBS/0,3% Triton X-100. Blockera endogena peroxiaser genom inkuberande sektioner i 2 mL 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS i 30 min vid rumstemperatur (RT).</li>
		<li>Tvätta sektionerna 3x i 5 min vardera i 2 mL PBS/0,3% Triton X-100. Block sektioner i 2 mL 3% normalt get serum/0,3% Triton X-100/1x PBS för 1 h vid RT.</li>
		<li>Inkubera avsnitten över natten till 5 dagar (beroende på antikroppen) i primära antikroppar riktade mot mikroglia och myelin epitoper för att detektera inflammation (mhcii) och demyelinisering (PLP) (se tabell över material) vid 4 ° c. Anmärkning: Se till att avsnitten inte viks vid inkuberingen i detta steg eller efterföljande steg eftersom detta kommer att leda till områden inom sektionerna som är ogiltiga av fläck.</li>
		<li>Tvätta avsnitten 3x i 5 min vardera i 2 mL 1x PBS. Inkubera sedan avsnitten i sekundära biotinylerade antikroppar (se tabell över material) för 1 h vid RT. Förbered Avidin-biotin Complex (ABC) lösning under inkubering ungefär 45 min före nästa tvättsteg för att tillåta ABC-komplex att bildas.</li>
		<li>Tvätta avsnitten 3x i 5 min vardera i 2 mL 1x PBS. Inkubera sedan avsnitten i ABC för 1 h vid RT.</li>
		<li>Tvätta sektioner i 2 mL 1x PBS tre gånger för 5 min vardera. Inkubera sektioner i filtrerad DAB (2 mL/brunn/sektion) innehållande H2o2 (1:500 spädning av 30% H2o2 i DAB) tills färgen utvecklas tillräckligt (~ 3 – 8 min).</li>
		<li>Tvätta avsnitten 3x i 5 min vardera i 2 mL 1x PBS. För att förbättra signalen (valfritt), osmicate med 0,04% OsO4 (~ 30 s).</li>
		<li>Tvätta sektioner tre gånger för 5 min vardera i 1x PBS. Individuellt, överföra varje sektion från sex-brunnen plattan till en liten behållare full av 1x PBS och placera vävnaden avsnitt på en glasskiva så platt som möjligt.</li>
		<li>Lyft försiktigt ut bilden ur PBS och se till att vävnads sektionen är så platt som möjligt. Använd två målarborstar, platta försiktigt och sträck ut vävnaden på bilden och badda bort överflödigt vatten med pappershandduk. Montera vävnads sektioner med glycerol (eller motsvarande monteringsmedia) och försegla täckslip med genomskinligt nagellack.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. paraffin-inbäddade Halvfäriska sektioner: DAB färgning
<ol><li>Smält paraffin bort bilderna i en 60 ° c ugn för 5 – 10 min.</li>
	<li>De-paraffinize sektioner genom inkuberande i xylen 3x för 5 min vardera.</li>
	<li>Rehydrera vävnad i graderad etanol på 100% (2x för 5 min vardera), 95% (2x för 5 min), 70% (2x för 5 min vardera), och 50% (1x för 5 min vardera). Omslagsbilder i PBS.</li>
	<li>Antigen hämtas med mikrowaving diabilder i en bägare med 10 mM citratbuffert (pH 6,0).</li>
	<li>Tvätta diabilder i 1x PBS (3x för 5 min vardera) en gång svalnat till rumstemperatur. Blockera endogena peroxiaser genom inkuberande vävnad i 3% H2O2/1% Triton-X 100/PBS i 30 min.</li>
	<li>Tvätta vävnad i 1x PBS tre gånger för 5 min vardera. Block vävnad med 6% normalt get serum i PBS för 1 h.</li>
	<li>Inkubera sektioner i primär antikropp (se tabell över material) i PBS vid rumstemperatur (RT) över natten (max 20 h).</li>
	<li>Tvätta avsnitten 3x för 5 min vardera i 1x PBS. Inkubera sedan avsnitten i motsvarande sekundär antikropp (se tabell över material) i PBS för 1 h vid RT.</li>
	<li>Förbered ABC-lösningen ungefär 45 min före nästa tvättsteg under inkubering.</li>
	<li>Tvätta avsnitten 3x i 5 min vardera i 1x PBS och inkubera sedan i ABC för 1 h vid RT.</li>
	<li>Tvätta sektion 3x i 5 min vardera i 1x PBS.</li>
	<li>Inkubera sektioner i filtrerat (0,45 μm filter porstorlek) DAB innehållande H2o2 (1:500 utspädning av 30% h2o2 i DAB) tills färgen utvecklas tillräckligt (~ 3-8 min).</li>
	<li>Tvätta sektioner (3x 5 min) i 1x PBS. För att förbättra signalen, osmicate använda 0,04% osmium grundämnetetroxide (OsO4; cirka 30 s).</li>
	<li>Tvätta sektioner (3x 5min) i 1x PBS.</li>
	<li>Dehydrera vävnad i en graderad serie etanol 50% (1x 5min), 70% (1x 5min), 95% (2x 5min), 100% (2x 5 min), och 100% xylen (1x 5min). Låt xylener avdungra.</li>
	<li>Montera sektioner med toluenbaserade snabbtorkande monteringsmaterial. Formuleringar som innehåller anti-oxidanter rekommenderas för att förhindra fläck blekning. Ta bort överflödigt monteringsmaterial från glid kanterna med en rakkniv för efterföljande lagring.</li>
</ol>5. korrelationer mellan MRI och patologi
Anmärkning: För korrelering MRI med patologi, vi först utföra ex vivo MRT av den långa fasta intakt hjärnhalvan (steg 2,9 ovan) i en justerbar låda med MRI-synliga markörer som indikerar skivning slots. Vi skär sedan hjärnan och fotografera 1 cm skivor för att möjliggöra samtidig registrering av in situ-MRIs till de enskilda hjärn skivorna. Vi kan sedan utföra MRI-styrda analyser, där regioner av intresse (ROIs) identifieras på MRI för att rikta vävnads analys. Vi kan också utföra histopatologiska analyser, där ROIs är identifierade på vävnad (t. ex. vita materia lesioner, vit substans utan demyelinisering, etc.) och sedan kännetecknas av co-lokaliserade MRI-åtgärder (tabell 1).
<ol><li>
Identifiering av MRI-baserade ROIs Obs: i tidigare studier har vi identifierat Rois i vit materia11,12,13,14,15 och grå materia16,17, 18. exemplet nedan är för vit substans analys.<ol>
<li>Segment T2 hyperintensiva lesioner på in situ-MRIs (från steg 1,1), initialt bearbetas av en automatisk algoritm, och sedan korrigeras manuellt av erfarna användare.</li>
		<li>Segmentera T1-hypoinspända lesioner inom T2-lesioner som voxels med en signalintensitet som är mindre än eller lika med 80% av signalintensiteten hos den omgivande normal-framträdande hjärnvävnaden.</li>
		<li>Segmentera hypoinspända områden inom magnetiseringsförhållandet (MTR) kartor med en 80% tröskel.</li>
		<li>Skapa tre klassificeringar med ovanstående segmenteringar: (a) endast T2-lesioner som är onormala på T2-viktade/FLAIR-skanningar men normalt på T1-viktade eller MTR-skanningar, (b) T2T1MTR lesioner som är onormala på alla T2-viktade/FLAIR-, T1-viktade och MTR-skanningar. och (c) normal-visas vit materia (NAWM), som är normala på alla T2-vägd/FLAIR, T1-viktade, och MTR skannar. Anmärkning: Vårt urval av skivor är baserat på förekomsten av alla tre regioner av intresse typer (T2-Only, T2T1MTR och NAWM) på samma segment.</li>
		<li>Beräkna normaliserade intensiteter för varje ROI för att minimera variationer som uppstår från olika hjärnor och olika hjärn platser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Co-registrering av in situ MRI till hjärn skivor
	<ol>
<li>Skanna den fasta hjärnhalvan i en anpassad skivning låda med fyra rader av MRI-känsliga markörer lokalisera spåren där en kniv kan sättas in för att skära hjärnan. Utför en T1-vägd 3D MPRAGE förvärv med 1 mm isotropiskt upplösning som täcker den fasta hjärnan och alla markörer. Anmärkning: Detta kallas efter fixering MRT och används endast som ett mellanliggande steg för samtidig registrering av in situ-MRIs till hjärnan skivor.</li>
		<li>Omedelbart efter skanning, skiva hjärnhalvan i Slots ligger 1 cm isär, vilket resulterar i cirka 15 skivor.</li>
		<li>Fotografera hjärn skivor på både främre och bakre sidor.</li>
		<li>Co-registrera in situ MRI och fotografier av hjärnan skivor med följande steg.<ol>
<li>För segmentering av post-fixering och in situ MPRAGE, pre-process både efter fixering och in situ MPRAGE MRIs för intensitet icke-enhetlighet19.<ol>
<li>Segmentera hjärnan och fyra rader av markörer från förbehandlade efter fixering MPRAGE.</li>
				<li>Segmentet halvklotet som motsvarar efter fixeringen MRI20,21 från förbehandlade i situ mprage.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Co-registrera hjärnan extraherade in situ och efter fixering MRIs genom en rad linjära registreringsprocesser upp till 12 frihetsgrader (affine registrering) med hjälp av FSL FLIRT22. Skalnings-och klippnings komponenterna står för effekten av fixering krympning.</li>
			<li>Leta reda på skiktnings planets normala riktning genom att minimera summan av de maximala projekterade intensiteterna med hjälp av segmenterade markörer. Dessa omriktningsvinklar införlivas i omformnings matrisen som erhålls från föregående steg.</li>
			<li>Visuellt match MRI bilder till fotografier av fasta bakre hjärn skivor med hjälp av en in-House bildvisare som gör det möjligt att ändra djup och orientering av de normala vektorer. Små modifieringar behövs eftersom hjärnan skivning är ofullkomlig.</li>
			<li>Använd AFFINE bild omvandling13 för varje segment för att omvandla in situ-MRIs till samma skivning platser som fotografier av hjärnan skivor.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Trapp, B. D., Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis:+an+immune+or+neurodegenerative+disorder?.">Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder?.</a> Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).</li><li>Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2-positive+oligodendrocyte+progenitor+cells+in+adult+human+brain+and+multiple+sclerosis+lesions.">NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).</li><li>Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premyelinating+oligodendrocytes+in+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+chronic+lesions+of+multiple+sclerosis.">Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis.</a> Brain. 131, 2366-2375 (2008).</li><li>Chang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+remyelination:+A+new+target+for+repair+therapies+in+multiple+sclerosis.">Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+as+a+cause+of+axonal+degeneration+in+multiple+sclerosis+patients.">Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+ciliary+neurotrophic+factor+(CNTF)+signalling+pathway+in+cortical+neurons+of+multiple+sclerosis+patients.">Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 130, 2566-2576 (2007).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+causes+synaptic+alterations+in+hippocampi+from+multiple+sclerosis+patients.">Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients.</a> Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).</li><li>Dutta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+demyelination+and+memory+dysfunction+are+associated+with+increased+levels+of+the+neuronal+microRNA+miR-124+and+reduced+AMPA+receptors.">Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors.</a> Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transection+in+the+lesions+of+multiple+sclerosis.">Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis.</a> New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).</li><li>Trapp, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+neuronal+densities+and+cerebral+white+matter+demyelination+in+multiple+sclerosis:+a+retrospective+study.">Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study.</a> Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).</li><li>Young, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+decreased+axonal+Na+/K++ATPase+in+chronic+multiple+sclerosis+lesions.">Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions.</a> Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).</li><li>Fisher, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+axonal+swelling+in+chronic+multiple+sclerosis+brains.">Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains.</a> Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+correlates+of+leukocyte+accumulation+and+CXCR4/CXCL12+in+multiple+sclerosis.">Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis.</a> Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).</li><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis+normal-appearing+white+matter:+pathology-imaging+correlations.">Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations.</a> Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).</li><li>Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1-/T2-weighted+ratio+differs+in+demyelinated+cortex+in+multiple+sclerosis.">T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis.</a> Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).</li><li>Chen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinically+feasible+MTR+is+sensitive+to+cortical+demyelination+in+MS.">Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS.</a> Neurology. 80, 246-252 (2013).</li><li>Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLADA:+cortical+longitudinal+atrophy+detection+algorithm.">CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm.</a> Neuroimage. 54, 278-289 (2011).</li><li>Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonparametric+method+for+automatic+correction+of+intensity+nonuniformity+in+MRI+data.">A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data.</a> IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).</li><li>Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knowledge-based+3D+segmentation+of+the+brain+in+MR+images+for+quantitative+multiple+sclerosis+lesion+tracking.">Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking.</a> Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. , 19-25 (1997).</li><li>Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symmetric+diffeomorphic+image+registration+with+cross-correlation:+evaluating+automated+labeling+of+elderly+and+neurodegenerative+brain.">Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain.</a> Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).</li><li>Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+optimization+for+the+robust+and+accurate+linear+registration+and+motion+correction+of+brain+images.">Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images.</a> Neuroimage. 17, 825-841 (2002).</li><li>Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+revisited:+opportunities+and+challenges+in+postmortem+studies+of+psychiatric+disorders.">The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders.</a> Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).</li><li>Chomyk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+demyelinated+multiple+sclerosis+hippocampus.">DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus.</a> Scientific Reports. 7, 8696 (2017).</li><li>Huynh, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome-wide+differences+in+pathology-free+regions+of+multiple+sclerosis+brains.">Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains.</a> Nature Neuroscience. , (2014).</li><li>Ishii, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myelin+proteome+and+comparative+analysis+with+mouse+myelin.">Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Vi beskriver ett protokoll som har använts för att snabbt anskaffa och bearbeta vävnad från över 150 personer med MS. Ett viktigt inslag i detta protokoll är att forskarna som utnyttjar vävnaden också ansvarar för att fastställa protokollet och utföra vävnads insamlingen. Detta ger flexibilitet när det gäller att tillgodose enskilda forskningsprojekts vetenskapliga behov. Flera aspekter av detta protokoll förbättra dess användbarhet. Patienterna är oftast väl karaktäriserade före döden, eftersom många av dem har följts av neurologer i vårt centrum. Ett kritiskt steg är bearbetningen av vävnads donationer strax efter döden, vilket ökar kvaliteten på den frusna vävnaden jämfört med vissa andra hjärn banker. Detta möjliggör molekylära studier som är av stort värde i att beskriva förändringar i transkriptionella och translationella genprodukter, som är nödvändiga för belägg för histologiska och immunocytokemiska observationer. Hävstångseffekt av morfologiska/immunocytokemiska och molekylära data över flera fall ökar tillförlitligheten i slutsatserna. Detta illustreras bäst av vår Beskrivning av mitokondriella genförändringar i hjärnbarken och neuronala genförändringar i demyeliniserade hippocampi. Nya gen profilerings protokoll håller på att utvecklas i snabb takt och den frusna vävnaden i vår bank bör tillhandahålla högkvalitativt RNA för vävnad och encellig analys.
En annan uppskattad aspekt av vårt protokoll är den korta fasta hjärn skivor. Dessa vävnader skärs i 30 μm tjocka, fritt flytande sektioner. Dessa sektioner är idealiska för att använda konfokalmikroskopi för att analysera två eller flera antigener i tre dimensioner. Goda exempel är samspelet mellan pre-myelinating oligodendrocyte processer med dystrofiska axoner i kroniska MS lesioner, samt identifiering av enstaka axonala anslutningar till transected axonal indragning lökar. Detta är i motsats till rutinmässig användning av 7 μm-tjocka paraffin sektioner, där 3D-bilder inte är genomförbara. Paraffin-inbäddade vävnader har stort värde för vissa frågor, särskilt kvantifiering av neuronala tätheter i hemisfäriska 7 μm-tjocka sektioner. Våra vävnads bearbetning protokoll är därför olika och ger flexibilitet för att säkerställa fasta och snabbt frysta vävnader.
Ett annat unikt inslag i vårt protokoll är den efter döden in situ hjärnan MRI. Brain MRIs är en oersättlig biomarkör av MS-sjukdom. Det är därför nödvändigt att fastställa de patologiska korrelat av onormala MRI-signaler. I våra studier fastställdes att både T2 och T2T1MTR ROIs ofta är myelinerade. Detta konstaterande stöder behovet av mer specifika avbildning modaliteter som tillförlitligt skilja mellan myelinerad och demyeliniserad cerebral vit materia. MRT verkar vara känslig för detektion av myelin, men våra studier visar att även en kombination av T1/T2/MTR är inte specifikt för att identifiera myelinisering. Vår efter döden protokoll ger en idealisk plattform för att testa möjligheten för nya Imaging modaliteter att skilja mellan myeliniserade och demyeliniserad cerebral vit materia. MRI ger också det ideala medlet för översättning av grundläggande vetenskapliga resultat till klinisk praxis, med tanke på användning av MRI i vår translationella forskning och dess utbredda kliniska användning hos levande patienter.
Medan skära korta och långa fasta samt frysta skivor erbjuder en fördel för bearbetning av vävnad i flera lägen för olika studier, det finns vissa begränsningar med denna metod. Att utvärdera helheten av en struktur kan vara begränsad eftersom delar av den kan bearbetas på olika sätt på intilliggande segment. Den stora volymen av vävnadsbanken, dock erbjuder möjligheten att undersöka en struktur av intresse för flera ämnen för att förbättra provtagning. En annan generell begränsning till studier som använder efter döden-vävnader är att de är tvärsnitts. I detta sammanhang måste man tolka slutsatserna om tidpunkten för och utvecklingen av förändringarna. Det kan finnas ett urval bias till patienter som donera sina vävnader, som kan begränsa generalisering av data till alla patienter med MS. Eftersom de flesta givare dör av komplikationer av avancerade MS, det kanske inte är lämpligt att extraräkna fynd från dessa patienter till de i tidigare stadier av MS. Icke desto mindre, vi har fått vävnader från yngre patienter som dog av icke-MS-relaterade villkor (dvs., akut hjärtinfarkt, överdos, självmord). Omfattningen av vårt protokoll omfattar inte provtagning av andra organ (t. ex. gastrointestinal och benmärg) som har varit inblandade i MS. Vi anser att styrkan i programmet kraftigt uppväger dess begränsningar.

Ett av de bästa sätten att studera en sjukdom är att undersöka den sjuka vävnaden själv. Detta innebär utmaningar för dem som studerar sjukdomar i centralanervsystemet (CNS). Biopsier av sjuka hjärnan och ryggmärgen är extremt sällsynta och vanligtvis innebär atypiska fall. Obduktion priser för personer med CNS-sjukdomar har minskat dramatiskt under de senaste åren, och när de utförs, de ofta inte ger snabb upphandling av vävnader. Dessa utmaningar har resulterat i inrättandet av sjukdomscentrerad hjärn banker, inklusive flera fokuserade på att samla vävnader från individer med multipel skleros (MS). MS är en inflammatorisk-medierad sjukdom i CNS som förstör myelin, oligodendrocyter (myelin bildar celler), nervceller, och axoner. Majoriteten av MS-patienter har en bi-fasisk sjukdom kurs som börjar med anfall av neurologiska funktionshinder med varierande återhämtning som så småningom utvecklas till en gradvis progressiv sjukdom som sannolikt neurodegenerativa i naturen1. För majoriteten av donerade MS hjärnor, efter döden intervall (PMI) mellan död och vävnads behandling överstiga 24 h. Även om dessa vävnader har gett värdefull information om patologiska förändringar i MS hjärnor, de är inte lämpade för mer avancerade molekylära studier som kan ge kraftfulla insikter i sjukdomens patofysiologi. Detta gäller särskilt gen profilerings studier, som kräver intakt RNA.
För att övervinna de begränsningar som diskuterats ovan, har vi utvecklat en snabb vävnadsdonation program som möjliggör MRI/patologiska korrelationer. Detta protokoll ger välbevarade vävnader som lämpar sig för moderna molekylära studier och möjliggör direkt jämförelse av hjärnans patologi och MRI-avvikelser i MS Brains. The Cleveland Clinic multipel skleros vävnads donation program har funnits i över 20 år. Detta snabb vävnadsdonation program anskaffas hjärnor och ryggmärg från individer med MS och andra associerade autoimmuna neurologiska tillstånd. Programmet syftar till att få in situ-MRIs inom 6 h dödsfall, följt av avlägsnande av hjärna och ryggmärg för vävnads behandling.
Rekrytering Donationer erhålls genom antingen före slakt samtycke som erhållits direkt från patienter (församtyckt) eller från anhöriga efter döden. Pre-samtyckt patienter identifieras vanligtvis från den kliniska populationen vid mellen Center för multipel skleros behandling och forskning i Cleveland, Ohio. Även om preferens i rekrytering i Rapid vävnadsdonation programmet ges till patienter som har följts i longitudinella forskningsstudier, är det öppet för alla patienter som ses i centrum. Deltagare som anmäler sig före döden ges instruktioner till familjemedlemmar eller vårdgivare att kontakta forskargruppen, antingen vid tidpunkten för dödsfallet eller när döden tros vara nära förestående. Den andra metoden för individer att komma in i vävnadsdonation programmet är vid tidpunkten för döden genom samtycke av närstående. Delstaten Ohio kräver dödsfall som skall hänvisas till en federally-bemyndigade organ upphandling organisation som heter LifeBanc, som verkar i 20 län i nordöstra Ohio. LifeBanc skärmar alla dödsfall för en diagnos av MS, vilket är ett undantag för organdonation. Arrangemang gjordes för LifeBanc att anmäla utredare från MS vävnadsdonation program för alla dödsfall med en associerad diagnos av MS inträffar inom en 75 mil radie från Cleveland Clinic. Nästa av anhöriga och sjukhuspersonal sedan kontaktas av vävnads donation program personal och samtycke erhålls för donation av hjärna och ryggmärg vävnader. Dessa två metoder för rekrytering före slakt och obduktion genom LifeBanc resultera i cirka 10-12 hjärn donationer per år. Justeringar görs till den övre åldersgränsen för döden för att hantera antalet remisser som härrör från LifeBanc.
Anskaffning av donationer Programmet kräver 24 h täckning, 365 dagar om året av medlemmar i vävnadsdonation program för vävnads upphandling. En centraliserad vävnadsdonation anmälan e-post/personsökare/mobil enhet text anmälan system används av den kliniska team som omfattar vävnads donationer. LifeBanc tillhandahålls nummer för att kontakta jourpersonal för vävnadsdonation programmet. Medlemmar meddelas om dödsfall av sjukhus leverantörer/anhöriga (församtyckt) eller av LifeBanc och andra remiss källor. För det första görs en bestämning av tidpunkten för dödsfallet och genomförbarheten för vävnadsdonation. Dödsfall screenas sedan för tillstånd som potentiellt kan resultera i dålig kvalitet vävnad, inklusive långvarig före slakt hypoxi, massiv destruktiv hjärnvävnad (t. ex. stora intrakraniell blödning, omfattande bi-hemisfäriska stroke, omfattande tumör förlängd ventilatorstöd (> 3 dagar), och långvarig användning av vasoaktiva medel (> 3 dagar) före döden. När en medicinsk examinator är inblandad i en död, kan studien neurolog tala med den medicinska examinator för att utforska ett sätt att få rätt tid vävnader utan att äventyra den medicinska granskarens ansvar. Om bärkraftig vävnad upplevs vara närvarande erhålls skriftligt medgivande (om det inte erhållits före slakt) och förberedelser görs för kropps transport. En tidigare kontrakterad avlidnes transporttjänst kontaktas sedan för transport till MRI-anläggningarna på Cleveland Clinic. Försiktighet iakttas för att säkerställa att kroppen förblir vid rumstemperatur och inte placeras i kylning, eftersom lägre kropps temperaturer är förknippade med förändringar i MRI signal egenskaper.
Klinisk historia Klinisk historia innehåller uppgifter om diagnos av MS, symtomdebut, behandlingar som används, resultat av kliniska och para-kliniska tester (framkallade potentialer, cerebrospinalvätska resultat, optisk koherens tomografi), multipel skleros funktionell komposit , och utökad status skala för funktionshinder (EDSS; faktisk eller beräknad), som samlas in från läkarundersökningen (om sådan finns), och direkt intervju med närstående. Före slakt MRT samlas också in.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9200</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336171</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000</td>
			<td>1:500 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated goat anti-rat IgG</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-9400</td>
			<td>1:500 dilution for hemispheric; 1:1000 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2336208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial fibrillary acid protein (GFAP)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1:700 dilution for hemispheric. 
			RRID: AB_10013382</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuR, mouse IgG, 3A2 clone</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5261</td>
			<td>1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_627770</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Mo746</td>
			<td>1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30&#181;m free floating. 
			RRID: AB_2313661</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-phosphorylated neurofilament (SMI32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801701</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564642</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorylated neurofilament (SMI31)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>801601</td>
			<td>1:5000 dilution for hemispheric; 1:2500 for 30&#181;m free-floating. 
			RRID: AB_2564641</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteolipid protein (PLP)</td>
			<td>Gift from Wendy Macklin</td>
			<td></td>
			<td>1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mm filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1452-125</td>
			<td>For filtering PFA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td>Electron microscopy grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>8310-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td>400mL/2L Cryoprotection solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SLHV033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19200</td>
			<td>Prills form.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrolidone (PVP-40)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>BP220-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S227I</td>
			<td>2g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0876</td>
			<td>98.8g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate mono basic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>14.352g/2L Sorenson&#39;s buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaStain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>1:1000 dilution of A and B. 
			RRID: AB_2336819</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterproof drawing black ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>44201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X3S</td>
			<td>Histological grade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3T MRI Magnetom Prisma</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7T MRI Agilent 830AS</td>
			<td>Siemens Healthineers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive autopsy program for individuals with multiple sclerosis

Vi beskriver en snabb vävnadsdonation program för personer med multipel skleros (MS) som kräver forskare och tekniker för att vara på-Call 24/7, 365 dagar om året. Deltagarna samtycker till att donera sin hjärna och ryggmärg. De flesta patienter följdes av neurologer vid Cleveland Clinic mellen Center for MS Treatment och Research. Deras kliniska kurser och neurologiska funktionsnedsättningar är väl karakteriserade. Strax efter döden transporteras kroppen till MS Imaging Center, där hjärnan skannas in situ av 3 T magnetisk resonanstomografi (MRI). Kroppen överförs sedan till obduktions rummet, där hjärnan och ryggmärgen avlägsnas. Hjärnan är uppdelad i två halvklot. En halvklot placeras omedelbart i en skivning låda och alternativa 1 cm tjocka skivor är antingen fast i 4% PARAFORMALDEHYD i två dagar eller snabbt frysta i torris och 2-metylbutan. De kort fasta hjärn skivorna lagras i en kryopreservlösning och används för histologiska analyser och immunocytokemisk detektion av känsliga antigener. Frysta skivor lagras vid-80 ° c och används för molekylär, immunocytokemisk, och in situ hybridisering/RNA scope studier. Den andra halvklotet är placerad i 4% PARAFORMALDEHYD i flera månader, placeras i skivning rutan, åter skannas i 3 T magnetisk resonans (MR) scanner och skivade i centimeter tjocka skivor. Postmortem in situ MR images (MRIs) är co-registrerade med 1 cm tjocka hjärn skivor för att underlätta MRI-patologi korrelationer. Alla hjärn skivor är fotograferade och hjärn-vit-materia lesioner identifieras. Ryggmärgen skärs i 2 cm segment. Alternativa segment är fast i 4% PARAFORMALDEHYD eller snabbt frysta. Den snabba upphandlingen av obduktion MS vävnader möjliggör patologiska och molekylära analyser av MS hjärnor och ryggmärg och patologiska korrelationer av hjärnan MRI avvikelser. Kvaliteten på dessa snabbt bearbetade efter döden vävnader (vanligtvis inom 6 h dödsfall) är av stort värde för MS forskning och har resulterat i många hög effekt upptäckter.

Som nämnts ovan, nästan hälften av hjärnhalvan är fryst och tillgänglig för molekylära studier med DNA, RNA, eller protein. Historiskt, studier med efter döden hjärnvävnader har visat sig påverkas av före slakt villkor, ålder, kön, vävnad pH, mRNA integritet (RIN), post mortem intervall (PMI), diagnostisk säkerhet, comorbidsubstance användning, och tidigare medicinering behandling status23. Baserat på studier med hjärnvävnad verkar DNA och protein påverkas av mindre utsträckning jämfört med RNA. Baserat på vår erfarenhet, RNA-isolering och nedströms analys har dock visat sig vara mest drabbade av före slakt villkor och efter döden intervall av hjärnvävnaden. Vi diskuterar därför några av de villkor som ska följas för att utföra RNA-baserad analys med hjälp av efter döden MS vävnader.
För alla våra studier, efter att hjärnan samlas vid obduktion, är det skivade (1 cm tjock) och sedan antingen fast i 4% PARAFORMALDEHYD för morfologiska studier eller snabbt frysta för biokemisk analys. Alla vävnads block kännetecknas för demyelinisering genom immunofärgning med PLP enligt beskrivningen ovan. Ett representativt analys schema visas i figur 1. Vävnads sektioner undersöks med avseende på förekomst av vita substans lesioner (figur 1a). Utvalda regioner färgas för immun aktivitet (figur 1b) och demyelinisering (figur 1c). Den frusna vävnaden är monterad på kryostaten (figur 1d) och frysta 30 μm snitt skärs. Detta följs av insamling av 3-4 efterföljande avsnitt, separation från angränsande vävnader, och lagring för DNA, RNA, eller protein isolering. Med hjälp av detta protokoll har vi lyckats isoleraDNA 24,25, RNA5,6,7,8,9 och proteiner26. Medan stora fynd från några av de studier som analyserar RNA från MS Brains diskuteras, här är några av de frågor som rör analys av RNA efter döden MS hjärnor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig1.jpg"> Figur 1: provinsamling för mRNA-analys. (A) obduktions vävnad väljs för analys. Områden av vävnad väljs och en del av vävnaden är excised. Alla sektioner färgas med (B) MHC-II (större histocompatibility complex (MHC) klass II HLA-Dr Cr3/43) antikropp för att detektera inflammatorisk aktivitet och med (C) proteolipid protein (PLP) för att bestämma myelin status med hjälp av publicerade protokoll. Baserat på myelin-status görs blocket med en skalpell (D). Sektioner (60 μm) skärs (E) och de områden som tidigare har poängsätts avlägsnas, separeras i rör och märkta (F). PLP och MHC-II fläckar upprepas efter varje 5 sektioner för att säkerställa korrekt insamling av vävnad. Normal uppträder vit materia (NAWM) noteras och vita materia lesioner (WML) beskrivs i rött. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Axonal transektion i lesioner av MS10. En inledande vetenskaplig fokus på detta program var på karakterisering av cellulära komponenter av demyeliniserade vita partiklar lesioner. Bland de antigener lokaliserade var icke-fosforylerade neurofilaments (NFs). De flesta NFs är fosforylerade i myeliniserade axoner. Vid demyelinisering är axoner defosforylerade. Vi upptäckte det förväntade uttrycket av icke-fosforylerad NFs i demyeliniserade axoner. Vid akuta MS-lesioner, slutade många av dessa demyeliniserade axoner som axonala indragning lökar (figur 2A), som återspeglar de proximala ändarna av transected axoner. Transected axoner överstiger 11 000 mm3 i de akuta lesioner jämfört med angränsande normala regioner10. Dessa observationer bidrog till att katalysera ett paradigmskifte i MS Research som flyttade fältet mot att karakterisera neurodegeneration som den främsta orsaken till permanenta neurologiska funktionshinder hos individer med MS.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig2.jpg"> Figur 2: axonal transektion vid inflammatorisk demyelinisering. Axonal transektion inträffar under inflammatorisk demyelinisering (a, pilspetsar) och inducerar bildandet av terminala axonala ovoider (a, pilar). Vid kvantifierade (B) är transected axoner rikligt förekommande i MS-lesioner och förefaller korrelera med den inflammatoriska aktiviteten i lesionen. Panel A Reproducerad från Trapp et al.10 med tillstånd. Röd: proteolipid protein, grön: anti nonfosforylerad neurofilament. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Remyelinisering i kronisk MS Brains3. Remyelinisering kan vara robust under tidiga stadier av MS. Många kroniska MS-lesioner är dock inte remyeliniserade. Vi undersökte om närvaron av oligodendrocyte progenitorceller (OPCs) eller generering av nya oligodendrocyter begränsar remyelinisering av kroniskt demyeliniserade vita partiklar lesioner. Medan OPC densitet var ofta minskade, de var närvarande i alla kroniskt-demyeliniserade lesioner3. Nyligen genererade oligodendrocyter var också närvarande i många kroniska MS lesioner. Oligodendrocyte processer i samband med, men inte myelinate demyeliniserade axoner (figur 3). Dessa studier visar att OPCs och deras förmåga att producera nya oligodendrocyter inte begränsar remyelinisering av kroniska vita substans lesioner. Vi hypotesen att de kroniskt-demyeliniserade axonerna, som ofta verkade dystrofiska, inte var mottagliga för remyelinisering av nyproducerade oligodendrocyter.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig3.jpg"> Figur 3: processer för för myelinerande oligodendrocyter associerade med axoner. Konfokala mikrografer av MS-lesioner färgade med PLP-antikroppar (röda i paneler a, b) och Neurofilamentavvikelser-antikroppar (gröna i paneler a, b) visas. En pre-myelinating oligodendrocyte (röd i panel A) i subventrikulär zon (SVZ) utökade processer i regionen demyeliniserade axoner (grön i panel A) i en kronisk MS lesion. Många av dessa processer (pilar i panel A) spiral runt axoner, som visas vid högre förstoring (panel B). Skalstreck representerar 20 μm (A) och 5 μm (B). Återges från Chang et al.3 med tillstånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Mitokondriell dysfunktion i MS6. Vi utförde en opartisk sökning efter neuronala genförändringar i snabbt frysta motoriska cortex erhållits från kroniska MS-patienter (figur 4a). En opartisk sökning av denna datamängd identifierade signifikanta minskningar av 23 nukleär kodade mitokondriella mRNA i MS (figur 4b). Credentialing studier med immunocytokemi och in situ hybridisering indikerade att dessa gener var mycket berikade i kortikala projektion nervceller (figur 4c) och att mitokonskerna isolerade från projektion axoner Visa minskad glykolys ( Figur 4D). Detta papper katalyseras ett fokus på mitokondriell dysfunktion och minskad ATP produktion som en viktig bidragande orsak till axonal degeneration i MS.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig4.jpg"> Figur 4: Mikromatrisdata och efterföljande validerings tekniker som utförs i MS motor cortex. (A) hierarkisk klustring av avsevärt förändrade utskrifter från kontroll (C1-C6) och SPMS (MS1-MS6) motor cortex prover, separat stödja sjukdomsrelaterade gen uttrycksmönster. Bland de minskade transkriptioner i MS motor cortex tillhörde tjugosex elektrontransportkedjan (B). Mitokondriell komplex I (NDUFA6) mRNA minskade i nervceller (n = 55-130) i MS motor Cortex (CII) jämfört med kontroll (CI), medan PLP mRNA densiteter var likartade mellan kontroll (CIII) och MS (CIV) hjärnbarken. Aktiviteten hos elektrontransport komplexen I och III minskade i mitokondriella-anrikade fraktioner från motoriska cortex av MS-patienter (n = 3) (D). Omtryckt från Dutta et al.6 med tillstånd. Felstaplar representerar SEM; Scale bar i CI-IV är 25 μm. * p < 0,05 Students t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Patogenesen för kognitiv dysfunktion i MS8. 40 till 60% av MS-patienter har kognitiv försämring och minskad verkställande funktion. Vi identifierade Hippocampus, som är en funktionell plats för minne/lärande, som en gemensam plats för demyelinisering i MS. Vi nästa jämförde neuronala genuttryck i myeliniserade och demyeliniserade hippocampi och fann betydande minskningar i neuronala mrnas kodning proteiner inblandade i minne/lärande. Vi utvidgade dessa data genom att visa att Select microRNAs ökas i demyeliniserad hippocampus och att dessa mikroRNAs kan minska uttrycket av glutamatreceptorer. Vi har reproducerat och utökat dessa observationer i gnagare modeller. Vi nästa jämförde neuronala genuttryck i myeliniserade och demyeliniserade hippocampi och fann betydande minskningar i neuronala mRNA kodning proteiner inblandade i minne/inlärning.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig5.jpg"> Figur 5: vävnads insamling, histologisk analys och gen uttrycks studier i MS hippocampus. Hjärn skivor som innehåller Hippocampus väljs under obduktion (A) och hippocampus och angränsande regionen avlägsnas (röd ruta) för vidare analys. Immunofärgning för PLP visade konservering av myelin i all kontroll (B) och 40% av MS hippocampi (C). Omfattande demyelinisering upptäcktes i ~ 60% av MS hippocampi (D). Jämfört med kontroll hippocampi (E, G, I), signifikant NEURONALA förlust upptäcktes inte i CA1, CA3, eller CA4 regioner av demyeliniserade MS hippocampi (F, H, J) som visas av hur immunohistokemi. Dubbel-märkning immunofluorescens för myelin (myelin Basic protein (MBP), grön) och axoner (SMI32, röd) visade förlust av myelin (L) med relativ bevarande av axoner (N) i MS demyeliniserad Hippocampus jämfört med kontroll Hippocampus ( MBP, K; SMI32, M). Dual Clustering av mRNA uttryck nivåer arrangerade prover i diskreta kluster baserat på myelin status (myelinated och demyeliniserade) och plats (Hippocampus vs. motoriska cortex) (O). Höga mRNA-nivåer indikeras med rött och blått betecknar låga uttrycks nivåer. Paneler C-O anpassade från Dutta et al.8 med tillstånd. B-D: 2 mm, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig5large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Patologiska korrelater av MRI förändringar12. Medan MRT är en uppskattad indikator på MS diagnos och svar på behandling, och är också en prediktor för MS sjukdomsprogression, den patologiska korrelat av MRI förändringar är dåligt förstådd. Våra Mr-studier efter döden har fokuserat på två MRI-ROIs. Cerebral White-Matter Rois som endast var T2 hyperintensiva (endast T2) och Rois som hade en kombination av T1 hypointensity, T2 hyperintensitet, och minskad magnetisering överföring ratio (MTR) (T2T1MTR). Cirka 45% av cerebral vit-materia T2-endast ROIs var myelinated, bekräftar deras icke-specifik natur. Däremot var 83% av T2T1MTR ROIs kroniskt demyeliniserade och verkade som svarta hål. T1-och MTR-värden är semikvantitativa och deras värden varierade mycket i T2T1MTR ROIs. Om förlust av myelin är den enda bidragsgivaren till dessa MRI förändringar, då värdena bör vara konstant. Svullna demyeliniserade axoner korrelerade med både T1-och MTR-värden.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig6.jpg"> Figur 6: överföring av Magnetiseringsförhållanden (MTR) och T1-kontrastförhållanden linjärt korrelerar med andelen na+/K+ ATPas-positiva AXONER i kroniska MS-lesioner. Kroniskt-demyeliniserade lesioner färgade för na+/K+ ATPas (grön) varierade från nästan 100% (a) till noll (B) i Neurofilamentavvikelser (röd). Många axoner utan na+/K+ ATPas hade ökade diametrar (B). En jämförelse av andelen na+/k+ ATPas-positiva axoner i kroniskt demyeliniserade MS-lesioner korrelerade med kvantitativ efter döden MTR (p < 0,0001, C) och T1-kontrast förhållanden (p < 0,0006, D). Varje datapunkt är från en enda lesion och varje unik färg-symbol kombination betecknar en av de hjärnor studeras. Skalor staplar = 5 μm. återges från Young et al.12 med tillstånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Neurodegeneration oberoende av demyelinisering11. Historiskt har neurodegeneration i MS tros bero på demyelinisering. Hjärnavbildning studier, emellertid, har höjt möjligheten att neurodegeneration och demyelinisering kan vara oberoende händelser. Vi identifierade nyligen en subpopulation av MS-patienter som har demyelinisering av ryggmärgen och hjärnbarken, men inte av den cerebrala vita substansen. Vi myntade denna MS subtyp som myelocortical MS (MCMS). MCMS fall som en plattform för att undersöka sambandet mellan cerebral vit-materia demyelinisering och kortikala neuronala förlust. Jämfört med kontroll cortices, kortikal neuronala förlust var signifikant större i MCMS cortices än i typiska MS cortices. Kontroll hjärnvävnad erhölls från patologi avdelningen vid Cleveland Clinic. Denna studie ger de första patologiska bevisen för neurodegeneration i avsaknad av demyelinisering.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59511/59511fig7.jpg"> Figur 7: neuronal förlust i avsaknad av cerebral vit-materia demyelinisering. En cresyl violett-färgade koronala halvfäriska avsnitt från en individ klassificeras som har typiska MS (a). Neuronala tätheter jämfördes i kortikala skikt III, V och VI i vart och ett av de fem märkta områdena. Neuroner med en yta större än 60 μm2 (gul) visas i en representativ bild från den överlägsna temporala Cortex (B). Märkning för PLP och distribution av demyeliniserade lesioner (vit-materia demultiptionering är markerad i blått; subpial demyelinisering är markerad i rosa) i hemisfäriska sektioner från individer med typiska MS (C) och myelocortical MS (D ) visas. En signifikant korrelation mellan minskad kortikal neuronala densitet och ökad cerebral vit substans lesion volym hittades i typiska MS, men inte i myelocortical MS (E); streckade linjer indikerar 95% konfidensintervall (CI). IFG = sämre frontal gyrus. STG = överlägsen tidsmässiga gyrus. INi = sämre Insula. INs = överlägsen Insula. CG = cingulum gyrus. Reproduceras från Trapp et al.11 med tillstånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59511/59511fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sekvens varaktighet</td>
			<td>Sekvens Beskrivning</td>
			<td>Sekvens användning</td>
		</tr>
<tr>
<td>0:09</td>
			<td>Localizer</td>
			<td>Lokalisering för efterföljande sekvenser</td>
		</tr>
<tr>
<td>9:14</td>
			<td>3D magnetization beredd snabb gradient ECHO (MPRAGE)</td>
			<td>Strukturell avbildning volymetrisk uppskattning av hjärnstrukturer</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:14</td>
			<td>3D vätska försvagad inversion återhämtning (FLAIR)</td>
			<td>Lesion identifiering lesion segmentering volymetrisk lesion bedömning</td>
		</tr>
<tr>
<td>2:35</td>
			<td>2D T2-viktad</td>
			<td>Lesion identifiering lesion segmentering volymetrisk lesion bedömning</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:12</td>
			<td>3D gradient-återkallade ECHO med magnetisering överföring pre-Pulse, (MT-ON)</td>
			<td>Påstådda måttet på myelin-halten i normal och lesionell vävnad</td>
		</tr>
<tr>
<td>5:12</td>
			<td>3D gradient-återkallade ECHO utan magnetisering överföring pre-Pulse, (MT-OFF)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0:27</td>
			<td>Fältmappning för diffusion tensor imaging (DTI)</td>
			<td rowspan="3">Mått på vatten diffusion i hjärnvävnad tros återspegla hjärnans vävnad integritet.</td>
		</tr>
<tr>
<td>10:27</td>
			<td>Diffusion tensor imaging (DTI) Multi-Shell</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:18</td>
			<td>Diffusion tensor imaging (DTI) Multi-Shell</td>
		</tr>
<tr>
<td>39:48:00</td>
			<td>DELSUMMA: KÄRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: protokoll för Postmortem-avbildning.

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis at JoVE.com

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Multipel skleros är en inflammatorisk demyelinierande sjukdom utan botemedel. Analys av hjärnvävnad ger viktiga ledtrådar till att förstå patogenesen av sjukdomen. Här diskuterar vi metoden och nedströms analys av MS hjärnvävnad samlats in genom en unik Rapid obduktions program i drift på Cleveland Clinic.

Omfattande Obduktions program för individer med multipel skleros

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Målet med vår forskning är att studera patogenesen vid Multipel skleros. För att uppnå detta mål har vi etablerat ett snabbt obduktionsprogram för att erhålla och för att studera hjärnorna från individer med MS. Det finns två speciella aspekter av vårt obduktionsprogram, det första är att det är snabbt. Vi samlar hjärnans under sex till åtta timmars död.Detta möjliggör toppmoderna molekylära studier. Den andra aspekten är att vi gör en in situ MRI innan vi flyttar hjärnan. Detta gör det möjligt för oss att korrelera patologiska förändringar med hjärnans avbildning förändringar.Visuell demonstration gör att tittarna kan förstå hur vi organiserar vårt utrymme och tid för att uppnå optimala resultat. Vävnadsbearbetning som sker snabbt och noggrant möjliggör RNA-analys, immunfärgning, immunoblotting och MR-korrelationer. Nya forskare kan kämpa med bearbetning av vävnader med dålig vävnad integritet.Undvika långa post mortem fixeringstider är viktigt och MRI vävnad sladdtrissationer kan vara utmanande så samråd med MRI analys experter kan vara mycket användbart. Visar förfarandet kommer att Emilie Christie och Christina Volsko. Tekniker från vårt labb.Efter In situ magnetisk resonanstomografi, väg och fotografera hjärnan och placera någon bifogad dura i en behållare med 4%Paraformaldehyde eller PFA. Separera lillhjärnan och hjärnstammen från storhjärnan och fotografera storhjärnan. Använd en sond för att separera synnerverna, chiasm och skrifter och resect strukturen med en skalpell.Separera de cerebrala halvkloten longitudinellt och fotografera varje halvklot individuellt. Bläck den primära motor cortex eller PMC för den vänstra hjärnhalvan, rephotograph vävnaden och placera vävnaden i en 3,3 liters behållare för lång fixering. Till punktskatt PMC för den högra hjärnhalvan ta bort den täckande hjärnhinnorna och rephotograph vävnaden.Nästa resect PMC med hjälp av en skalpell. Fotografera sedan den resected PMC bredvid halvklotet. Skär PMC i sex lika stora sektioner och bläck rostral aspekten av varje avsnitt.Placera sedan varannan sektion i PFA fyllda behållare för kort fixering. Och snap frysa de återstående sektionerna för förvaring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer ett. Skär den högra hjärnhalvan främre till posterior i en centimeter tjocka koronasektioner.Fix varannan sektion i PFA och snap frysa de återstående sektionerna för förvaring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer ett. Separera hjärnstammen från lillhjärnan och placera hjärnstammen i en PFA fylld behållare för kort fixering. Skär varje cerebellar halvklotet i fyra lika fasta sagittal sektioner och fotografera mediala och laterala vyer.Placera sedan vänster cerebellar halvklotformade skivor i en behållare med PFA för kort fixering. Och snap frysa rätt cerebellar halvklotformade skivor för lagring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer ett. Efter att ha erhållit ryggmärgen med nervrötterna ta bort ryggmärgen dura mater och lagra dura i PFA.Separera vänster och höger främre och bakre nervrötter och skär vänster främre och bakre nervrötter från ryggmärgen för kort fixering i PFA. Skär rätt främre och bakre nervrötter från ryggmärgen och snap frysa dessa vävnader för förvaring i förseglade fryspåsar, i svalare nummer två. Fotografera sedan den caudal-mest 20 centimeter av ryggmärgen och skär två centimeter överföring sektioner från caudal till rostral riktning av sladden för PFA kort fixering och snäpp frysning.Fotografera sedan den återstående rostrala delen av ryggmärgen. Och skär två centimeter överföring sektioner från caudal till rostral riktning av sladden för PFA kort fixering och snäpp frysning. Skär avsnitt av intresse från den korta eller långa fasta vävnader.Placera sektionerna i enskilda brunnar av en sex brunnsplatta och tvätta vävnaderna med tre fem minuters tvättar i två milliliter färsk PBS per tvätt, med skakningar. För antigen hämtning, mikrovågsugn sektionerna för två till tre minuter i en glasbägare som innehåller ungefär 30 milliliter av 10 millimollar citrat buffert. När sektionerna har svalnat till rumstemperatur överföra proverna till en ny sex brunnsplatta för tre fem minuters tvättar och två milliliter PBS, plus 0,3%Triton X-100 per brunn, per tvätt.Följt av endogen peroxidas blockering i två milliliter av 3%väteperoxid plus 0,3%Triton X-100 i PBS i 30 minuter, vid rumstemperatur. Vid slutet av inkubationen tvättar du sektionerna tre gånger i två milliliter PBS plus Triton X-100 per tvätt, som visats. Följt av blockering i två milliliter av 3%normal get serum och PBS plus Triton X-100 i en timme vid rumstemperatur.Därefter inkubera sektionerna från natten till fem dagar i de primära antikropparna av intresse vid fyra grader celsius följt av tre fem minuters tvättar i två milliliter PBS per tvätt. Inkubera sektionerna i avidin-biotin komplex lösning eller ABC-komplex i en timme, vid rumstemperatur. Följ upp detta med tre fem minuters tvättar i PBS.Märk sektionerna med två milliliter av filtrerat Diaminobenzidin kompletterat med väteperoxid per brunn i tre till åtta minuter. När färgen har utvecklats på ett tillfredsställande sätt, tvätta sektionerna tre gånger i PBS och individuellt överföra varje sektion till en PBS fylld behållare. Placera varje sektion plant, under enskilda vävnadsglas.Och lyft försiktigt varje bild ur PBS, hålla sektionerna så platt som möjligt. Använd två penslar för att försiktigt platta ut och sträcka ut varje vävnad. Och använd en pappershandduk för att badda bort överflödigt vatten.Montera sedan sektionerna med ett lämpligt monteringsmedium och täta varje täcksli med klart nagellack. Vävnadssektioner undersöks för förekomsten av white matter-lesioner och de valda regionerna färgas för immunaktivitet och demyelination. I akut Flera Sceloris skador många av dessa demyelinated axons fungera som axonal upprullning lökar som återspeglar de proximala ändarna av transected axons.Tätheten av transected axoner i akut organskador överstiger 11000 per kubikmillimeter i aktiva skador jämfört med bara 15 i angränsande icke-lesional white matter regioner. Nyligen genererade oligodendrocytes är också närvarande i många kroniska MS skador. Dessa processer associerar med men inte myelinate demyelinated axoner.En representativ, opartisk sökning efter neuronala genförändringar i snabbt frysta motor cortext erhållits från kroniska MS patienter, identifierat betydande minskningar i 23 nukleära och kodade mitokondriellt budbärare RNA: s Credentialing studier med hjälp av immuncytokemi och i situ hybridisering anges att dessa gener var högt berikade i kortikala projektion nervceller och att mitokondrier isolerade från projektion axons minskad display nedsatt display display nedsatt display. Jämförelse av neuronode genen uttryck i myelinated och demyelinated hippocampi avslöjar minskningar i neuronal budbärare RNA: s inklusive proteiner som deltar i minne och lärande. Vidare, jämfört med kontroll cortices, när neuronal förlust är betydligt större i en sub population av MS patienter som har demyelination av ryggmärgen och hjärnbarken men inte av cerebral white frågan.Under vävnadsbearbetning, se till att när koronasektionerna skärs de skärs konsekvent med avseende på tjocklek och orientering. Och att de ligger platt när de flyter i ett fixativt eller när de är frusna. Förutom den immunhistokemiska analysen ger den frusna vävnadssamlingen oss möjlighet att genomföra genetisk och proteomisk analys.Dessa tekniker har hjälpt i identifiering av en ny kohort av MS patienter med cerebral white fråga skador på MRI men utan någon betydande vit fråga demyelination. Benämnd Myelokortisk MS.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Använda Theta-Burst protokollet Utforska Mechasnism av plasticitet hos personer med Fragile X-syndrom och autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatiserad Sholl Analys av digitaliserade Neuronal Morfologi på flera skalor

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Flera-mus neuroanatomiska Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

A Comprehensive Protocol for Manual Segmentation of the Medial Temporal Lobe Structures

En omfattande protokoll för manuell segmentering av den mediala temporalloben strukturer

The present paper describes a comprehensive protocol for manual tracing of the set of brain regions comprising the medial temporal lobe (MTL): amygdala, ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Immunohistokemi och Multiple Märkning med antikroppar från samma värdart att studera Adult hippocampus Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Mätning Progressiv neurologiskt handikapp hos en musmodell av multipel skleros

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Generalized Psychophysiological Interaction (PPI) Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generalized Psychophysiological Interaction PPI Analysis of Memory Related Connectivity in Individuals at Genetic Risk for Alzheimer's Disease

Generaliserad vilken psykofysiologisk interaktion (PPI) analys av minne med anslutning i individer på genetiska risken för Alzheimers sjukdom

In neuroimaging, functional magnetic resonance imaging (fMRI) measures the blood-oxygenation-level dependent (BOLD) signal in the brain. The degree of ...

Functional MRI in Conjunction with a Novel MRI-compatible Hand-induced Robotic Device to Evaluate Rehabilitation of Individuals Recovering from Hand Grip Deficits

Funktionell MRI i samband med en roman MRI-kompatibel hand-inducerad Robotic enhet för att utvärdera rehabilitering av individer återhämta sig från hand grepp underskott

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is a non-invasive magnetic resonance imaging technique that images brain activation in vivo, using endogenous ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation av flera flexibla Polymerelektroder matriser

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Computer-based Multitaper Spectrogram Program for Electroencephalographic Data

Datorbaserat Multitaper-Spektrogramprogram för elektroencefalografiska data

Current web resources provide limited, user friendly tools to compute spectrograms for visualizing and quantifying electroencephalographic (EEG) data. ...